血管内皮生长因子在放射损伤小鼠骨髓基质细胞中的表达

目的 探讨辐射对小鼠骨髓基质细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及凋亡率变化。方法 采用RT—PCR和Western blot方法，初步检测了昆明小鼠经6．0Gy^60Coγ射线全身照射后小同时间骨髓基质细胞VEGF mRNA和蛋白表达水平的变化；并用流式细胞术检测相应时间的骨髓基质细胞凋亡率。结果 辐射损伤后，小鼠骨髓基质细胞VEGF表达在mRNA水平和蛋白水平均显著降低，骨髓基质细胞凋亡率显著升高；随时间延长，骨髓基质细胞VEGF表达有所恢复，凋亡率也逐渐降低，但14d时仍未恢复正常。结论 6．0Gy^60Coγ射线可抑制骨髓基质细胞VFGF表达，引起细胞凋亡。说明辐射所致骨髓微环境损伤与基质细胞中VEGF表达异常有关。     

人血管内皮生长因子B的重组腺病毒制备与鉴定

血管内皮生长因子Ｂ(ＶＥＧＦ Ｂ)是一种近年来发现的血管内皮生长因子家族的新成员 ,结构与ＶＥＧＦ较为相似 ,能竞争性地与ＶＥＧＦ的受体之一ＶＥＧＦＲ 1结合〔1〕。研究表明 ,尽管ＶＥＧＦ Ｂ广泛存在于多种组织 ,但以心肌和骨骼肌为主。在胎儿发育期及缺血缺氧条件下 ,ＶＥＧＦ Ｂ在心肌中的表达量显著升高〔2〕。笔者认为 ,ＶＥＧＦ Ｂ可能对心肌缺血区的血管再生起着积极的促进作用 ,而该方面的研究国内外均未见报道。本研究在获取人ＶＥＧＦ Ｂ( 186)基因的基础上构建成ＶＥＧＦ Ｂ腺病毒重组粘粒 ,为研究其在心肌缺血区基因转染后…     

人血管内皮生长因子-D的重组腺病毒制备与鉴定

生物旁路是近年来缺血性心脏病治疗研究的一个新热点。本研究旨在构建人血管内皮生长因子－Ｄ重组腺病毒,为基因转染研究所准备。用重组粘粒和ＤＮＡ－ＴＰＣ混合后,以磷酸钙共沉淀法转染２９３细胞,获取重组腺病毒。重组粘粒插入方向及重组腺病毒均经酶切鉴定为正确。所得重组腺病毒为Ｅ１缺陷,可用于体内基因治疗研究。     

腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达

目的　以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC) ,增强VSMC中gax基因的表达。方法　采用位置特异性重组方法构建携带大鼠 gax基因表达序列的复制缺陷型 5型腺病毒载体(AdCMV gax) ,经 2 93细胞扩增 ,纯化制备高滴度病毒转染液 ;以病毒转染液常规转染VSMC后 ,应用RT PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中 gaxmRNA和蛋白质的表达。 结果　流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示AdCMV gax转染VSMC后 ,VSMC的Gax蛋白表达率明显增高 ,转染后 2 4小时即可达 80 %左右 ,高水平的表达可维持 5天以上 ;AdCMV gax转染前 ,PDGF BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用 ,AdCMV gax转染后 ,无论有无PDGF BB刺激 ,VSMC中 gax基因的表达均比转染前显著增高。 结论　腺病毒载体可有效地介导 gax基因转染VSMC ,并且表达为蛋白质。这有利于进一步研究 gax基因对VSMC生物学行为的影响     

血管内皮生长因子基因转染自体骨髓血管内皮祖细胞治疗下肢缺血的实验研究

目的:利用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF165)基因转染体外诱导的血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),并移植到下肢缺血的高脂血日本大耳兔体内,观测其促进血管新生、改善肢体缺血的效果。方法:①制作高脂血兔,梯度离心法分离兔骨髓单个核细胞(MNCs),用内皮细胞专业培养基(EGM-2)诱导培养EPCs,并用双荧光染色法及免疫组化等方法进行鉴定。②脂质体介导携带EGFP标记的VEGF165质粒转染EPCs,用激光共聚焦显微镜检测VEGF蛋白的表达,用流式细胞仪检测转染率。③制作兔单侧下肢缺血模型,并将其随机分为A、B、C 3组,分别移植EPCs、VEGF165基因转染后的EPCs及EGM-2培养基,多种方法检测移植效果。结果:①诱导出的梭形细胞,经FITC-UEA-I和DiI-acLDL荧光双染证实为正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实其Flk-1和Ⅷ因子的表达。②激光共聚焦显微镜下见绿色荧光蛋白表达,证实VEGF165转染成功,经流式细胞仪检测得到转染率约22.5%。③DSA及免疫组化检查显示VEGF165基因转染后的EPCs移植后改善肢体缺血的效果优于其他2组。结论:VEGF基因转染EPCs后能改进EPCs质量,移植后促血管新生能力增强,其效果优于未转染组。     

血管内皮生长因子基因治疗对大鼠缺血皮瓣存活的影响

为了增加缺血组织的存活能力，许多能诱导新生血管形成的生长因子应用于缺血皮瓣的研究。其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是作用最强、特异性最高的因子，但VEGF蛋白质的半衰期在血浆中较短。为此，笔者探讨VEGF基因治疗对缺血皮瓣存活的影响。     

腺病毒介导的人HGF转染大鼠骨髓间充质干细胞及其作用研究

目的：评价携带HGF基因的腺病毒栽体转染鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的效率，以及转染HGF基因对MSC增殖与分化的影响。方法：采用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效果和转染率；采用ELISA方法检测转染后HGF的表达情况；细胞增殖分析采用MTT法；MSC向成骨细胞分化采用碱性磷酸酶染色法。结果：转染效率与病毒滴度(MOI)具有量效关系，随着MOI的增加，转染率明显增高，当MOI=400时，转染率可达99．99％。转染HGF后，MSC表达HGF明显增高，48h可达128ng/ml，随后逐渐下降并维持2周以上；转染HGF对MSC的增殖以及向成骨分化没有影响。结论：MSC是一种理想的基因载体细胞，可用于HGF的基因治疗。     

血管内皮细胞生长因子对体外大鼠椎间盘细胞代谢的影响

目的 观察血管内皮细胞生长因子(vasctdar endothelial cell growth factor,VEGF)对体外培养大鼠椎间盘细胞及基质代谢的影响. 方法 建立大鼠椎间盘细胞培养体系,体外单层培养大鼠椎间盘细胞,取生长良好的第2代细胞,使用抗- Fas抗体诱导凋亡,加入不同浓度(10,100,1 000μg/L)的VEGF,影响椎间盘细胞的凋亡及代谢过程.利用流式细胞仪PI标记法检测椎间盘细胞凋亡情况;利用氯胺-T法和DMB比色法分别检测细胞培养液中羟脯氨酸和蛋白多糖的含量. 结果 (1)加入不同浓度VEGF(10,100,1 000μg/L)后,椎间盘细胞凋亡率为(87.62±11.06)％、(53.30 ±9.23)％和(16.75±4.21)％,与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).(2)随着VEGF浓度的增加(10,100,1 000 μg/L),羟脯氨酸含量[(6.71±0.33) μg/L、(9.12±0.41) μg/L、(11.58±0.12)μg/L]、蛋白多糖含量[(23.21±2.87)μg/L、(32.45±5.23) μg/L、(37.18±3.22) μg/L]明显增加.加入不同浓度VEGF后,羟脯氨酸和蛋白多糖的含量与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).羟脯氨酸含量、蛋白多糖含量与VEGF浓度呈正相关( ra=0.972,P＜0.01;rb=0.907,P＜0.01).结论 VEGF可以抑制体外培养的椎间盘细胞凋亡,促进椎间盘细胞基质中胶原及蛋白多糖的合成.     

乙型肝炎肝组织血管内皮生长因子的表达变化

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）表达与乙型肝炎（HB）肝血管增生及肝纤维化的关系.方法从人肝组织提取VEGF总RNA,经RT-PCR扩增取得VEGF mRNA基因探针,对160例HB肝组织（HB组）及10例正常肝组织（对照组）的VEGF mRNA作了定位观察,同时对VEGF表达变化进行了检测.结果原位杂交显示,对照组VEGF mRNA阴性.HB组VEGF mRNA定位于肝窦、狄氏腔及扩张的肝窦周围肝细胞胞质;而VEGF则有胞质、膜窦、窦内皮3种形态,其表达强度、分布范围与HB分级分期、肝血管炎症、破坏、阻塞、增生及纤维化呈同步关系,不同肝病变之间差异显著（P＜0.01）.结论肝组织VEGF表达增强可促进肝血管生成及肝窦毛细血管化.     

血管内皮生长因子及其受体在大肠癌中的表达及其意义

目的　探讨血管内皮生长因子 (VEGF)及其受体 (FLT ,FLK 1)在大肠癌组织中的表达及其对肿瘤新生血管生成及转移的影响。方法　应用免疫组化技术 ,检测 75例人大肠癌组织VEGF ,FLT ,FLK 1的表达和微血管密度 (MVD) ,并分析其与病理分型分级、浸润深度、淋巴结、淋巴管和血管转移相关性。结果　VEGF ,FLT ,FLK 1主要表达于癌浸润边缘和坏死组织周围。FLT表达于癌细胞膜和 (或 )细胞质 ,而FLK 1则只表达于细胞质。VEGF ,FLK 1强阳性组 ( )MVD计数增多 (P均 <0 .0 5 ) ;淋巴结转移组VEGF ,FLT ,FLK 1强阳性表达例数增多 (P <0 .0 5 )。结论　大肠癌VEGF ,FLT及FLK 1表达增强在肿瘤血管生成和侵袭转移中有重要作用。     

EGFP标记的VEGF165重组质粒的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建pIRES2-EGFP-VEGF165真核表达质粒,并在大鼠骨髓间充质干细胞内表达。方法应用DNA重组方法构建pIRES2-EGFP-VEGF165,并将其转染到大鼠骨髓间充质干细胞内,采用ELISA和MTT法检测转染后细胞培养上清液中VHGF165的含量及生物活性。结果成功构建了pIRES2-EGFP-VHGF165,将其转染骨髓间充质干细胞后,VEGF蛋白表达水平明显增高．转染后的细胞培养上清具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论成功构建了真核表达质粒pIRES2-EGFP-VEGFl65．将其转染骨髓间充质干细胞后可高水平地表达具有生物学活性的VEGF蛋白。     

腺病毒介导CTLA4Ig及CTLA4双基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的制备CTLA4Ig及CTLA4双基因共表达腺病毒载体,检测重组腺病毒在骨髓间充质干细胞(BMMSCs)中的表达。方法构建大鼠CTLA4Ig融合基因,将CTLA4Ig及CTLA4基因经IRES2连接,通过同源重组获得重组腺病毒表达载体,并在293细胞中进行病毒包装和扩增。检测CTLA4Ig和CTLA4在BMMSCs中的共表达情况及其免疫抑制功能。结果通过同源重组获得携带CTLA4Ig-IRES2-CTLA4的重组腺病毒表达载体,PacⅠ酶切鉴定正确,与脂质体共转染293细胞获得重组腺病毒。用重组腺病毒感染的BMMSCs可同时表达CTLA4Ig及CTLA4,且此类细胞具有明显抑制淋巴细胞反应的功能。结论重组腺病毒感染的BMMSCs可同时表达分泌型CTLA4Ig和膜结合型CTLA4,通过阻断协同刺激通路方式进一步增强BMMSCs的免疫抑制功能。     

静脉移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤

目的 研究静脉移植骨髓间充质干细胞(bone martow stromal cells,BMSCs)对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响.方法 对10只同种异体SD大鼠的BMSCs进行体外分离、培养、扩增、纯化后用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)进行标记;重物打击致瘫痪造模法制成完全性截瘫的同种大鼠脊髓损伤动物模型,制模后7 d完全随机分为A、B、C三组:A组22只,作为BMSCs移植组,经鼠尾静脉注射2×106/ml的BMSCs细胞悬液1 ml;B组22只,作为对照组,注射1 ml培养液;C组22只,作为空白手术对照组.注射后2,3,6周,免疫组织化学检测BMSCs在损伤段脊髓的存活、分布、分化并计数,观察损伤段脊髓内生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)、神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF200)和巢蛋白的表达,注射后1,2,3,4,5,6周Basso-Beattie-Bresnaban(BBB)评分评估各组后肢运动功能.结果 移植后2,3,6周BrdU阳性的BMSCs主要分布于损伤段及邻近节段脊髓内.计数发现,移植后2周BrdU阳性的BMSCs约占移植细胞数的4.9%,3周占4.4%,6周占2.9%;移植后2周,BMSCs形态大多变为圆形或椭圆形,部分阳性标记的细胞长出神经元样突起,约12.6%表达胶质纤维酸性蛋白(glial fribrillary acidic protein,GAFP),约5.4%表达神经元特异性核蛋白(neuronal nuclear antigen,NeuN);移植后2,3,6周,A组GAP-43、NF200、巢蛋白的表达明显高于B、C组(P<0.05);移植后3周开始,A组的BBB评分在各观察时相点明显高于B、C组(P<0.05).结论 通过静脉注射的BMSCs能向脊髓损伤灶内迁徙、存活,表现出对损伤灶的趋化性,并向神经元和星形胶质细胞分化,上调GAP-43、NF200和巢蛋白的表达,改善神经功能,可用于脊髓损伤的细胞移植治疗.     

Notch信号在放射损伤小鼠骨髓基质细胞中的表达

目的探讨小鼠骨髓基质细胞放射损伤后Notch信号的表达。方法应用小鼠骨髓基质细胞体外放射损伤模型，采用RT-PCR检测了小鼠骨髓基质细胞Notch1、Jagged1、Hes1基因的表达。结果正常小鼠骨髓基质细胞中未见Notch1受体、Notch1配体Jagged1、Notch通路活化的下游基因Hes1mRNA的表达，给予^60Coγ射线照射后2h即可见上述基因的表达，照射后4h达高峰，8～12h恢复正常。各组间比较，差异有统计学意义（P〈0．001）。结论γ射线作用于小鼠骨髓基质细胞后有Notch通路的活化。Notch通路参与了小鼠骨髓基质细胞的放射损伤过程。     

人骨髓基质细胞体外扩增方法的研究

 目的 为提高人骨髓成纤维细胞集落(CFU-F)的产率,缩短培养时间.方法 在以往的人骨髓基质细胞体外扩增方法基础上进行了改进,每10ml培养体系中,含1×10<'7>个单个核细胞,以30%人AB血清代替小牛血清,增加了碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),再加入氢化可的松和适量的IMDM培养液,培养第9d观察结果.结果 在一定范围内人AB血清、bFGF均能促进CFU-F增殖,提高其产率,并缩短培养时间3～5 d.结论 可应用到人骨髓基质细胞体外扩增及传代中,对于研究CFU-F的性质及在造血疾病中的应用具有重要意义.     

骨髓基质细胞的体外培养与临床应用

目的　验证骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSCs)向成骨细胞转化的能力及其临床应用价值。方法　取健康成年大白兔股骨大转子红骨髓 ,在DMEM标准培养液中原代培养骨髓基质细胞 ,传代细胞分别用DMEM标准培养液和加入地塞米松、β 甘油磷酸钠、L 抗坏血酸的条件培养液培养 ,倒置显微镜观察不同培养条件下细胞的形态学特征 ,进行酶学测定 ,计数传代细胞中成骨样细胞转化率 ,免疫组化法检测Ι型胶原表达。同样方法培养人BMSCs,与同种异体骨基质明胶充分混合 ,应用于临床修复创伤所致的骨缺损、骨不连或骨折延迟愈合。结果　体外培养条件下 ,原代细胞呈长梭形 ,具有成纤维细胞的生长特性 ,条件培养的传代BMSCs变为三角形或锥形 ,呈多层生长 ,无接触抑制现象 ,具有与成骨细胞相似的形态和生长特点。ALP染色阳性率可达 85 %以上 ,Ι型胶原免疫组化染色呈强阳性 ,具有与成骨细胞类似的功能性表现。临床应用 4 2例病人 ,随访 8～ 2 6个月 ,取得了满意疗效。结论　BMSCs能够向成骨细胞分化和增殖 ,是骨组织工程学种子细胞的理想来源 ,并有广阔的临床应用前景     

阿伦膦酸钠对去势大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响

目的 探讨阿伦膦酸钠(Alendronate,Aln)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化的影响,并阐明丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在该过程中的作用. 方法 BMSCs取自9个月龄去势SD大鼠,分别暴露于0.01,0.1,1,10 μmol/L Aln.成脂诱导2周后进行油红O染色和镜下计数分析,RT-PCR检测过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(PPARγ2)表达;使用MAPK通路特异性抑制剂并诱导2周后再观察PPARγ2表达情况,Western blot观察Aln对MAPK通路表达的影响. 结果 BMSCs成脂诱导2周后,油红O染色阳性细胞数随着药物浓度的增高而显著减少(P<0.01).PPARγ2表达随着药物浓度的增高而显著降低.分别使用ERK1/2、JNK抑制剂PD98059和SP600125并诱导2周后,PPARγ2表达上调;使用p38抑制剂SB203580并诱导2周后,PPARγ2表达下调.Western blot结果显示,Aln在5,15,30 min时上调P-ERK1/2和P-JNK的表达,分别使用抑制剂后,表达下调. 结论 Aln通过激活ERK1/2和JNK信号通路,而不是p38,发挥抑制去势大鼠来源的BMSCs成脂分化作用,其效应具有浓度依赖性.     

Nicotine-induced chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in vitro

Purpose

Nicotine has been reported that it has a dose-dependent effect on matrix mineralization by human bone marrow cells. However, there is no relevant research concerning on chondrogenic differentiation potential of bone marrow stromal stem cells (BMSCs) treated with nicotine in vitro. The aims of the study were to examine the effects of nicotine (0, 10^?7, 10^?6 and 10^?5 M) on the proliferation and chondrogenic differentiation of BMSCs from three healthy donors in vitro.

Methods

BMSCs proliferation was analyzed by CCK8 assay and real-time polymerase chain reaction was used to assay the expression of type II collagen, aggrecan, type I collagen and type X collagen. The proteoglycan content was stained by Alcian blue, and the sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content of BMSCs was quantified spectrofluorometrically using dimethylmethylene blue.

Results

The cell viability was not significantly impaired until up to a concentration of 10^?5 M nicotine. Nicotine promoted the proliferation and enhanced the expression of type II collagen at the level up to 10^?6 M (P < 0.05). The expression of aggrecan was reduced at the concentration of 10^?5 M nicotine at day 14 (P < 0.05), and there was no significant difference in aggrecan gene expression at 10^?7 and 10^?6 M nicotine levels compared to control group (n.s.). Also the fibroblastic and hypertrophic gene expressions were down-regulated in the chondrogenic medium with 10^?7–10^?5 M nicotine (P < 0.05).

Conclusion

It was implied that local application of nicotine at an appropriate concentration may be a promising approach for enhancing chondrogenic differentiation capacity of BMSCs in cell-based cartilage tissue engineering. Also these results indicate that nicotine maybe a potentially useful drug for the treatment of Osteoarthritis.     

放射损伤小鼠骨髓组织中bFGF、VEGF的表达

目的　探讨放射损伤对小鼠骨髓组织中bFGF、VEGF表达的影响。方法　采用免疫组织化学SABC法 ,检测昆明小鼠经 6 0Gy6 0 Coγ射线一次性全身均匀照射后不同时间骨髓组织中bFGF、VEGF表达水平的变化。结果　放射损伤后 ,小鼠骨髓组织中bFGF、VEGF表达水平显著低于正常组 (P <0 0 1) ,随时间延长 ,骨髓组织中bFGF、VEGF表达有所恢复 ,但 14d时仍未恢复正常 ;骨髓组织中bFGF表达与VEGF表达呈正相关 (r=0 82 4 ,P <0 0 1)。结论　辐射所致骨髓微环境损伤与骨髓组织中bFGF、VEGF表达异常有关