缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞蛋白质组表达变化的初步研究

目的:采用将人肾小管上皮细胞置于缺氧环境中然后复氧的方法模拟缺血再灌注(ischemia reper-fusion,IR)所致肾损伤的发生和发展过程,研究IR对人肾小管上皮细胞表达蛋白质组的影响。方法:人肾小管上皮细胞株(HK-2细胞)常规培养,随机分为2组,IR组缺氧培养8h,然后复氧培养24h,对照组常规培养,裂解细胞,提取全细胞蛋白。双向电泳(2-DE)分离,ImageMaster2D Platinum V5.0软件进行差异表达蛋白质组分析,基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定蛋白质。结果:通过对2-DE图谱蛋白斑点的匹配及对比分析,与HK-2缺氧复氧诱导的差异表达蛋白斑点为109个;经质谱鉴定的7个差异表达的蛋白斑点包括:核糖体蛋白S2、普通转录因子ⅡH亚基1变体、双链断裂修复蛋白rad-21同源物、富含亮氨酸重复序列蛋白-45、DNA依赖性蛋白激酶、丝/苏氨酸蛋白激酶Chk1和程序性细胞死亡蛋白-4。结论:IR组与对照组的表达蛋白质组相比较存在明显差异;7个与HK-2缺氧复氧诱导表达改变的蛋白质的功能涉及细胞增殖、细胞凋亡、细胞信号转导、抗细胞损伤等,提示IR的发生发展与相应的病理生理过程相关。     

镁对血管内皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用

目的探讨镁离子对人脐静脉血管内皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用及其可能机制。方法取人脐静脉分离内皮细胞培养传代 ,至第三代分为对照组、缺氧复氧组和硫酸镁组。用缺氧再复氧诱导血管内皮细胞损伤。镁离子组浓度分别为 (2、4、8、11、16mmol/L)。对照组常规培养 ,硫酸镁组加入不同浓度的镁离子预处理后缺氧再复氧。分别测定细胞培养液中一氧化氮 (NO) ,丙二醛 (MDA)及内皮素(ET-1)的含量。结果缺氧复氧组NO含量较对照组明显降低 (x缺氧 ±svsx对照 ±s,P<0.01) ,MDA与ET -1含量显著上升 (x缺氧 ±svsx对照 ±s,P<0.01) ,硫酸镁组NO含量较缺氧复氧组明显升高(x硫酸镁±svsx缺氧 ±s,P<0.05) ,MDA和ET -1含量显著降低 (x硫酸镁±svsx缺氧±s,P<0.05) ,且一定范围内呈剂量依赖关系。结论缺氧再复氧能造成VECs损伤 ,镁离子能保护缺氧再复氧造成的VECs损伤 ,其机制可能与抗脂质过氧化、稳定细胞膜及促进自由基清除有关。     

牛磺酸对离体大鼠脊髓缺氧／复氧损伤的保护作用

本文在孵育的离体大鼠脊髓组织切片上，观察牛磺酸对缺氧／复氧损伤的影响，缺氧／复氧损伤引起大鼠脊髓组织ＡＴＰ含量减少和ＬＤＨ漏出增多，ＮＯ生成和ＮＯＳ活性明显增加，Ｌ－精氨酸转运Ｖｍａｘ增加９７％（Ｐ〈０．０１），Ｋｍ值无明显变化，用１０和２０ｍｍｏｌ／Ｌ牛磺酸卵育与单纯缺氧／臭氧组比较，显著减轻了缺氧／复氧引起的组织ＡＴＰ减少和ＬＤＨ漏出，ＮＯ生成分别低３４％（Ｐ〈０．０１）和４０％（Ｐ〈０．０１     

谷氨酰胺对缺氧复氧损伤人小肠上皮细胞谷胱甘肽的影响

目的：探讨谷氨酰胺（ＧＬＮ）对缺氧复氧损伤人小肠上皮细胞（ＩＥＣ）内还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）和丙二醛（ＭＤＡ）的影响。方法：采用原代培养人ＩＥＣ作为实验模型,用荧光法测定体外培养ＩＥＣ内ＧＳＨ和ＭＤＡ含量。结果：正常对照组ＧＳＨ含量最高,在对照组加入ＧＬＮ并不影响ＧＳＨ含量（Ｐ〉０．０５）。缺氧６０ｍｉｎ或９０ｍｉｎ复氧３０ｍｉｎ损伤ＩＥＣ细胞内ＧＳＨ含量均显著低于正常对照组（Ｐ〈０．０５）,预先     

参附注射液对缺氧复氧损伤心肌的保护作用及机制研究

随着心肌缺血治疗过程中多种血管再通技术的广泛应用。由此引起的心肌再灌注损伤(myocardial reperfusion injury；MRI)问题亦日趋突出。因而探索心肌缺血再灌注损伤的机制和防治措施，已成为当今医学研究的热点之一。     

麦冬总皂甙对培养心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用

目的:观察麦冬总皂甙(Ophiopogan Total Saponies,OTS)对培养心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用。方法:以培养的心肌细胞为模型,在缺氧再给氧损伤细胞后,观察心肌细胞活力及搏动频率的变化,测定培养液上清乳酸脱氢酶的含量。结果:OTS 10 μg/L和40 μg/L可以提高损伤后心肌细胞的活力,提高心肌细胞的搏动频率,并使培养液上清乳酸脱氢酶的含量明显降低。结论:OTS对缺氧再给氧损伤的心肌细胞具有保护作用。     

TNF-α含量的改变与肾小管细胞缺氧-复氧性损伤关系的研究

目的:探讨TNF-α含量的改变与肾小管上皮细胞株(HK-2)缺氧-复氧性损伤的关系。方法:以HK-2细胞株作为研究材料,采用液体石蜡覆盖法建立缺氧损伤模型,分别在缺氧4、12、24h和复氧4、12、24h,采用放射免疫分析法(RIA)、生化法和台盼蓝拒染法,检测培养液中TNF-α的含量、乳酸脱氢酶(LDH)的活性、细胞计数及活细胞率的改变。结果:缺氧后4h,TNF-α的含量、LDH的活性开始升高,细胞总数及活细胞计数开始下降,并于缺氧后24h达高峰。TNF-α含量的改变与LDH活性的升高呈显著的正相关(r=0.89,P<0.05),与活细胞计数的下降呈显著的负相关(r=-0.91,P<0.05)。结论:肾小管缺氧-复氧后,TNF-α的产生增多,并参与了肾小管细胞损伤的过程。     

葛根素预处理上调内皮型一氧化氮合酶的表达减轻人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤

 目的:探讨葛根素(puerarin,PUE)预处理对缺氧/复氧(hypoxia reoxygenation,H/R)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的保护作用。方法:HUVECs随机分为正常对照(control)组、H/R组、单纯PUE组和PUE+H/R组(1.0×10^-3 mol/L PUE预处理24 h后进行H/R)。采用Western blot方法检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白的表达,化学比色法检测组成型一氧化氮合酶(cNOS)的活性,TUNEL法检测细胞凋亡。此外,在PUE预处理前使用ERK蛋白激酶抑制剂U0126(1.0×10^-5 mol/L)或PI3K/Akt蛋白激酶抑制剂LY294002(5.0×10^-5mol/L)处理细胞1 h,再进行H/R。结果:与control组相比,H/R组的eNOS蛋白表达水平降低(P<0.05),PUE预处理上调eNOS蛋白的表达水平(P<0.05),该上调作用均可被U0126及LY294002抑制(P<0.05);与control组相比,H/R组的cNOS活力下降(P<0.05),PUE预处理组的cNOS活力增加(P<0.05);与control组相比,H/R组细胞凋亡指数显著增大(P<0.01),PUE预处理组的细胞凋亡指数减小(P<0.01)。结论:H/R可使HUVECs受损伤,eNOS蛋白表达及活性降低,细胞凋亡增加。PUE预处理可通过ERK1/2信号通路和PI3K/Akt信号通路上调HUVECs的eNOS蛋白表达,增强eNOS活性,减少细胞凋亡,发挥内皮细胞保护作用。     

黄芪注射液对内皮细胞缺氧复氧损伤的保护作用

目的探讨黄芪注射液对内皮细胞缺氧复氧损伤的保护作用及其机制.方法人脐静脉内皮细胞(HUVECs)原代培养,传至3代后,分为三组:对照组常规培养;缺氧复氧组先缺氧处理1 h,再复氧1 k药物干预组在培养液中加入不同浓度的黄芪注射液,12 h后进行缺氧复氧处理.各组均测定细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和内皮素(ET)含量.结果①缺氧复氧组与对照组比较,细胞上清液中SOD活性降低(P<0.01)、MDA含量升高(P<0.01),NO含量降低(P<0.01)、ET含量升高(P<0.01).②黄芪注射液组与缺氧复氧组比较,细胞上清液中SOD活性升高(P<0.05或P<0.01)、MDA含量降低(P<0.05或P＜0.01),在浓度5～40tg/ml范围内该效应与黄芪注射液星剂量依赖效应,但当浓度大于40μg/ml时,该效应无明显改变(P>0.05);NO含量升高(P<0.01)、ET含量降低(P<0.05或P<0.01),直线相关分析显示:随着黄芪注射液预处理浓度增加,培养液中NO的生成量升高(r1=0.93,P<0.05),ET含量降低(r2=-0.97,P<0.05).结论缺氧复氧过程造成内皮细胞脂质过氧化损伤,引起内皮功能紊乱.黄芪注射液可能通过抗脂质过氧化,加强对氧自由基的清除,对缺氧复氧内皮细胞产生保护作用.     

缺氧预处理对培养的人血管平滑肌细胞缺氧复氧损伤的影响

缺氧预处理对培养的人血管平滑肌细胞缺氧复氧损伤的影响刘秀华，费宇行，石湘芸，庞永政，苏静怡，唐朝枢（北京医科大学心血管基础研究所，北京１０００８３）尽管临床上如何判定预处理心脏保护的指标尚有争议，但Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ在分离的人心室肌细胞缺氧复氧（ｈ...     

福辛普利抑制LPS诱导的人肾小管上皮HK-2细胞TAK1表达

目的 探讨福辛普利(FOS)对脂多糖(LPS)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)增殖及对转化生长因子β激活激酶(TAK1)表达的影响.方法 体外培养正常HK-2细胞,分为3组:对照组(Ctrl)、LPS诱导组(10μg/L)、FOS干预组(LPS 10 μg/L+FOS 1×106 mol/L).细胞培养12、24和48 h,以甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖情况,酶联免疫吸附(ELISA)法观察细胞上清纤维黏连蛋白(FN)变化,Western blot法检测TAK1、FN蛋白表达,实时荧光定量PCR检测TAK1 mRNA的含量.结果 LPS诱导组较对照组细胞的增殖水平(在48 h分别为0.462±0.013及0.363±0.014)、胞质中FN的含量均显著增高,且自12 h开始TAK1蛋白(在48 h分别为1.627±0.101及0.547±0.010)及mRNA表达水平上调(P＜0.01,P＜0.05),FOS干预组细胞增殖(在48 h为0.396 ±0.011)、FN的含量及TAK1的表达(在48 h蛋白表达为1.308±0.097)较同时间点LPS组(在48 h蛋白表达为1.627 ±0.101)显著下调(P＜0.01).结论 FOS可能通过抑制HK-2的增生与活化,减轻细胞外基质FN的沉积,起到延缓肾间质纤维化的作用.     

Human renal tubular epithelial cells suppress alloreactive T cell proliferation

Renal tubular epithelial cells (TECs) are one of the main targets of alloreactive T cells during acute rejection. We hypothesize that TECs modulate the outcome of alloimmunity by executing immunosuppressive effects in order to dampen the local inflammation. We studied whether TECs possess immunosuppressive capacities and if indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) might play a role in suppressing T cell alloreactivity. Next, we studied the role of programmed death ligand 1 (PD-L1) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1 with regard to TEC-related immunomodulatory effects. CD3/CD28 and alloactivated peripheral blood mononuclear cells were co-cultured with activated TECs. We analysed CD4⁺ and CD8⁺ T cell proliferation and apoptosis in the absence or presence of IDO inhibitor 1-methyl-L-tryptophan (1-L-MT), anti-PD-L1 and anti-ICAM-1. Further, we examined whether inhibition of T cell proliferation was cell–cell contact-dependent. We found that TECs dose-dependently inhibited CD4⁺ and CD8⁺ T cell proliferation (P < 0·05). Activated TECs showed significantly increased IDO activity and up-regulated PD-L1 and ICAM-1 expression. Suppressed CD4⁺ and CD8⁺ T cell proliferation was only partially restored or failed to restore using 1-L-MT. Activated TECs increased early and late apoptosis of proliferating CD4⁺ and CD8⁺ T cells; only CD4⁺ T cell apoptosis was statistically affected by 1-L-MT. Transwell experiments revealed that TEC-mediated immunosuppression is cell–cell contact-dependent. We found that anti-ICAM-1 affected only CD4⁺ T cell apoptosis and not T cell proliferation. Our data show that TECs suppress both CD4⁺ and CD8⁺ T cell proliferation contact dependently. Interestingly, inhibition of proliferation and enhancement of apoptosis of T cell subsets is differentially regulated by indoleamine 2,3-dioxygenase and ICAM-1, with no evidence for the involvement of PD-L1 in our system.     

脂多糖对人近端肾小管上皮细胞IL-18及其受体复合物表达的影响

观察脂多糖(LPS)对体外培养人近端肾小管上皮细胞IL-18及其受体表达的影响,以初步探讨IL-18在肾小管-间质炎症损伤过程中的作用。以不同浓度LPS(0.01、0.1、1、5、10μg/ml)处理人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)24 h、36 h及48 h,然后应用RT-PCR及ELISA测定IL-18及其受体α链(IL-18Rα)和β链(IL-18Rβ)mRNA及蛋白的表达水平变化。静息培养的HK-2细胞表达IL-18 m RNA和蛋白、IL-18Rα和IL-18Rβm RNA,LPS促进HK-2细胞IL-18 mRNA和蛋白的表达及IL-18Rα和IL-18RβmRNA的表达,并呈剂量和时间依赖趋势。肾小管上皮细胞可能既是IL-18的产生者,又是IL-18的靶细胞之一,炎症状态下肾小管上皮细胞通过IL-18自分泌方式参与肾小管-间质的炎症损伤过程。     

STAT蛋白在抑瘤素M诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用

目的探讨STAT蛋白在抑瘤素M(oncostatin M,OSM)诱导的肾小管上皮细胞表型转化及分泌功能中的作用。方法体外培养人肾近曲小管上皮细胞,分为对照组(C组)、OSM(20 ng/ml)组(OSM组)、OSM+雷帕霉素(100 ng/ml)组(OSM+R组)和OSM+氟达拉滨(100 ng/ml)组(OSM+F组)。培养72 h后收集细胞及上清液,透射电镜观察细胞超微结构改变;免疫细胞化学和Western blot法检测CK18、α-SMA蛋白表达;采用Western blot法检测信号转导及转录激活因子(STAT1、STAT3、pSTAT1、p-STAT3)的表达;酶联免疫吸附实验测定细胞上清液中Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的分泌。结果与对照组相比,细胞经OSM刺激后CK18的表达下调,而α-SMA的表达上调并分泌过多的细胞外基质蛋白ColⅠ和FN;此外,OSM还可磷酸化激活STAT1和STAT3。OSM的上述作用可被雷帕霉素和氟达拉滨所阻断。结论 OSM具有促纤维化特性,而STAT1和STAT3信号活化在OSM介导的纤维化进程中发挥同等重要的作用。     

转化生长因子β1抑制人肾小管上皮细胞的增殖

背景：慢性肾衰竭进展过程中的一个重要病理改变是炎症和纤维化,主要包括肾小球和肾小管的炎症和纤维化。目前大多数研究主要集中于肾小球,对于肾小管病变的研究相对较少。但实际上部分疾病的肾小管病变出现在肾小球病变之前,其对于疾病预后更具有指导意义。 目的：观察转化生长因子β1对人类肾小管上皮细胞HK-2增殖的影响,探索转化生长因子β1在肾小管炎症和纤维化方面的作用。 方法：将传代培养的HK-2细胞分成空白对照组和转化生长因子β1作用组,分别使用DMEM/F12培养液,以及含转化生长因子β1(2,5,10 μg/L)的DMEM/F12培养液培养,在倒置显微镜下观察各组细胞形态的改变,并使用MTT法检测细胞增殖情况。 结果与结论：转化生长因子β1能显著抑制人肾小管上皮细胞的增殖,并促使细胞向纤维样改变,与空白对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05),其抑制增殖作用并不随转化生长因子β1质量浓度的增大而显著增强,作用时间可持续至72 h。结果可见转化生长因子β1能够抑制人肾小管上皮细胞的增殖,并具有促进肾间质纤维化的作用。     

淫羊藿苷通过AMPK减轻脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞线粒体损伤

目的:探讨淫羊藿苷(icariin,ICA)对脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞线粒体损伤的作用及其可能机制.方法:利用ICA干预棕榈酸(palmitic acid,PA)培养的大鼠肾小管上皮NRK52E细胞,实验分组为对照组、PA组、PA+ICA组及AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase...     

尿毒血清对人类肾小管上皮细胞增殖及转分化的影响

目的: 探讨尿毒血清对人近端肾小管上皮细胞株( HK-2)增殖及转分化的影响,以期阐明尿毒症毒素在人肾小管－间质纤维化中的作用。方法: 采用MTT比色法检测尿毒血清对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测尿毒血清对细胞周期、细胞增殖指数(PI)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性细胞百分率的影响。结果: MTT法示5％-20％浓度尿毒血清组A₄₉₀值均高于正常对照组,流式细胞检测示10％-20％浓度尿毒血清组G₁期细胞均低于正常对照组,PI指数均高于正常对照组,但不同浓度尿毒血清组组间无明显差异;各浓度尿毒血清组α-SMA阳性细胞百分率均高于正常对照组,且随着尿毒血清浓度的增高而增高。结论: 慢性肾衰竭患者体内蓄积的尿毒症毒素可能通过促进肾小管上皮细胞增殖及转分化从而加速肾小管－间质纤维化进程,导致肾功能进行性恶化。     

Polarized M2c macrophages have a promoting effect on the epithelial-to-mesenchymal transition of human renal tubular epithelial cells

This study planned to explore the effects of M2c macrophages on epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of human renal proximal tubular epithelial cells (HK-2). Human monocytic leukaemia cells were induced by TPA and IL-10 to differentiate M2c macrophages. Subsequently HK-2 cells were co-cultured with the M2c macrophages in Transwell chamber. After 48?h of co-culturing the HK-2 cells were detected in the mRNA and protein expression of E-cadherin, α-SMA and vimentin with RT-PCR, immunofluorescence and Western blot respectively. Besides, the migration ability of the HK-2 cells was estimated with Transwell migration assay. ANOVA was used to compare the difference between groups and Student's t-test to conduct multiple comparisons of two groups. P?<?0.05 was considered statistically significant. The results showed that the mRNA and protein expression of α-SMA and vimentin of the HK-2 cells were increased but the E-cadherin decreased significantly after 48?h co-culturing with the M2c macrophages (P?<?0.05 or P?<?0.01). And the migration ability of HK-2 cells were also increased significantly (P?<?0.05). It may be concluded that polarized M2c macrophages may have a promoting effect on the EMT of HK-2 cells.     

人肾小管上皮细胞necroptosis模型的构建

 目的：以体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）为靶细胞,构建肾小管上皮细胞凋亡样坏死（necroptosis）的模型。方法：采用肿瘤坏死因子 α (tumor nercosis factor α, TNF-α)诱导细胞凋亡,同时采用抗霉素A (antimycin A)耗竭ATP,构建肾小管上皮细胞凋亡的模型,并以caspase-8抑制剂苄氧羰酰-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-氟甲基酮(benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone, zVAD-fmk) 阻断凋亡,用necroptosis的特异性抑制剂necrostatin-1（Nec-1）阻断necroptosis,观察细胞在不同的处理下形态学的变化,同时检测细胞存活率及标志物微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ）的表达。结果：（1）在TNF-α+zVAD- fmk+antimycin A处理1 h时细胞及细胞器膨胀,电镜下细胞膜碎裂,线粒体变圆、肿胀,嵴逐渐模糊,胞浆中出现大量自噬小体,而Nec-1预处理后细胞的坏死程度较对照组明显改善。（2）在TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A 1 h实验组,Nec-1预处理后细胞的存活率显著增加（P<0.05）。（3）TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A干预1 h实验组在Nec-1预处理后LC3-Ⅱ的表达量明显下降（P<0.05）。结论：凋亡环境中阻断凋亡可以诱导肾小管上皮细胞necroptosis,抑制剂Nec-1能特异性阻断肾小管上皮细胞发生坏死。