乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白抗α-干扰素功能区域分析

目的 确定乙型肝炎病毒（HBV）DNA聚合酶末端蛋白（terminal protein，TP）抗α-干扰素（IFN-α）的功能区域。方法 PCR扩增IFN-α诱导人类6-16基因启动子并克隆入pCAT-Basic中，构建IFN—α反应报告载体p6-16CAT。以FuGENE6转染该报告载体至Huh7细胞并给予不同浓度IFN-α2a刺激，ELISA法检测细胞内氯霉素乙酰基转移酶（CAT）的表达，建立Huh7细胞对IFN-α反应强弱的定量判定标准。构建TP（包括Spacer区）基因缺失突变体重组真核表达载体，通过融合表达的多肽表位抗体，Westernblot法检测目的蛋白在Huh7细胞中的表达。重组表达载体分别与报告载体p6-16CAT共转染Huh7细胞，转染后48h给予终浓度为100IU／ml的IFN-α2a刺激，作用24h后裂解细胞，通过检测胞内CAT含量高低评价各缺失突变体抗IFN-α作用，并据此确定TP（包括Spacer区）抗IFN-α作用的功能区域。结果 获得6-16基因启动子并构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT。转染p6-16CAT的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下CAT表达显著增强，且在IFN-α2a终浓度为100IU／ml时达到最大。Westem blot显示，IP（包括Spacer区）各基因缺失突变体在Huh7细胞中表达相应蛋白。共转染p6-16CAT及部分／全长1P的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下，胞内CAT值和对照组相比无显著差别，相反，全长TP＋部分／全长Spacer使细胞内CAT值显著下降。结论 DNA聚合酶Spacer区与HBV抗IFN-α作用密切相关。     

酵母双杂交筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的 筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白.方法 PCR扩增单剪接型2.2 kb HBV剪接特异性新基因TPss并克隆于诱饵载体pGBKT7,在证实TPss蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与TPss蛋白相互作用的肝细胞蛋白,进而通过哺乳动物细胞双杂交实验验证候选肝细胞蛋白与TPss蛋白在Huh7和HepG2肝细胞中的相互作用.结果 构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-TPss,Western blot显示其在酵母中表达TPss蛋白.酵母双杂交筛选及哺乳动物细胞双杂交证实TPss蛋白可与4种肝细胞蛋白相互作用,即组织蛋白酶B、微粒体环氧化物水解酶、组织蛋白酶D与纤维蛋白原γ链.结论 TPss可与多种肝细胞蛋白相互作用.     

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响

目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因最小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响.     

双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体编码蛋白的反式激活作用

目的 研究双剪接型2．2kb乙型肝炎病毒（HBV）剪接变异体编码的新蛋白的功能。方法 PCR扩增双剪接型2．2kb HBV剪接特异性新基因并克隆于哺乳动物细胞表达载体peDNA3．1／HisC。以FuGENE6将此重组载体（peDNA3．1／HisC-TPds）转染Huh7细胞，采用融合表达的多肽表位（X-press表位）抗体，通过Western blot检测目的蛋白在不同时间段的表达。peDNA3．1／HisC-TPds分别与β-半乳糖苷酶报告载体pSV-β-galactosidase（含SV40启动子／增强子）或pCMVβ（含CMV即刻早期启动子）共转染Huh7细胞，转染后48h裂解细胞并检测胞内β-半乳糖苷酶活性，实验数据以SPSS11．5软件分析。结果 克隆420bp双剪接型2．2kb HBV剪接变异体新基因，Western blot显示其在Huh7细胞中表达相应蛋白，以转染后48h为最高。在含有CMV即刻早期启动子或SV40启动子/增强子的报告载体与peDNA3．1／HisC-TPds质量比为1：10～1：50范围内，共转染有报告载体及pcDNA3．1／HisC-TPds的Huh7细胞内β-半乳糖苷酶活性均大于相应的peDNA3．1／HisC空白载体对照组，且在1：10～1：40范围内存在剂量．效应关系。结论 双剪接型2．2kbHBV剪接变异体编码的新蛋白可反式激活CMV即刻早期启动子及SV40启动子／增强子，提示其可能与HBV致病有关。     

中草药抗乙型肝炎病毒活性及其作用机理体外实验研究

用２．２．１５细胞株体外抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）药物实验模型，对４种中草药制剂体外抗ＨＢＶ活性及其机理进行了评价，结果表明；４种中草药对细胞的５０％毒性浓度（ＣＤ５０）分别为乾坤宁〉６４０ｍｇ／Ｌ，双黄连针剂〉６４０ｍｇ／Ｌ，复方仙茅浸膏水提取液１６０ｇ／Ｌ（生药计算），复方黄芪浸膏水提取液３２０ｇ／Ｌ（生药计算）。对病毒复制指标ＨＢｓＡｇ，ＨＢｅＡｇ和细胞内ＨＢＶＤＮＡ的５０％抑制浓度（ＩＤ５０     

剪接导致截短的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白可诱导肝细胞空泡化

目的　研究 4 5 8～ 130 8nt乙型肝炎病毒 (HBV)基因组剪接变异体截短的表面抗原大蛋白 (largesurfaceantigen ,LS)的肝细胞致病性。方法　将 4 5 8～ 130 8nt剪接变异体HBVDNA(基因号为AY2 38972 ,长度为 2 36 6bp)及全长HBVDNA(基因号AY2 0 6 390 ,长度 32 15bp)中PreS2及S起始密码由ATG定点突变为ACG。以突变后的剪接变异体DNA为模板 ,PCR扩增剪接产生的截短LS编码基因(LS splice)及LS氨基端 2 76个氨基酸的编码基因 (LS2 76) ;以突变后的全长HBVDNA为模板 ,PCR扩增全长LS编码基因。将上述DNA片段克隆至pCDNA3.1/Hyg( )真核表达载体。重组载体以脂质体转染HepG2及Chang肝细胞 ,以HE染色观察细胞的空泡病变 ,并以流式细胞仪检测转染细胞的凋亡率。结果　表达LS、LS splice、LS2 76的重组载体转染后均可引起HepG2及Chang肝细胞发生空泡样病变。此外 ,LS可引起HepG2及Chang肝细胞凋亡 ,而LS2 76、LS splice致肝细胞凋亡作用消失。结论　 4 5 8～130 8ntHBV基因组剪接变异体产生的截短LS可致肝细胞病变 ,其作用与其氨基端 2 76个氨基酸有关。该类型HBV基因组剪接变异体在乙型肝炎发生发展中可能具有一定作用     

α-干扰素和苦参素可以减轻慢性乙型肝炎患者血清肝纤维化的程度

目的了解α-干扰素(IFN-α)、苦参素对慢性乙型肝炎患者血清肝纤维化指标的影响。方法84例患者随机分为干扰素、苦参素和联合治疗组,采用放射免疫法测定治疗前后血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)的变化。结果3组患者治疗后血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C水平较治疗前显著降低(P<0.05),联合治疗组降低幅度较干扰素组及苦参素组大(P<0.05)。治疗结束后血清乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)及乙型肝炎病毒DNA转阴情况3组间无明显差异。抗病毒治疗有效组与无效组治疗前血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C水平无显著差异,治疗后均明显降低(P<0.05),但有效组较无效组降低更加明显(P<0.01)。结论IFN-α与苦参素联合应用抗病毒效果与单一用药效果无差别,但有助于减轻慢性乙型肝炎纤维化程度,提高抗纤维化的效果。     

RNA干扰抗乙型肝炎病毒的现状和应用前景

RNA干扰(RNA interference,RNA i)是指细胞利用外源性或者内源性的双链小干扰RNA(sm all interfer-ing RNA,siRNA)激发相关的酶复合物对同源性mRNA进行切割、降解,从而在转录后水平阻断基因的表达,达到同源基因的减效表达或不表达。国内外细胞实验和动物实验均表明,在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)治疗中,RNA i由于具备特异、高效、无明显副作用等许多特点,较目前常用的干扰素和核苷类药物具有许多优势,在抗HBV治疗研究中展示了良好的应用前景。     

聚乙二醇干扰素α-2a与干扰素α-2b治疗慢性丙型肝炎疗效分析

丙型肝炎病毒(HCV)感染可导致肝脏炎症坏死和纤维化,抗病毒治疗是丙型肝炎治疗的根本疗法。我们对慢性丙型肝炎(CHC)患者分别采用聚乙二醇干扰素α-2a(PEG-IFNα-2a)和干扰素α-2b(IFNα-2b)治疗,并对两种干扰素的临床疗效进行对比分析。1资料与方法1.1病例选择43例CHC患者为20     

聚乙二醇干扰素α-2a治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎的疗效和安全性

目的 探讨聚乙二醇α-2a干扰素（PEG INFα-2a）治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎的疗效和安全性。方法 按随机对照原则选择80例HBV DNA、HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者，按1：1随机分配进入PEG INFa-2a组和IFNα-2a组。结果 治疗6个月时，PEG INFα-2a组HBeAg血清转换率（45．7％）高于IFNα-2a组（35．1％），但P〉0．05。停药6个月后，持续的HBeAg血清转换率分别为48．6％和37．8％，P〉0．05。停药6个月后，持续的HBVDNA阴转率分别为62．9％和45．9％，P〉0．05。治疗后，两组的丙氨酸转氨酶（ALT）复常率差异无显著性，为62．9％和45．9％，停药后6个月，两组的联合应答率分别为57．1％和40．5％。PEG INFα-2a组有3例患者HBsAg阴转，而IFNα-2a组仅有1例患者HBsAg阴转。两组有相似的不良反应，不良反应间差异无统计学意义，两组治疗过程中均未发生重要的不良事件。结论PEG INFα-2a治疗HBeAg阳性的慢性乙型肝炎疗效优于普通干扰素IFN-2a，耐受性和安全性好。     

聚乙二醇干扰素α-2a治疗慢性乙肝25例分析

聚乙二醇α-2a干扰素作为抗病毒的主要药物之一,具有清除和抑制乙型肝炎病毒(HBV)、减轻肝脏炎症、阻止肝纤维化的发生与发展、预防肝细胞癌的发生,我科于2004年8月至2006年2月使用聚乙二醇干扰素α-2a治疗CHB25例,观察其疗效及不良反应,现报道如下。1对象与方法1.1临床资料25例CHB患者均为我科2004年8月至2006年2月门诊和住院患者,男性22例、女性3例,年龄22~53岁,平均38岁。诊断符合2000年第十次全国病毒性肝炎轻度的标准[1]。所有患者血清聚合酶链反应(PCR)荧光定量测定HBV DNA均为阳性,25例均为HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性。且在…     

聚乙二醇干扰素α-2a治疗慢性乙型肝炎引起甲状腺功能异常临床分析

目的 探讨聚乙二醇干扰素α-2a治疗慢性乙型肝炎过程中对甲状腺功能的影响及对策.方法 对2007-2011年95例应用聚乙二醇干扰素α-2a治疗慢性乙型肝炎而引起甲状腺功能异常者的临床表现、实验室检查、治疗及转归进行分析.结果 应用聚乙二醇干扰素α-2a治疗期间,10例( 10/95,10.53％)患者出现甲状腺功能异常,其中4例甲状腺功能亢进,6例甲状腺功能减退,采取相应治疗措施后预后均良好.结论 聚乙二醇干扰素α-2a治疗慢性乙型肝炎可导致甲状腺功能异常,需定期监测甲状腺功能,对甲状腺功能异常的积极治疗可以保证干扰素治疗的继续进行,而随着干扰素治疗的结束,甲状腺功能可以恢复正常.     

单核细胞乙型肝炎病毒cccDNA检测方法及应用价值

目的 建立检测HBV共价闭合环状DNA（ cccDNA）的巢式-荧光定量PCR法,检测外周血单核细胞（ PBMC）及骨髓单核细胞（MMNC）中cccDNA。方法 根据HBV cccDNA与松弛结构DNA（rcDNA）结构上的差异,设计2对跨缺口的特异性引物及下游的特异性TaqMan探针。根据Mung Bean Nuclease对rcDNA与cccDNA作用的不同,使cccDNA扩增而使rcDNA降解,分别用外引物及内引物进行PCR反应,再用荧光探针进行实时荧光定量PCR,根据阳性参照物,计算出检测标本定量值。结果 成功建立了HBV cccDNA巢式-荧光定量PCR的检测方法,线性范围为5.0× 10２～3.9×107拷贝/ml。用上述方法检测25例慢乙肝及肝硬化血清HBV DNA阳性患者外周血单核细胞中cccDNA,7例骨髓单核细胞中cccDNA,21例健康献血者外周血单核细胞中cccDNA,骨髓标本中有3例cccDNA阳性,25例外周血标本中有9例cccDNA阳性。结论 巢式-荧光定量PCR法可检测乙肝患者PBMC及MMNC中的HBVcccDNA含量。PBMC及MMNC中可检测到HBVcccDNA.     

不同的样本处理方法对乙型肝炎病毒DNA检测的影响

目的探讨乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的聚合酶链反应（ＰＣＲ）常规检测中血清样本的最佳处理方法。方法分别用不同缓冲液（ＰＢＳ与ＴＥ）对血清进行１：１或１：１０稀释，不同浓度去污剂（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００与ＮＰ４０）及巯基乙醇处理血清样本，以及用硫氰酸胍－酚－氯仿抽提、蛋白酶Ｋ消化、碱裂解、辛酸钠裂解等方法处理血清样本，比较这些方法对ＰＣＲ法检测血清ＨＢＶＤＮＡ敏感度的影响，并进行了辛酸钠最适浓度实验。结果在所比较的１８种方法中发现硫氰酸胍－酚－氯抽提法、碱裂解法及辛酸钠法有较高的检测敏感度，而辛酸钠法有更好的重复性，方法最为简便。结论终浓度３０～５０ｍｍｏｌ／Ｌ辛酸钠最适用于ＰＣＲ法常规检测ＨＢＶＤＮＡ的血清处理     

竞争性聚合酶链反应法定量检测慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒前C区野毒株及变异株

设计了以内参照为基础的竞争性聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法，同时定量检测ＨＢｅＡｇ阴性的慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因前Ｃ区野毒株及变异株，并观察了在应用α干扰素（ＩＦＮ）治疗以后的变化。结果发现干扰素治疗有效者中，病毒核酸量迅速下降至转阴；而干扰素治疗无效者中，病毒核酸量也可有所下降，但仍高于检测水平甚至反跳；另外，野毒株对ＩＦＮ的反应似乎优于突变株。该方法可用于研究乙型肝炎病毒感染过程及考核抗病毒药物疗效。     

聚乙二醇干扰素α-2a治疗拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎疗效观察

目的 观察聚乙二醇干扰素α-2a（PEG-IFNa-2a）治疗拉米夫定（LAM）耐药的慢性乙型肝炎（CHB）的疗效和安全性.方法 将81例拉米夫定耐药的HBeAg（＋）慢性乙型肝炎患者分为聚乙二醇干扰素α-2a（派罗欣）治疗组40例及阿德福韦酯（ADV）对照组41例.两组病例开始均联合LAM治疗12周,观察治疗第12周、24周、48周的ALT复常、HBV DNA阴转、HBeAg阴转及HBeAg转换的变化.结果 治疗12周、24周派罗欣治疗组ALT复常率为62.5%、80.0%,高于ADV 对照组,治疗48周派罗欣治疗组HBeAg阴转率及HBeAg转换率为60%、57.5%,高于ADV对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 聚乙二醇干扰素α-2a治疗拉米夫定耐药的HBeAg（＋）慢性乙型肝炎的疗效优于阿德福韦酯,安全性较好.     

两疗程重组人干扰素α-2b治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎疗效比较

目的 探讨不同疗程的重组人干扰素(IFN)α-2b(安福隆)治疗乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阳性慢性乙型肝炎(CHB)的疗效并比较随访12个月的结果.方法 72例CHB患者,其中男性46例,女性26例;年龄16～50岁,平均年龄32岁.病程1.8～27.0年,平均病程13.0年.随机分2组,Ⅰ组(42例)予重组人I...     

动态观察血清HBV-DNA水平预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的意义

目的　研究干扰素 α 2a治疗慢性乙型病毒性肝炎 (慢性乙肝 )期间 ,患者血清中HBV-DNA定量的动态变化与疗效的关系。方法　 5.8例慢性乙肝患者皮下注射干扰素 α-2a3MIU 次 ,每周 3次 ,疗程 6个月。观察患者血清中HBV DNA定量和丙氨酸转氨酶 (ALT)的动态变化。结果　完全有效组治疗 1个月后 ,患者血清中HBV DNA定量显著降低 [(3 99± 0.91)log1.0 ],明显低于部分有效组[(5.6 3± 1.31)log1 0 ]和无效组 [(6.6 9± 1.4 2 )log1 0 ],(P <0.0 5 )。疗效不同的 3组患者经过 1个月的治疗 ,血清中HBV DNA定量分别下降 (2.5 0± 0.4 4 )log1 0 、(1 6 2± 1.12 )log1 0 和 (1 0 5± 1.35 )log1 0 。通过多因素分析 ,用干扰素 α-2a治疗 1个月后患者血清中HBV DNA阴转 ,提示干扰素 α-2a的疗效好 ;治疗前ALT高水平和无家族史也与其疗效好相关。结论　患者治疗 1个月后血清中HBV DNA定量是预测干扰素 α 2a疗效的重要因素     

干扰素α-2b对慢性乙型肝炎患者氧化损伤状态的影响

目的探讨不同基因型慢性乙型肝炎患者干扰素α-2b(IFNα-2b)治疗前后氧化损伤状态的变化及其与抗病毒疗效的关系。方法35例符合干扰素治疗指征的慢性乙型肝炎患者,分别给予IFNα-2b300万U,肌内注射,每周3次,疗程12周。治疗前后化学比色法测定患者血清丙二醛和总抗氧化能力指标的变化,同时在治疗过程中定期复查患者肝功、胆红素、血常规、HBV DNA及病毒标志物的变化,核酸杂交-酶联免疫吸附法测定乙肝病毒基因分型,18例健康人作为正常对照。结果慢性乙型肝炎患者血清丙二醛浓度明显高于健康对照组(P<0.05),总抗氧化能力明显低于健康对照组(P<0.05)。不同基因型患者血清丙二醛水平及总抗氧化能力无显著差别(P>0.05)。干扰素治疗后患者血清丙二醛水平明显低于治疗前水平(P<0.05),无效组治疗后的丙二醛浓度仍高于健康对照(P<0.05)。干扰素治疗前有效组的血清总抗氧化能力明显高于无效组(P<0.05),治疗后血清总抗氧化能力明显升高(P<0.05)。结论IFNα-2b治疗可以明显改善慢性乙型肝炎患者的氧化-抗氧化损伤平衡障碍,抗病毒治疗中适当应用抗氧化剂可能有助于提高临床疗效。