正常神经管发育和神经管缺陷中转染重组bcl-2的作用

目的:探讨bcl-2在正常神经管发育和异常神经管缺陷中的作用。方法:构建了重组bcl-2的真核表达载体,建立了维A酸致小鼠神经管缺陷(neuraltubedefects,NTD)模型。用全胚胎培养结合显微注射技术将重组的正义bcl-2表达质粒导入NTD鼠胚后,观察神经管缺陷的改善程度。结果:经转染bcl-2基因后,前脑的关闭率由原来的34%增至80%,中脑的关闭率由原来的17%增至70%,后脑的关闭率也由原来的25%增至增加了70%,脊神经管的关闭率达到100%。结论:RA介导的神经管缺陷可部分被重组的bcl-2基因缓解。     

RNA干扰MBP-1基因对胃癌细胞SGC-7901增殖影响

目的：探讨 MBP-1（c-myc promter binding protein 1,MBP-1）基因表达沉默对胃癌细胞株 SGC-7901细胞增殖影响。方法实验分3组：空白对照组（未转染胃癌细胞）、阴性对照组（转染错义序列）和干扰组（转染 MBP-1 shRNA）。设计2条针对MBP-1基因的小干扰 RNA 片段及1条阴性对照 siRNA,并构建入 pSIREN-retroQ 质粒。将构建的重组 pSIREN-retroQ 质粒通过 Lipofectamine 2000脂质体转染胃癌 SGC-7901细胞,嘌呤霉素筛选稳转株细胞。Real time PCR 和 Western blot 分别检测MBP-1表达。MTT 法对 MBP-1干扰后 SGC-7901细胞增殖进行检测。结果通过 PCR 扩增阳性克隆及测序,说明已成功构建MBP-1干扰及对照重组 pSIREN-retroQ 质粒。通过 Lipofectamine 2000脂质体将重组质粒转染胃癌 SGC-7901细胞,并通过嘌呤霉素筛选2周,说明已成功构建 MBP-1干扰及对照 SGC-7901稳转株细胞。Real time PCR 检测,干扰组 MBP-1 mRNA 相对表达量与空白对照组相比显著下调（P ＜0.05）。Western blot 检测 MBP-1蛋白表达,干扰组 MBP-1表达量与空白对照组相比也都显著下调。MTT 法检测结果表明,MBP-1干扰组细胞在48、72、96和120 h 增殖能力比空白对照组都有显著的升高（P ＜0.05）。结论下调 MBP-1基因表达能明显促进胃癌细胞 SGC-7901的增殖,从而为胃癌基因治疗提供了新靶点。     

靶向survivin的siRNA并氟尿嘧啶转染对HepG2增殖影响

目的研究靶向survivin的小分子干扰RNA（siRNA）和氟尿嘧啶（5-FU）联用对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用及对凋亡的影响。方法将HepG2细胞分为空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组、siRNA转染组及5-FU＋siRNA转染组。转染采用脂质体法。采用RT-PCR法分别检测HepG2细胞survivin mRNA转录水平;MTT法分别检测靶向survivin的siRNA和5-FU对HepG2细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测HepG2细胞凋亡情况。结果 siRNA转染组、5-FU＋siRNA转染组survivin mRNA表达较空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组明显下降（F=326.78,q=5.78～7.12,P〈0.05）。5-FU＋siRNA转染组细胞增殖抑制率为51.58%±1.35%,与其他各组相比明显增高（F=1 293.24,q=15.31～82.26,P〈0.01）。5-FU＋siRNA转染组与其他各组相比细胞凋亡率明显增高（F=13 568.68,q=110.47～327.16,P〈0.01）。结论将靶向survivin的siRNA和5-FU联合应用可以显著抑制肝癌细胞survivin基因表达,并协同抑制HepG2细胞增殖,共同发挥诱导细胞凋亡作用。     

hvrdC基因表达水平对胃癌细胞SGC-7901增殖影响的实验研究

目的 观察胃癌SGC-7901细胞株中hyrdC基因的不同表达水平对细胞增殖的影响.方法 分别将已构建的携带hyrdC基因的Ad-hyrdC重组腺病毒和靶向抑制hyrdC基因表达的AdshyrdC重组腺病毒,转染人胃癌SGC-7901细胞株,同时设空病毒Ad-null组和正常对照组,利用绘制生长曲线法和MTT法观察各组间胃癌细胞增殖的差异;将各组胃癌细胞接种裸鼠皮下构建裸鼠荷瘤模型,比较各组胃癌细胞瘤体生长率的差异.结果 Ad-hyrdC组胃癌SCC-7901细胞增殖显著快于Ad-shyrdC组、Ad-null组和正常对照组,48 h后细胞数与Ad-shyrdC组、Ad-null组和正常对照组比较有统计学差异(P<0.05):Ad-shyrdC组胃癌SCC-7901细胞的光吸收值明显低于Ad-hyrdC组、Ad-null组和正常对照组(P<0.05):Ad-shyrdC组瘤体生长率较Ad-hyrdC组、Ad-null组以及正常对照组明显减慢(P<0.05),Ad-hyrdC组瘤体生长率较Ad-shyrdC组、Ad-null组以及正常对照组明显加快(P<0.05).结论 hyrdC基因具有促进胃癌细胞生长的功能,而靶向沉默hyrdC基因表达可抑制胃癌细胞的生长,hyrdC基因有望成为胃癌基因治疗领域的新靶点.     

靶向TNF-α基因shRNA干扰片段的筛选和重组体的构建

本研究利用RNA干扰技术，筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的小发夹状RNA（shRNA）片段，设计并构建重组质粒，进行序列分析，为探索TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径。取原代培养小鼠腹腔巨噬细胞，置于15％ DMEM中，调细胞浓度为2×10^7／L，接种于6孔板，3ml／well；细胞用脂多糖（LPS）激活，ELISA法测不同时间培养上清中TNF—α的浓度；将针对TNF-α基因的5段shRNA干扰片段的表达框经PCR扩增、纯化后，与转染试剂混合转染入巨噬细胞，细胞用LPS激活24小时后用ELISA法测培养上清中TNF-α的浓度，RT—PCR法测细胞TNF-α mRNA的表达；将最有效抑制TNF-α表达的干扰片段插入质粒载体，转化Ecoli DH5α感受态菌株，提取质粒，进行测序分析。结果表明：LPS刺激巨噬细胞24小时后，细胞分泌TNF—α达高峰；转染了干扰序列1的细胞培养上清中TNF—α浓度与对照组相比下降最明显（P〈0．05），达59．46％，TNF—α mRNA的表达被抑制了61．2％；将干扰序列1DNA序列克隆到载体上，经测序鉴定确实为所需序列。结论：成功筛选出靶向TNF-α基因的shRNA干扰片段并构建重组质粒，可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF-α mRNA的表达，为TNF—α相关疾病的基因治疗提供新手段。     

HCCR-2干扰真核表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的构建HCCR-2干扰真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的HepG2细胞系。方法人工合成HCCR-2基因干扰序列并定向插入到RNAi真核表达载体pGenesil-1,通过测序鉴定。将干扰质粒用脂质体法转染HepG2细胞,经G418持续压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系。RT-PCR检测筛选克隆HCCR-2 mRNA的表达水平。结果测序表明HCCR-2干扰序列及读框完全正确,干扰质粒稳定转染的HepG2细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光。RT-PCR结果显示RNAi-H1、RNAi-H3序列对HCCR-2 mRNA有较好的抑制效果。结论成功构建了HCCR-2干扰真核表达载体,HCCR-2干扰质粒稳定转染的HepG2细胞系的建立为进一步研究HCCR-2在肝癌细胞中的作用奠定了基础。     

shRNA对胃癌细胞株SGC-7901 VEGF-C表达的抑制作用

目的:筛选出有效干扰胃癌SGC-7901细胞株血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)的短发卡状RNA(short hairpin RNA,shRNA).方法:设计2个shRNA片段,VEGFC-1505与VEGFC-1417,体外转染VEGF-C阳性表达的胃癌细胞株SGC-7901,采用RT-PCR检测VEGF-C mRNA表达水平的变化,western-blot检测VEGF-C蛋白水平变化.结果:VEGFC-1505可以显著抑制VEGF-C基因表达,对其mRNA表达的抑制率可以达到53%,对蛋白的表达抑制率可以达到92.9%.结论:成功筛选出针对胃癌SGC-7901细胞株VEGF-C的shRNA,为抑制肿瘤淋巴管生成和转移研究提供有效的实验工具.     

siRNA靶向沉默hTERT基因对人胰腺癌的凋亡抑制基因bcl-2和环氧合酶-2基因表达的影响

目的应用siRNA靶向沉默人胰腺癌Capan-2细胞的hTERT基因表达,观察其对凋亡抑制基因（bcl-2）和环氧合酶-2（COX-2）基因表达的影响。方法应用脂质体Lipofectamine2000作为基因转染的载体,实时PCR进行扩增检测转染细胞的hTERT、bcl-2、COX-2基因的mRNA表达水平,应用Western blotting检测hTERT、bcl-2、COX-2蛋白表达水平。结果在hTERT-siRNA完全沉默hTERT表达的基础上,bcl-2、COX-2基因mRNA表达的量在hTERT-siRNA转染后48h均明显受到抑制（P〈0.001）,抑制率分别为87.86%、100.00%,但在72h后均恢复至与对照组相似的水平,而阴性对照组、Lipo对照组与空白对照组的各基因表达量差异均无统计学意义（P〉0.05）。bcl-2、COX-2蛋白水平在转染48h和72h后被分别下调了58.54%和63.44%、50.06%和82.77%（P〈0.01）,Lipo对照组和阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 siRNA靶向沉默hTERT基因表达,可在一定程度上抑制人胰腺癌Capan-2细胞的bcl-2、COX-2基因的表达。     

HMGA2shRNA真核表达载体转染胃癌MKN45细胞株的沉默作用

目的:将HMGA2shRNA真核表达载体转染至胃癌细胞MKN45,检测其HMGA2mRNA及蛋白的表达.方法:实验分3组:空白组(未转染的胃癌细胞)、实验组(转染HMGA2shRNA组)、阴性对照组(转染错义序列组),RT-PCR和Western blot分别检测HMGA2在mRNA及蛋白水平的变化.结果:与空白组和阴性对照组相比,实验组HMGA2mRNA的表达明显下降,差异具有统计学意义(均P＜0.05);HMGA2蛋白表达的变化与基因的变化相一致,实验组的蛋白表达明显受抑制,差异具有统计学意义(均P＜ 0.05).结论:HMGA2的特异性shRNA表达载体抑制了HMGA2的表达,HMGA2shRNA转染有望用于胃癌的基因治疗,为进一步研究其更多功能打下基础.     

蛋白酶激活受体-2基因靶向shRNA表达质粒的构建及转染食管癌细胞致沉默效应的研究

目的:构建靶向蛋白酶激活受体-2(PAR-2)基因的shRNA表达质粒,建立PAR-2基因沉默的食管癌EC109稳定细胞株.方法:针对人PAR-2的mRNA序列,设计并体外合成编码shRNA的两条特异性寡核苷酸序列,分别插入pGFP-V-RS质粒中构建2个shRNA表达质粒(PAR-2 shRNA-1、PAR-2 shRNA-2),经过鉴定,然后将表达质粒转染至食管癌细胞EC109中,经嘌呤霉素筛选,获得稳定干扰的细胞株,运用RT-PCR和Western Blot检测PAR-2的表达.结果:PAR-2 shRNA-1转染人食管癌细胞EC109后,PAR-2基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建针对PAR-2基因的shRNA表达质粒,转染食管癌细胞EC109,能有效抑制该细胞株PAR-2基因的表达.     

凋亡相关基因bcl-2、bax在膀胱癌组织中的表达及其临床意义

目的　探讨凋亡相关基因bcl 2和bax在膀胱癌组织中的表达及其临床价值。方法　应用免疫组织化学ABC法 ,检测 80例膀胱癌 (TCC) ,18例正常膀胱组织bcl 2和bax蛋白表达。结果　膀胱癌组bcl 2蛋白表达阳性率明显高于正常膀胱粘膜组 (P<0 0 5) ,而bax蛋白表达无显著性差异。bcl 2随肿瘤病理分级增高阳性表达逐渐提高 (P<0 0 1) ,bcl 2在浸润性膀胱癌中的阳性表达高于浅表性膀胱癌 ,但无显著性差异 (P >0 0 5) ,而bax蛋白表达在浅表性膀胱癌明显高于浸润性膀胱癌 (P <0 0 1) ,bcl 2在复发肿瘤者中的阳性表达高于未复发肿瘤者 ;在正常膀胱组织和膀胱癌中bcl 2 /bax阳性表达率的比值分别为 0 10和 0 61,具有显著性差异 (P<0 0 1)。结论　由于bcl 2蛋白过量表达引起bcl 2 /bax失平衡 ,在膀胱癌的发生、发展中起着一定作用。bcl 2蛋白表达与临床分期无关 ,而与病理分级有关 ,bax蛋白表达与临床分期有关 ,bcl 2可作为术后预测肿瘤复发的参考指标之一     

bcl-2和bax在口腔癌组织中表达与凋亡关系的研究

目的　通过对口腔癌组织及癌旁正常组织中bcl 2和bax基因表达与本底凋亡细胞的研究 ,探讨口腔癌组织及癌旁正常组织中凋亡与基因表达的关系。方法　利用免疫组化法检测 67例口腔癌组织标本及 42例癌旁正常口腔组织中bcl 2和bax基因表达 ,利用TUNEL方法检测口腔癌组织标本中凋亡的情况。结果　bcl 2、bax基因在口腔癌组织及癌旁口腔组织中的阳性及阴性表达均具有显著性差异 ;两者在口腔癌组织中的阳性及阴性表达 ,其细胞凋亡的指数均有显著性差异。bcl 2、bax基因表达呈显著负相关。结论　口腔癌组织中bcl 2基因阳性表达时 ,其本底凋亡指数较阴性表达时低 ;而bax基因性表达时 ,其本底凋亡指数较阴性表达时高 ,两者在细胞凋亡过程中存在着拮抗作用的关系     

凋亡相关基因p53和bcl-2蛋白在前列腺癌的中表达及其临床意义

目的 :探讨细胞凋亡相关基因bcl 2、p5 3在前列腺癌中的表达及意义。 方法 :应用免疫组织化学ABC法 ,检测 3 6例前列腺癌 (Pca) ,2 0例前列腺增生 (BPH )组织和 11例正常前列腺组织 (NP)中bcl 2、p5 3蛋白表达。结果 :①Pca和BPH组bcl 2蛋白阳性表达率明显高于NP组 (P <0 .0 5 ) ,而Pca组与BPH组阳性率无显著性差异。Pca组 p5 3蛋白阳性表达率明显高于BPH组和NP组 (P <0 .0 5 ) ,而BPH组与NP组阳性率无显著性差异 (P >0 .0 5 )。②在Pca组中bcl 2蛋白阳性 10例 ,其中Ⅰ、Ⅱ级肿瘤组阳性 4例 ,Ⅲ、Ⅳ级肿瘤组 6例 (P <0 .0 5 ) ;p5 3蛋白阳性 12例 ,其中Ⅰ、Ⅱ级肿瘤组阳性 5例 ,Ⅲ、Ⅳ级肿瘤组 7例 (P <0 .0 5 )。显示bcl 2、p5 3蛋白表达随着病理分级的增高而增高。③p5 3蛋白表达阳性率≤ 5年生存组明显高于>5年生存组 ,呈负相关 (P <0 .0 5 )。bcl 2蛋白表达与生存期无关 (P >0 .0 5 )。结论 :p5 3、bcl 2蛋白的异常表达与前列腺癌的发生发展、病理分级及预后有关。     

奥曲肽对人胃癌细胞抑制作用的实验研究

目的 探讨生长抑素类似物奥曲肽(OCT)对胃癌细胞株MKN_(45)生长的体外调节作用。方法 MTT法测定OCT对MKN_(45)细胞增殖的调控;流式细胞术分析OCT对MKN_(45)细胞周期分布的影响;RIA法测定表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)含量的变化。结果 OCT对MKN_(45)细胞生长有抑制作用,以在1×10~(-6)mol/L浓度时最明显;OCT可诱导MKN_(45)细胞G_0/G_1阻滞,加入OCT后24 h最显著,同期G_2/M期细胞比例亦减少;OCT能抑制胃癌细胞合成EGF、TGF-α的能力。结论 OCT对胃癌生长具有负性调控作用,为胃癌患者应用OCT治疗提供了依据。     

BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染＋丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义（F=6 250.510,q=56.992、51.613,P〈0.01）。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。     

EFFECTS OF p53 GENE THERAPY COMBINED WITH CYCLOOXYGENASE-2 INHIBITOR ON CYCLOOXYGENASE-2 GENE EXPRESSION AND GROWTH INHIBITION OF HUMAN LUNG CANCER CELLS

Background Gene therapy by adenovirus-mediated wild-type p53 gene transfer has been shown to inhibit lung cancer growth in vitro, in animal models, and in human clinical trials. The antitumor effect of selective cyclooxygenase （COX）-2 inhibitors has been demonstrated in preclinical studies. However, no information is available on the effects of p53 gene therapy combined with selective COX-2 inhibitor on COX-2 gene expression and growth inhibition of human lung cancer cells. Methods We evaluated the effects of recombinant adenovirus-p53 （Adp53） gene therapy combined with selective CADX-2 inhibitor on the proliferation, apoptosis, cell cycle arrest of human lung adenocarcinoma A549 cell line, and the effects of tumor suppressor exogenous wild type p53 on COX-2 gene expression. Results Ad-p53 gene therapy combined with selective COX-2 inhibitor celecoxib shows significant synergistic inhibition effects on the growth of human lung adenocarcinoma A549 cell line. Exogenous p53 gene can suppress COX-2 gene expression. Conclusions Significant synergistic inhibition effects of A549 cell line by the combined Ad-p53 and selective COX-2 inhibitor celecoxib may be achieved by enhancement of growth inhibition, apoptosis induction and suppression of COX-2 gene expression. This study provides first evidence that the administration of p53 gene therapy in combination with COX-2 inhibitors might be a new clinical strategy for the treatment or prevention of NSCLC.     

EFFECTS OF p53 GENE THERAPY COMBINED WITH CYCLOOXYGENASE-2 INHIBITOR ON CYCLOOXYGENASE-2 GENE EXPRESSION AND GROWTH INHIBITION OF HUMAN LUNG CANCER CELLS

1 INTRODUCTIONCOXis the key enzyme involved in the synthesis of prostanoids,a collective termfor the PGs andthromboxanes.Of the two major isoforms of the COXenzyme,COX-1 is ubiquitous and constitutively ex-pressedin virtually all normal tissues.In contras…     

siRNA沉默血管VEGFR-1基因对乳癌生长抑制作用

目的探讨应用化学修饰的小干扰RNA（siRNA）沉默人裸鼠乳癌移植瘤新生血管中的血管内皮生长因子受体-1（VEGFR-1）基因对移植瘤生长的影响。方法将组织瘤块接种于裸鼠右侧第二对乳腺的脂肪垫内,肿瘤长至一定大小时,随机分为对照（A）组、转染试剂对照（B）组、siRNA治疗（C）组。于肿瘤局部分别注射PBS溶液、Lipofectamine 2000^TM转染试剂和Lipofectamine 2000^TM转染试剂包裹的VEGFR-1 siRNA。22d后处死全部动物,取肿瘤,测其大小;用RT—PCR及蛋白印迹法检测乳癌组织VEGFR-1基因的表达。结果与A、B组比较,C组移植瘤增长趋势受到明显抑制（F=158．18、55．72,q=11．39、14．05,P〈0．01）;RTPCR结果表明,与A、B组比较,C组明显下调了VEGFR1 mRNA的表达（F=385．06,q=33．43,34．52,P〈0．01）;蛋白印迹法结果亦显示,C组明显下调了VEGFR-1 mRNA的表达（F=114．11,q=9．31,20．75,P〈0．01）。A组和B组各指标差异无显著性（P〉0．05）。结论化学修饰的siRNA介导的RNAi可以降低人乳癌裸鼠移植瘤血管中VEGFR-1的表达,抑制血管生成进而抑制肿瘤的生长,是潜在的肿瘤治疗的新方法。     

塞来昔布对小鼠膀胱肿瘤的抑制作用

目的探讨选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对膀胱肿瘤的抑制作用及其机制。方法建立小鼠膀胱肿瘤模型并随机分为对照组、实验1组和实验2组,分别给予生理盐水和不同剂量的塞来昔布灌胃,观察肿瘤的生长情况,测量肿瘤体积、质量并计算抑瘤率;免疫组织化学方法检测肿瘤原癌基因bcl-2和半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表达情况,并计算其免疫组化评分（HIS）。结果实验1、2组肿瘤的平均质量明显低于对照组,差异有显著性（F=64．99,q=4．52、15．66,P〈0．05）。实验1、2组的抑瘤率分别为43％和58％。3组间bcl-2的HIS比较差异有显著性（F=25．08,q=3．75～9．91,P〈0．05）;3组间caspase-3的HIS比较差异有显著性（F=16．82,q=3．26～8．15,P〈0．05）。结论塞来昔布能抑制小鼠膀胱肿瘤的生长,其机制可能与抑制bcl-2、增强caspase-3的表达有关。     

细胞凋亡与bcl-2在皮肤鳞形细胞癌中的表达及意义

目的 :研究人类皮肤肿瘤中细胞凋亡及凋亡相关基因bcl -2的表达 ,探讨癌组织中细胞凋亡和bcl-2的关系。方法 :应用三羟基末端标记法和免疫组化 (SABC)法原位观察了 40例皮肤癌中细胞凋亡与bcl-2蛋白的表达 ,以 10例正常组织作对照。结果 :细胞凋亡广泛存在于皮肤鳞癌中和正常组织中 ,皮肤鳞癌中细胞凋亡明显高于正常组织 (P <0 0 5 ) ;皮肤鳞癌中细胞凋亡与bcl-2阳性表达有显著差异 (P <0 0 1)。结论 :皮肤癌组织中bcl-2与细胞凋亡关系密切 ,bcl-2有抑制细胞凋亡的作用。