方格星虫实时荧光定量PCR内参基因的选择与验证

目前研究基因定量表达的方法主要为实时荧光定量PCR,选择合适的内参基因可以提高实时荧光定量PCR分析的准确性.选取方格星虫的体壁肌肉、吻、肾管、脑、肠道、收吻肌、食道、血淋巴细胞为材料,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析EF1-α2、α-Tub1、RPL13-b、Actin1、H3-b、GAPDH1共6个...     

三倍体虹鳟实时荧光定量PCR内参基因稳定性分析

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)、核糖体大亚基蛋白基因(rplp2)、真核延伸因子基因(ef1-α)、β-肌动蛋白(β-actin)和18S核糖体核酸基因(18S rRNA)等5个候选内参基因在体质量约800 g三倍体虹鳟脑、眼、鳃、皮肤、心脏、肾脏(头肾、中肾、后肾...     

达氏鲟实时荧光定量PCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是基因表达研究的常用方法,筛选达氏鲟（肌动蛋白（）、18S核糖体RNA（）共7个常用内参基因作为候选基因,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4个软件分析这7个候选基因在达氏鲟成鱼不同组织和不同发育时期胚胎及性腺的表达稳定性。结果表明,7个候选内参基因的定量PCR引物均可获得特异性扩增产物和理想的扩增效率。在成鱼不同组织中,候选内参基因稳定性由高到低的顺序为18S rRNA > > GAPDH > -actin > ;在不同发育时期卵巢中,候选内参基因稳定性由高到低的顺序为 > ,而不同发育卵巢最稳定表达的内参基因是。本研究旨在为今后达氏鲟不同组织、不同发育时期胚胎及性腺的基因表达差异研究提供理论基础。     

异育银鲫内参基因的筛选

内参基因在实时荧光定量PCR(qRT-PCR)中具有校准的作用,然而鲤疱疹病毒Ⅱ型感染异育银鲫内参基因目前仍未见研究报道。采用qRT-PCR技术检测不同处理条件下异育银鲫组织和尾鳍细胞GAPDH、EF-1α、18S rRNA和β-actin 4个候选内参基因在组织和尾鳍细胞的转录水平,利用软件geNorm、Norm Finder、Best Keeper和Delta Ct分析了其表达量的稳定性,以筛选出健康异育银鲫不同组织以及鲤疱疹病毒Ⅱ型感染的肾脏、脾脏和异育银鲫尾鳍细胞在不同时间均较稳定的内参基因。geNorm稳定值以及4个内参的表达量Ct值分析显示,健康异育银鲫脑、脾脏、肾脏、肌肉、鳃、肠、肝脏和心脏组织中β-actin和EF-1α都是比较稳定的内参基因;鲤疱疹病毒Ⅱ型感染肾脏和尾鳍细胞不同时间点,内参基因β-actin稳定性最佳;鲤疱疹病毒Ⅱ型感染脾脏不同时间点时,EF-1α稳定性最佳。分别以4个候选内参基因为内参分析PIN1基因在肾脏组织不同感染时间的相对表达量,结果进一步证实,PIN1基因在肾脏组织感染不同时间点以β-actin为内参时,其表达量呈下降趋势,与cDNA文库测序...     

岩牡蛎正常和低盐胁迫下定量PCR内参基因的筛选与验证

实时荧光定量 PCR 已广泛用于基因表达的分析,合适的内参基因选择是获得准确分析结果的关键。本研究选用正常生理状态下岩牡蛎(Crassostrea nippona)的鳃、外套膜、闭壳肌和内脏团 4 种组织以及盐度 10、20 和 30暂养 1 周后的鳃组织为材料,对已报道的常见内参基因(EF1A、GAPDH、RO21、TUB 和 TUA)的稳定性通过 3 种方法(geNorm、NormFinder 和 BestKeeper)进行分析和筛选,发现针对鳃单一组织在不同盐度胁迫下, GAPDH 和RO21 可以作为合适内参基因,而在不同组织中,需要更多的内参基因联合分析才能获得准确的定量表达结果。本研究是首次利用 q-PCR 对岩牡蛎进行内参基因的筛选和验证,为今后该物种低盐胁迫相关的基因表达和功能基因的研究提供重要依据。     

青海湖裸鲤肠道组织学研究

采用石蜡切片法研究了青海湖裸鲤肠道的组织学结构。结果表明 ,青海湖裸鲤肠道可分为前肠、中肠、后肠 ,其前、中、后肠的组织学特点差异明显 ;裸鲤肠道由内向外可以分为粘膜层、粘膜下层、肌层和浆膜层 ,但缺乏粘膜肌 ,因此固有膜和粘膜下层分层不明显 ;裸鲤前、中肠的褶皱高而宽 ,排列紧密 ,纹状缘明显 ;后肠的褶皱低而窄 ,排列疏松 ,纹状缘不明显 ;裸鲤肠道的杯状细胞数量从前肠到后肠依此逐渐减少。文中还对青海湖裸鲤肠道各段的结构与食性特点进行了探讨。     

青海湖裸鲤性腺发育观察

采用组织切片法 ,对青海湖裸鲤的性腺发育进行观察。其性腺的发育可分为六个时期 ;卵母细胞从第 3时相发育到第 4时相基本同步 ,产后卵巢的组织结构回复到II期 ;产卵时间始于 3月上旬 ,持续到 7月上旬。     

锌离子胁迫下青海湖裸鲤钙调蛋白磷酸酶的表达

为检测在重金属胁迫下青海湖裸鲤钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin,CN)的动态变化,确定CN是否可以作为生物标志物对水环境中的重金属污染进行早期诊断,通过检测Zn~(2+)胁迫后青海湖裸鲤CN表达量的变化,研究了Zn~(2+)对青海湖裸鲤生存状态的影响。结果表明,Zn~(2+)对青海湖裸鲤的致死率与胁迫时间和离子浓度成正相关;通过实时定量PCR发现,CN在鳃、肌肉、肾脏和肝脏中均有表达;在Zn~(2+)浓度为1 mg/L时,随着胁迫时间的逐渐延长,鳃中CNAα、CNAγ和CNB均有逐渐增加的趋势,96 h时表达量达到最高水平;随着胁迫浓度的逐渐增加,CNAα、CNAγ和CNB表达量呈先升高后降低的变化趋势,在Zn~(2+)浓度为2 mg/L时,三者表达量均达到最高水平。研究结果显示,青海湖裸鲤钙调蛋白磷酸酶对锌离子胁迫产生了明显应答,可以作为重金属污染的候选生物标志物。     

青海湖裸鲤人工繁殖技术

青海湖裸鲤具有重要的生态、科研和经济价值,而人工孵化工作则是重中之重,本文总结了多年青海湖裸鲤受精卵孵化工作经验,提出并讨论了存在的问题,希望对青海湖裸鲤研究工作者起到一定的指导作用.     

青海湖裸鲤与草鱼群体遗传变异性比较

青海湖裸鲤 (ＧｙｍｎｏｃｙｐｒｉｓｐｒｚｅｗａｌｓｋｉｉｐｒｚｅｗａｌｓｋｉｉＫｅｓｓｌｅｒ)、隶属鲤科 (Ｇｙｐｒｉｎｉｄａｅ )、裂腹鱼亚科(Ｓｃｈｉｚｏｔｈｏｒａｃｉｎａｅ)、裸鲤属 (Ｇｙｍｎｏｃｙｐｒｉｓ)是青海湖地区重要的经济鱼类。本文利用ＲＡＰＤ标记对青海湖裸鲤和雅罗鱼亚科 (Ｌｅｕｃｉｓｃｉｎａｅ)草鱼 (Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏ ｄｏｎｉｄｅｌｌｕｓｃｕｖｉｅｒｅｔＶａｌｅｎｃｉｅｎｎｅｓ)的群体遗传结构和变异程度进行了比较分析 ,为保护青海湖裸鲤天然资源提供新的资料。1　材料与方法1 1　样品来…     

青海湖裸鲤盐碱耐受过程中的渗透、免疫、代谢相关基因筛选和分析

为探究青海湖裸鲤在盐碱耐受过程中的基因表达变化,对青海湖河口水域以及入湖淡水河——泉吉河中的青海湖裸鲤的鳃、肾脏组织进行转录组测序,筛选青海湖裸鲤耐盐碱过程中发挥作用的免疫、代谢、渗透相关基因。结果显示,使用Trinity对所有样本质控数据(clean data)进行从头组装后共得到541 429个非冗余的序列(unigene),N50平均长度达612 bp。经差异表达分析发现,共有832个基因在2个区域中的青海湖裸鲤鳃、肾脏中共表达。经GO功能注释分析,注释到结合(binding)、细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)、单一生物过程(single-organism process)的DEGs占比较多。KEGG通路分析结果表明,与免疫、代谢、渗透相关的通路得到了富集。根据差异表达基因的GO注释和KEGG信号通路富集分析,实验初步筛选到了青海湖裸鲤渗透相关基因,主要包括钠/钾转运ATP酶(sodium/potassium-transporting, ATPase)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(calcium/calmodulin-d...     

青海湖裸鲤同工酶表达的组织特异性分析

使用水平淀粉凝胶电泳方法,分析了20尾青海湖裸鲤的背部肌肉、肝脏、心脏和肾脏4种不同组织的13种同工酶(LDH,MDH,ME,CAT,IDH,EST,ACP,POD,HK,PGM,GDH,SOD,GPI)差异表达,并对部分同工酶基因位点及表达酶谱表型进行了初步分析,以期为其种质资源保护和开发以及遗传育种等方面的研究提供基础资料.结果显示,13种酶类中12种在4种组织中表现出明显的组织差异性,仅有ME在4种组织间差异性较小.其中HK以及GDH的组织差异性尤为明显,仅在肝脏组织中表达.同时使用了适用于这13种酶类表达的3种缓冲系统(TC8.0、TC7.0、EBT),共检测到26个基因位点.其中,Cat,Pgm,Est-1,Gdh,Hk和s-Mdh等6个基因位点为多态位点.进一步分析了这6种多态位点酶类的亚基类型、多态基因位点以及基因位点命名,并计算了多态位点比例(P0.99)为23.08%.     

青海湖裸鲤研究现状与资源保护对策

为探究青海湖裸鲤 (Gymnocypris przewalskii) 的种质资源现状,为该物种保护措施的制定提供参考依据。首次利用基因分型技术 (Genotyping-by-sequencing, GBS),对青海湖水域的6个地理群体共72尾青海湖裸鲤进行单核苷酸多态性 (Single nucleotide polymorphism, SNP) 标记开发和遗传特征分析。共检测出1 600 061个SNP位点,质控后筛选出45 266个高质量的SNP位点用于遗传分析,发现核苷酸多样性 (P_i) 为0.317 0~0.327 4,观测杂合度 (H_o) 和期望杂合度 (H_e) 分别为0.459 4~0.482 3和0.336 7~0.344 4。6个地理群体的遗传距离 (D) 为0.018 4~0.023 3,两两群体的遗传分化系数 (F_st) 均不显著 (P>0.05)。分子方差分析 (Analysis of molecular variances, AMOVA) 显示102.37%的遗传变异来自群体内;群体遗传结构和系统发育进化树分析均显示6个群体属于一个集群,具有遗传同质性;而主成分判别分析 (Discriminant analysis of principal components, DAPC) 表明哈尔盖河、黑马河和沙柳河群体相互交叉聚类,其余3个地理群体分别聚类。综上,6个青海湖裸鲤群体的H_o均大于H_e,种群结构单一。     

青海湖裸鲤血清过氧化物酶多态性初步研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (PAGE)首次对 1 32尾青海湖裸鲤的血清过氧化物酶多态性进行了分析。结果表明 ,青海湖裸鲤的血清过氧化物酶具有POD -I、POD -II、POD -III、POD -IV和POD -V五种多态型 (基因型 ) ,出现频率分别为 65 2 %、2 2 7%、6 1 %、1 5 %和 4 5 %。     

青海湖裸鲤繁殖生物学研究

通过常规生物学测定、组织切片等手段,较详细的研究了青海湖裸鲤的繁殖生物学。卵母细胞从第3时相发育到第4时相基本同步,产后卵巢和精巢的组织学结构恢复到Ⅱ期。青海湖裸鲤为重复产卵类型,以Ⅳ期卵巢越冬,其卵巢1年只成熟1次,已达性成熟的个体并不是每年都进行繁殖活动。青海湖裸鲤性成熟迟、繁殖力低。每年5～7月,裸鲤洄游到沿湖各河流中繁殖,沙柳河、布哈河和黑马河3条河流为其主要产卵场。调查的繁殖群体总的性比(♂：♀)为1．66：1。总繁殖群体中,雄性个体最小体长130．0mm,体重28．0g,年龄4龄;雌性个体最小体长170．0mm,体重51．0g,年龄5龄。青海湖裸鲤性成熟群体的性体指标1年只有1个峰值,出现在繁殖盛期的6～7月。其平均成熟卵径为2．33mm,平均绝对繁殖力为4337．81粒,平均相对繁殖力为27．09粒／g。     

内参基因在虾夷扇贝定量PCR中表达稳定性的比较

应用实时荧光定量技术,检测虾夷扇贝的β-actin、Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogen-ase、α-tubulin、Cytochrome b5、TATA box binding protein-associated factor、Elongation factor 1α共6个内参基因在饥饿胁迫下各组织、致病菌感染前后和水环境升温前后不同时间段血样中的mRNA表达情况。经geNorm程序统计分析,6个内参基因在上述处理中的表达稳定性存在差异,导致不同处理中适用的内参基因有所不同。为进一步开展虾夷扇贝基因表达的定量研究奠定了基础。     

青海湖裸鲤特征挥发性成分分析

为分析青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)特征挥发性成分,以体重为20g的青海湖裸鲤作为研究对象,剖取肌肉后采用固相微萃取(SPME)结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)对裸鲤肌肉挥发性成分进行分离鉴定。结果表明,在青海湖裸鲤肌肉中检测出60种化合物,包括8种醇类化合物、9种醛类化合物、5种酮类化合物、2种酸类化合物、8种酯类化合物、12种烃类化合物、12种芳香族化合物及4种其他类物质,其中芳香族化合物含量最高。结合气味活度值(OVA)分析,青海湖裸鲤肌肉挥发性气味的主要贡献化合物为1-辛烯-3-醇、己醛、辛醛、壬醛、2-癸烯醛及2,4-癸二烯醛。     

盐度对青海湖裸鲤生长及渗透调节基因的影响

为探究青海湖特有珍稀鱼种青海湖裸鲤的盐度适应性机制,对青海湖裸鲤受盐度胁迫后的生长性能进行测定,qPCR检测渗透调节基因Na⁺/K⁺/2Cl^-共转运蛋白1(NKCC1)基因、Na⁺/HCO₃^-共转运蛋白1(NBC1)基因、Na⁺/H⁺交换离子1(NHE1)基因和水通道蛋白1(AQP1)基因的表达。试验结果显示：不同盐度下青海湖裸鲤的各项生长指标存在显著差异(P<0.05);盐度的升高影响了青海湖裸鲤的生长发育,青海湖裸鲤的生长状况与盐度呈负相关关系。NKCC1、NBC1、NHE1、AQP1基因在不同盐度处理组青海湖裸鲤的鳃、肾脏和肝脏中均有表达,且表现出一定的组织特异性;NKCC1、NBC1、NHE1、AQP1基因参与了青海湖裸鲤机体内、外渗透压的调节,且因盐度、组织和胁迫时间的不同而表达水平也不同,反映出鳃和肾脏为主要的渗透压调节器官。本试验结果将为探讨青海湖裸鲤洄游后的生存状况及其盐度适应机制提供理论依...     

青海湖裸鲤繁养技术

青海湖裸鲤俗称湟鱼，是青海湖特有的鱼类。其肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，深受广大消费者喜欢。经过近几年的试验，在适宜的环境下养殖，不仅肉质保持了原有特色，而且生长速度远高于原产地，2年就可以达到500g以上，是很有发展前途和养殖价值的新品种，开发潜力极大。