骨髓间质干细胞移植对肝纤维化模型大鼠治疗效果

目的探讨骨髓间质干细胞(MSCs)对肝纤维化模型大鼠肝功能及肝纤维化的改善情况。方法将39只健康雌性SD大鼠分为对照组(n=14)和肝纤维化模型组(n=25)。对照组给予普通食水喂养;肝纤维化模型组给予四氯化碳液体橄榄油混合液皮下注射及乙醇喂养,建立大鼠肝纤维化模型。建模成功后将存活的大鼠随机分为对照组、模型组和移植组(每组各9只)。取健康SD大鼠骨髓,利用全骨髓贴壁的方法原代培养骨髓MSCs,然后将MSCs通过大鼠尾静脉对肝纤维化模型大鼠进行移植。移植后4周,检测血清白蛋白、转氨酶、胆红素、Ⅳ型胶原;HE和Masson染色观察肝纤维化程度。结果 MSCs移植后4周,移植组和模型组大鼠肝的纤维组织增生较对照组大鼠重,差异有统计学意义(P<0.01);但移植组大鼠肝的纤维组织增生较模型组大鼠显著减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组和移植组的肝功能较对照组差,差异有统计学意义(P<0.01);但与模型组比较,移植组大鼠血清白蛋白显著增高,胆红素、转氨酶、Ⅳ型胶原显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论肝纤维化模型大鼠骨髓MSCs移植4周后肝功能改善,肝纤维化程度显著减轻。     

不同剂量骨髓间充质干细胞对阿霉素肾病大鼠肾纤维化形成的影响

【摘要】 目的 探讨不同剂量骨髓间充质干细胞（BMSC）对阿霉素慢性肾病大鼠肾纤维化形成的影响及其作用机制。方法 SD大鼠尾静脉注射阿霉素造模,首次剂量3 mg/kg,2周后相同剂量再次注射。造模成功后将大鼠随机分为M组（模型组,肾动脉注射磷酸缓冲液）,A组、B组、C组（肾动脉分别移植1×106个/mL、2×106个/mL、3×106个/mL BMSC,细胞悬液均为0.5 mL）,每组各9只。另取9只正常大鼠作为对照组（N组,尾静脉输注等量0.9%氯化钠溶液）。术后第4周测定各组大鼠体重,Masson染色评估肾纤维化程度,过碘酸六胺银（PASM）染色观察肾小球和肾小管基膜改变,免疫组化染色分析转化生长因子（TGF）-β1、纤维连接蛋白（FN）表达。结果 BMSC移植4周后,A、B、C组大鼠一般情况均较M组改善,体重改变最明显,体重增长变化为C组＞B组＞A组,但C组与B组差异无统计学意义（P＞0.05）。Masson染色显示M组表现为典型的肾小球和肾小管纤维化改变,肾组织大面积蓝染,A、B、C组虽也有不同程度肾纤维化改变,但程度和范围均较M组减少（P＜0.05）。PASM染色显示M组肾小球和肾小管基膜明显增厚,A、B、C组肾小球和肾小管基膜增厚程度下降（P＜0.05）。免疫组化染色显示A、B、C组肾组织不同部位TGF-β1、FN表达与M组比较均下降,尤其是C组下降最明显,仅在部分肾小球和肾小管上皮细胞见少量弱阳性表达。结论 BMSC移植治疗可延缓阿霉素慢性肾病大鼠早期肾纤维化形成,且该作用随细胞移植数量增加而增强。其机制可能是通过下调TGF-β1表达抑制细胞外基质过度沉积实现的。     

Stro-1+和Stro-1-间充质干细胞免疫抑制作用机制的探讨

目的 探讨细胞因子(TGF-β1、IL-10)与Stro-1 、Stro-1-间充质干细胞(MSC)免疫抑制效应的相关性.方法 采用实时定量RT-PCR比较TGF-β1、IL-10在MSC两种细胞亚群中的表达,以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照.以Primer ExpressTM软件进行引物设计,以Ct表示PCR的相对产量,ΔCt代表靶基因与GAPDH之间的Ct之差,以2-ΔΔCt表示ΔCt(Stro-1 MSC)与ΔCt(Stro-1-MSC)之间的比值;在3种不同条件下[①MSC单独培养;②MSC与混合淋巴反应体系(MLR)直接接触;③MSC通过Transwell与MLR间接接触],用ELISA法检测Stro-1 与Stro-1-细胞培养上清中TGF-β1的表达.结果 IL-10在Stro-1 与Stro-1-MSC中均低表达,而TGF-β1在Stro-1-MSC中显著高表达(P＜0.05);ELISA结果显示在3种培养条件下,TGF-β1在Stro-1-MSC中的表达均显著高于Stro-1 MSC(P＜0.05).结论 Stro-1 MSC较Stro-1-MSC免疫抑制作用更显著,其与TGF-β1和IL-10的表达无关,表明TGF-β1、IL-10在MSC不同亚群免疫抑制效应中不起主要作用.     

转化生长因子β1诱导SMMC—7721和HepG2肝癌细胞系发生上皮间质转化的最佳条件筛选

目的:探究转化生长因子 β1(transforming growth factor—β1,TGF—β1)诱导 SMMC—7721 和 HepG2肝癌细胞系发生上皮间质转化(epithelial—mesenchymal transition,EMT)的最佳条件.方法:采用不同浓度TGF-β1在不同条件下处理SMMC—77...     

转化生长因子-β抑制剂Decorin抗眼结膜滤过泡瘢痕形成的实验研究

目的　探讨Decorin抑制结膜下瘢痕形成的作用机制并为临床应用提供理论依据。方法　新西兰大白兔分为Decorin组、磷酸盐缓冲液 (PBS)组、正常对照组。在滤过术后第 7,14,3 0天 ,应用链酶亲和素免疫组织化学法 (SABC法 )检测各组在结膜滤过泡中转化生长因子 - β1(TGF- β1)和转化生长因子 - βⅠ型受体 (TGF - βRⅠ )的含量 ;应用天狼星玫瑰红 -偏振光法检测各组Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量。　结果　PBS组结膜滤过泡中TGF - β1、TGF - βRⅠ免疫组化染色和Ⅰ、Ⅲ型胶原染色呈强阳性表达 ,第 3 0天明显比第 7天增强 (P <0 .0 5 ) ;Decorin组结膜滤过泡中TGF - β1、TGF - βRⅠ免疫组化染色和Ⅰ、Ⅲ型胶原染色呈弱阳性表达 ,相同时相点比较 ,Decorin组比PBS组明显呈弱表达 (P <0 .0 1)。Decorin可使滤过泡瘢痕中TGF - β1和TGF - βRⅠ活性降低 ,Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量减少。　结论　Decorin可作为抑制滤过泡瘢痕形成的辅助药物     

人脐带间充质干细胞对NOD/SCID小鼠造血重建的影响

目的探讨脐带间充质干细胞(MSC)对NOD/SCID小鼠造血重建的影响。方法以足月胎儿脐带分离的MSC和脐血单个核细胞作为供体,化疗预处理后NOD/SCID小鼠作为受体。将小鼠随机分为以下3组(每组10只):单纯化疗组,仅做化疗预处理,不输注任何细胞;单移植组,化疗后输注单纯脐血单个核细胞(1×107/只);共移植组,化疗后输注脐血单个核细胞(1×107/只)和脐带MSC(1×106/只)。移植后第3、7、14、21、28天分别计数小鼠外周血白细胞,观察其变化;移植后第6周计算小鼠的生存率,并用流式细胞仪检测小鼠骨髓内人CD45 细胞的表达(即植入率)。结果共移植组小鼠移植后第14、21天外周血白细胞[分别为(5.73±0.38)×109/L、(5.90±0.42)×109/L]明显高于单移植组[分别为(3.30±0.58)×109/L、(4.83±0.41)×109/L],差异有显著性(P<0.05)。移植后第6周,共移植组小鼠骨髓人CD45 细胞表达明显高于单移植组(P<0.05),而两组小鼠生存率无显著性差异(P>0.05)。结论成功地建立了异种异基因小鼠脐血移植模型,脐带MSC作为一种新来源的MSC,能够促进造血重建,提高植入率,有望应用于临床共移植治疗中。     

HA1077对骨髓间质干细胞促愈作用的影响

目的 探讨HA1077对骨髓间质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)促愈作用的影响及其机制. 方法 (1)体外实验:体外分离培养大鼠BMSCs,随机分为正常对照组、诱导组和HA1077组.对照组加入DMEIM完全培养液;诱导组:70%DMEM完全培养液+30%大鼠成纤维细胞上清液+含8 μg/L表皮细胞生长因子(EGF)的培养液;HA1077组:在诱导组培养液基础上加入终浓度为10 μmol/L的HA1077.取培养7 d的细胞,流式细胞检测CK19表达,细胞周期和核增殖抗原(PCNA)表达.(2)在体实验:按前述方法 制备兔BMSCs.取新西兰大耳白兔8只,在背部制备6个直径为3 cm的圆形皮肤缺损(每侧各3个),深至皮下.创面随机分为空白对照组(A组):创面应用等渗盐水;EGF对照组(B组):创面外用EGF,50 U/cm2;BMSCs治疗组(C组):除用EGF外,创面注射BMSCs细胞悬液1 ml,2×106/ml;BMSCs+HA1077治疗组(D组):除应用C组措施外,创面注射0.5 ml HA1077,浓度为20 μmol/L.伤后3,7,14 d计算愈合指数(WCI). 结果 (1)体外实验:诱导组CK19的阳性率为(11.13±2.14)%,HA1077组为(40.31±0.81)%,明显高于诱导组(P<0.01).HA1077组PCNA阳性率明显高于诱导组,细胞周期分析显示S期细胞数量最多.(2)在体实验:D组伤后14 d的创面愈合指数为86.20±1.92,效果明显好于B组、C组和对照组. 结论 HA1077可以促进BMSCs细胞表达PCNA进入S期,进而分化表达CK19;在体表联合应用HA1077和BMSCs,可以明显促进创面愈合.     

全相合异基因造血干细胞移植术后间质性肺炎的疗效评估

目的研究全相合异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）术后间质性肺炎（IP）的临床特点及疗效评估。方法对我院自2004年1月～2012年2月行全相合allo-HSCT的119例患者进行研究。所有患者均使用抗病毒、抗细菌、抗真菌等药物预防IP。IP的突出特点是发热、干咳、低氧血症及肺部CT间质改变。及时治疗,甲强龙为主,经验性采用广谱抗细菌、抗病毒等药物,短期疗效不佳,则尽早抗真菌治疗。结果 119例患者中有15例发生IP,发生率为13%。其中,4例死亡,死亡率为27%。结论早期全面预防,IP发生率明显下降;密切观察,及早诊断,治疗重点突出并及早联合处理,疗效显著。     

上皮间质转化在结直肠癌肿瘤干细胞富集过程中的作用观察

目的 探讨悬浮培养法富集结直肠癌肿瘤干细胞(CSCs)的过程是否与诱导上皮间质转化(EMT)有关.方法 以采用悬浮培养法培养出的结直肠癌SW620细胞3D微球体及其亲本细胞SW620为研究对象.采用流式细胞技术、Western blotting检测CSCs标记物CD44、Ep-CAM的表达,并行软琼脂克隆实验、NOD/SCID小鼠成瘤实验,以验证3D微球体是否富集CSCs;采用Western blotting检测EMT标记物E-钙黏蛋白(E-Ca)、N-钙黏蛋白(N-Ca)及波形蛋白(Vim)在3D微球体细胞及亲本SW620细胞中的表达差异.结果 与亲本SW620细胞比较,3D微球体细胞软琼脂克隆形成能力明显增强(P＜0.01),NOD/SCID小鼠成瘤能力明显提高,CD44+细胞百分比增加,Ep-CAM蛋白表达量明显增高(P＜0.01),上皮细胞标记物E-Ca表达明显降低(P＜0.01),而间质细胞标记物N-Ca和Vim表达明显增高(P＜0.01).结论 悬浮培养法富集结直肠癌CSCs可能与诱导EMT有关.     

转化生长因子-β1Ⅱ型受体同源序列1对瘢痕疙瘩中成纤维细胞胶原合成的影响

目的　初步探讨转化生长因子 - β1(TGF - β1)Ⅱ型受体同源序列 1(TRH1)的生物学功能。　方法　根据已知序列合成TRH1多肽 ,以瘢痕疙瘩成纤维细胞为靶细胞 ,分别于蛋白水平和mRNA水平检测该多肽对TGF - β1所诱导的细胞胶原合成的拮抗作用。　 结果　TRH1可以明显抑制TGF - β1所诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原合成及细胞Ⅰ型前胶原mRNA的表达。结论　TRH1可能通过模拟TGF - β1Ⅱ型受体的结构来竞争性结合TGF - β1,从而拮抗或降低了TGF -β1对细胞的诱导作用。     

miRNAs在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的观察miRNAs在人骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达情况。方法以从骨髓中分离培养的人骨髓MSC为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),经多聚腺苷酸化和5'连接子连接后进行反转录,扩增克隆到得到大约109bp的DNA片段,测序后经生物信息学分析确定miRNAs的表达情况。选取部分miRNAs和新发现miRNAs,合成相应探针,与从人骨髓MSC、人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106中分离出的小片段RNA进行杂交验证(Northernblot)。结果成功从骨髓中分离培养出骨髓MSC,流式细胞仪检测93%以上的MSC表达CD44,但不表达CD34、CD45。从MSC中克隆测序得到194个克隆体,经生物信息学分析发现52个miRNAs(27种),其中包括26种已知的miRNAs和1种Nature杂志预测的miRNAs(PRE-DICTED-miR-202)。选取4条miRNAs(miR-495、miR-34a、miR-17-5p和PREDICTED-miR-202)进行Northernblot验证,发现它们均在MSC中表达。其中miR-34a和PREDICTED-miR-202只表达于MSC,miR-495在MSC和SOSP-9607中表达,miR-17-5p在3种细胞中均有表达。结论筛选出了在人骨髓MSC中表达的miRNAs,为miRNAs参与调控MSC的自我更新提供了依据,同时为miRNAs在干细胞中的潜在应用奠定了基础。     

HMGB1促进人骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

目的：构建人高迁移率族蛋白（HMGB1）全长编码基因的原核表达载体，诱导和纯化重组蛋白，分析其对人骨髓间充质干细胞的迁移作用。方法：RT—PCR方法从人的单个核细胞中扩增出HMGB1全长编码基因，克隆于原核表达载体pET-24a—d（＋），经IPTG诱导表达，通过亲和层析方法纯化得到携带（His）。标签的HMGB1融合蛋白；RT—PCR方法检测间充质干细胞HMGB1受体的表达；观察HMGB1对人骨髓来源间充质干细胞的迁移作用。结果：构建了融合蛋白HMGB1的原核表达载体，获得了高度纯化的HMGB1融合蛋白。RT-PCR方法检测到间充质干细胞表达HMGB1的某些受体如RAGE和TLR-4。HMGB1在体外能够诱导人骨髓来源的间充质干细胞的迁移。结论：重组HMGB1蛋白能够诱导骨髓间充质干细胞的迁移，此作用有可能通过RAGE和（或）TLR-4介导。     

骨髓间充质干细胞对大鼠肺组织胶原的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞(MSCs)对博来霉素(BLM)引起的肺损伤大鼠肺组织胶原的影响,初步探讨其作用机制。方法:将SD大鼠MSCs异体注入受体大鼠体内,2周后观察肺组织病理学变化,同时检测肺组织羟脯氨酸含量及转化生长因子β1(TGFβ1)、血小板源性生长因子-A、B(PDGF-A,B)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)mRNA的变化。结果:MSCs的植入可使增生的大鼠肺泡间隔、基质胶原及Ⅰ、Ⅲ型胶原明显降低,使升高的肺组织羟脯氨酸及TGFβ1、PDGF-A,B、及IGF-ⅠmRNA的表达显著降低。结论:MSCs可减少肺损伤大鼠肺组织中的胶原含量,此作用与MSCs降低了多种促纤维化细胞因子的表达有关。     

miR-424在人骨髓间充质干细胞分化过程中的表达

目的 筛选可作为人骨髓间充质干细胞(MSCs)分子标记物的microRNA(miRNA).方法 以从骨髓中分离培养的MSCs及其诱导分化的成骨细胞和软骨细胞为实验对象,利用基因芯片检测miRNA的表达情况,由芯片显著性分析(SAM)得到MSCs较其诱导分化细胞高表达的miRNA,再由实时定量PCR进行验证.结果 成功分离培养出MSCs,并分别诱导其分化为成骨细胞和软骨细胞;MSCs及由其诱导分化的成骨细胞和软骨细胞经miRNA芯片检测及SAM分析得到8个MSCs较由其诱导分化的成骨细胞高表达miRNA(has-miR-424、has-miR-34a、has-miR-593、has-miR-10a、has-miR-148a、has-miR-602、mmu-miR-709、mmu-miR-665),3个MSCs较由其诱导分化的软骨细胞高表达miRNA(has-miR-424、PREDICTED_MIR189、mmu-miR-665).其中MSCs较成骨细胞和软骨细胞均高表达的人源性miRNA为has-miR-424,差异倍数分别为6.6倍和4.4倍;在原样本中对进行实时定量PCR的验证,结果提示与诱导分化的成骨细胞相比,MSCs中的has-miR-424表达升高约3.6倍,而与诱导分化的软骨细胞相比,MSCs中的has-miR-424表达升高约3.1倍,结果与芯片结果相符合.结论 MSCs较其诱导分化细胞高表达的miRNA有望成为人骨髓间充质干细胞的一种特异性的分子标记物,这些miRNA对MSCs自我更新和未分化状态起着重要的维持作用.     

自体骨髓间充质干细胞注射治疗骨不连19例

目的 评价自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合纤维蛋白胶注射治疗骨不连的有效性.方法 从患者髂前上棘抽取骨髓10 ml,体外分离、培养、扩增获取BMSCs,与纤维蛋白胶混合后经皮注射治疗19例骨不连.所有患者均定期随访,随访时间5～24 个月,平均10.7个月.结果 注射后6个月,14例达到临床及放射学骨折愈合标准,骨折愈合时间3～6 个月,平均4.1个月.其余5例无骨折愈合征象,视为失败.注射后未发生感染,未出现供区并发症. 结论自体BMSCs复合纤维蛋白胶注射疗法可有效地治疗骨不连.     

骨髓间充质干细胞对异体淋巴细胞增殖的负调控作用及其机制的探讨

目的：研究成人骨髓间充质干细胞（mesenehymalstemeeHs，MSCs）的免疫调节作用及其作用机制。方法：从成人骨髓中分离、培养问充质干细胞，并通过其形态的均一性及流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度。将分离培养的间充质干细胞培养上清置于96孔板中，与经分离的异体淋巴细胞共培养3d，以单独培养的异体淋巴细胞为对照组，加入植物凝血素（PHA）刺激72h，用MTT还原法测定细胞增殖，观察成人骨髓MSCs培养上清对异体淋巴细胞增殖转化的影响。结果：成人骨髓MSCs培养上清抑制异体淋巴细胞增殖转化。两者差异有显著性（P〈0．05），其增殖转化抑制率为9．00％。在有PHA刺激淋巴细胞增殖的情况下，细胞增殖活性进一步下降，两者差异显著（P〈0．01），其增殖转化抑制率达20．91％。结论：成人骨髓MSCs抑制异体淋巴细胞增殖转化，其作用机制部分为非细胞接触作用所致。推测可能是MSCs通过分泌某些可溶性细胞因子而发生作用。     

骨髓间充质干细胞对大鼠皮肤损伤促愈作用的研究

目的：研究骨髓间充质干细胞（MSCs)对大鼠皮肤损伤所发挥的促愈作用。从而为临床皮肤损伤修复提供新的种子细胞来源。方法：体外培养扩增雄性Wistar大鼠的骨髓MSCs，选择雌性Wistar大鼠30只制作皮肤损伤模型，并随机分为MSCs-胶原膜组（接种细胞胶原膜组，A组），单纯胶原膜组（B组）和自然愈合组（对照组，C组），每组10只。采用创面大体观察、组织学检查和透射电镜等方法观察创面愈合情况，并结合原位杂交方法判定创面愈合过程中是否存在植入细胞。结果：伤后7，14d,3组中任何两组之间创口收缩率比较，差异均有非常显著性意义（P＜0．01），其顺序为A组＞B组＞C组；组织学检查显示，A组肉芽组织含量明显多于B、C组；电镜检查显示，A组受损皮肤接近正常；原位杂交结果表明，移植后7，21，27d,A组均可检测到雌性Wistar大鼠受损皮肤真皮层有雄性大鼠sry基因的表达。结论：MSCs可对皮肤损伤发挥明显的促愈作用。     

HGF基因修饰增强间充质干细胞的免疫抑制作用

目的：探讨HGF基因在间充质干细胞（mesenehymal stem cell，MSC）中过表达对细胞生物学的影响，为扩充MSC临床应用范围提供依据。方法：用携带HGF基因的重组腺病毒感染人骨髓来源的间充质干细胞后。与对照细胞相比，进行以下项目的检测：FCM测定细胞表型；MTT法测定细胞增殖能力；ALP和钙定量以及组织化学染色检测细胞体外成骨和成脂肪能力；^3H—TdR掺入法测定MSC—HGF对混合淋巴细胞反应中效应细胞增殖活性的抑制作用。结果：HGF基因转染后MSC表型、体外增殖和分化能力无改变；混合淋巴细胞反应中，MSC—HGF对异基因抗原诱导的淋巴细胞增殖活性的抑制效应存在剂量依赖关系；MSC—HGF／MSC与效应细胞比例为1：80时，MSC组淋巴细胞增殖活性（cpm值）降低19．8％，MSC—HGF组降低68．3％，抑制率是MSC组的3．45倍。结论：HGF基因转染的人骨髓MSC仍维持固有的增殖和分化能力，而对体外细胞免疫反应具有更强的抑制效果，提示MSC—HGF在造血干细胞移植和器官移植中的潜在应用价值。     

骨髓间充质干细胞促进前交叉韧带重建后腱-骨愈合的生物力学研究

目的 观察骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs)移植对兔前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)重建后移植物与骨道愈合的影响.方法 选择24只新西兰大白兔,取自体同侧部分腓肠肌腱作为移植物,构建ACL重建模型,双后肢均纳入研究,一侧使用混合bMSCs的纤维蛋白胶包裹移植物(bMSCs组),对侧后肢单纯使用纤维蛋白胶包裹移植物(对照组).分别于术后2,4,6,8周取材检测腱-骨界面的断裂强度和刚度. 结果 bMSCs组和对照组腱-骨界面的断裂强度和刚度均随修复时间延长呈上升趋势,其中实验组腱-骨界面的断裂强度和刚度自第6周始明显高于对照组(P＜0.05). 结论 bMSCs移植可明显提高兔ACL重建后早期腱-骨界面的断裂强度和刚度,促进移植物与骨道早期愈合.