PEMT2过表达增强大鼠肝癌细胞cAMP的表达

目的：在大鼠肝癌细胞株CBRH-7919中研究磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶2（PEMT2）过表达对cAMP表达量的影响。方法：利用基因转染技术建立PEMT2过表达的大鼠肝癌细胞株,用免疫细胞化学法观察cAMP的表达情况,用[^3H]-cAMP掺入法测定cAMP的含量,用流式细胞术分析细胞周期的变化,并与原代培养大鼠肝细胞比较。结果：cAMP在原代培养的肝细胞中表达较高,在肝癌细胞中含量均较低,PEMT2高表达可明显提高肝癌细胞内cAMP的含量。结论：PEMT2表达抑制肝癌细胞的生长可能与cAMP介导的信号转导通路加强有关。     

pemt2-cDNA的转染抑制大鼠CBRH-7919肝癌细胞c-Met及Bcl-2的表达并诱发凋亡

为探讨磷脂酰乙醇胺 N 甲基转移酶 2 (phosphatidylethanolamine N methyltransferase 2 ,PEMT2 )的转染抑制大鼠肝癌CBRH 7919细胞增殖的分子机理 ,构建了带有完整的pemt2 cDNA基因质粒载体 ,经转染和鉴定 ,确知其在大鼠肝癌细胞系CBRH 7919细胞中稳定高表达 .用细胞培养、免疫细胞化学、Western印迹、流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳等技术研究c Met(HGF的受体 )及抗凋亡蛋白Bcl 2在此过程中的表达和是否诱发凋亡 .免疫组织化学及Western印迹分析显示在转染高表达细胞中 ,c Met及Bcl 2的表达下调 .流式细胞仪分析表明 ,在转染pemt2 cDNA的高表达细胞中 ,G1期细胞增加 ,S期细胞减少 ,并在G0 期出现一个凋亡峰 .琼脂糖凝胶电泳谱显示梯状条带 .结果表明 :pemt2的转染可使大鼠肝癌细胞的c Met及Bcl 2的表达下调 ,并发生凋亡 .     

PI3K/Akt信号通路的调控与肿瘤血管生成

肿瘤对人类的生存危害极大,恶性肿瘤的治疗一直是世界性的难题。肿瘤血管生成是肿瘤赖以生长、转移的基础,受多种因子的调节。目前发现有多条信号网络参与调控肿瘤血管生成,PI3K/Akt是其中比较重要的一条信号传导途径,该通路与肿瘤的发生发展密切相关。本文介绍了PI3K/Akt信号通路的结构组成与活性调控,并重点阐述PI3K/Akt信号途径与肿瘤血管生成的关系。     

pLNCX-pemt2重组载体的构建ptpemt2基因在大鼠肝癌CBRH-7919细胞中的表达

为进一步研究pemt2对肝癌细胞生长抑制的作用机制提供方便的实验模型,构建了pLNCX-pemt2重组体.将目的基因pemt2连接入含有neo抗性基因的真核细胞表达载体pLNCX中,构建pLNCX-pemt2重组子,并用磷酸钙沉淀法将其转入大鼠肝癌CBRH-7919细胞中,应用PCR、Western印迹及[3H]SAM参入等技术对其转染、表达及活性进行鉴定.转染pLNCX-pemt2的大鼠肝癌细胞,PEMT2成功表达(分子量为22.5kD);高表达克隆PEMT2的表达量对照组高约5倍,其活性比对照组高2.1倍;细胞生长的倍增时间从21.54±7.08h延长到43.22±7.11h.结果表明,pLNCX-pemt2重组体转入肝癌细胞后,PEMT2蛋白得到高效表达,明显抑制肝癌细胞生长.     

pLNCX-pemt2重组载体的构建及pemt2基因在大鼠肝癌CBRH-7919细胞中的表达

为进一步研究 pemt2对肝癌细胞生长抑制的作用机制提供方便的实验模型 ,构建了p LNCX- pemt2重组体 .将目的基因 pemt2连接入含有 neo抗性基因的真核细胞表达载体 p LNCX中 ,构建 p LNCX- pemt2重组子 ,并用磷酸钙沉淀法将其转入大鼠肝癌 CBRH- 791 9细胞中 ,应用PCR、Western印迹及 [3 H]SAM参入等技术对其转染、表达及活性进行鉴定 .转染 p LNCX- pemt2的大鼠肝癌细胞 ,PEMT2成功表达 (分子量为 2 2 .5k D) ;高表达克隆 PEMT2的表达量比对照组高约 5倍 ,其活性比对照组高 2 .1倍 ;细胞生长的倍增时间从 2 1 .54± 7.0 8h延长到 43.2 2± 7.1 1h.结果表明 ,p LNCX- pemt2重组体转入肝癌细胞后 ,PEMT2蛋白得到高效表达 ,明显抑制肝癌细胞生长 .     

PI3K/AKT信号通路与心力衰竭

丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase,AKT)是真核细胞中参与细胞信号转导的关键分子。目前已经证实PI3K(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/AKT信号通路在人类肿瘤、代谢紊乱、肾脏疾病以及精神障碍等疾病中发挥着重要的作用。近年来的研究还发现PI3K/AKT信号通路的激活会对心肌细胞的生长、代谢以及凋亡等活动产生影响,且该通路及其中的很多受体、激酶被证实与心力衰竭关系密切,这使该信号通路在心力衰竭的发病机制、诊断及治疗等方面的研究日益受到重视。总结PI3K/AKT的结构特点、相关信号转导机制及其与心力衰竭的关系将有利于更好地理解心力衰竭的发病机制。     

pLNCX-pemt2重组载体的构建及pemt2基因在大鼠肝癌CBRH-7919细胞中的表达

为进一步研究 pemt2对肝癌细胞生长抑制的作用机制提供方便的实验模型 ,构建了p LNCX- pemt2重组体 .将目的基因 pemt2连接入含有 neo抗性基因的真核细胞表达载体 p LNCX中 ,构建 p LNCX- pemt2重组子 ,并用磷酸钙沉淀法将其转入大鼠肝癌 CBRH- 791 9细胞中 ,应用PCR、Western印迹及 [3 H]SAM参入等技术对其转染、表达及活性进行鉴定 .转染 p LNCX- pemt2的大鼠肝癌细胞 ,PEMT2成功表达 (分子量为 2 2 .5k D) ;高表达克隆 PEMT2的表达量比对照组高约 5倍 ,其活性比对照组高 2 .1倍 ;细胞生长的倍增时间从 2 1 .54± 7.0 8h延长到 43.2 2± 7.1 1h.结果表明 ,p LNCX- pemt2重组体转入肝癌细胞后 ,PEMT2蛋白得到高效表达 ,明显抑制肝癌细胞生长 .     

大蒜素通过抑制PI3K/Akt通路保护结核分枝杆菌感染小鼠模型免疫功能的机制

探讨大蒜素（allicin,ALC）通过磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路对结核分枝杆菌感染小鼠模型（PTB）的影响。

将54只SPF级小鼠随机分为对照组（CK组）、PTB组、低剂量ALC组（ALC-L组,2 mg/kg）、高剂量ALC组（ALC-H组,5 mg/kg）、阳性对照异烟肼组（INH组,5 mg/kg）和ALC-H+740 Y-P（PI3K激活剂）组（5 mg/kg+0.02 mg/kg）,每组9只。除CK组外,其他组小鼠均通过尾静脉注射0.25 mL标准人型结核分枝杆菌菌株H37Rv悬液构建PTB模型,建模成功24 h后,进行给药处理,1次/d,持续30 d。分别在给药第1、15、30天时记录各组小鼠的体质量;计数肺组织中结核分枝杆菌数量;采用HE染色检测小鼠肺组织病理变化;采用ELISA法检测小鼠肺组织中炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）及IL-10水平;采用流式细胞术检测小鼠外周血中T淋巴细胞亚群CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺水平以及CD4⁺/CD8⁺比值;采用Western Blot检测p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白表达。

与CK组比较,PTB组小鼠体质量（给药第15、30天）减轻,结核分枝杆菌数量增多,肺组织病理损伤严重,TNF-α、IL-6、CD8⁺水平以及p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达升高,IL-10、CD3⁺、CD4⁺水平以及CD4⁺/CD8⁺比值降低（均P＜0.05）;与PTB组比较,ALC-L组、ALC-H组和INH组小鼠对应变化趋势与上述相反（均P＜0.05）;740 Y-P减弱了高剂量ALC对PTB小鼠炎症反应的抑制作用以及免疫功能的改善作用。

ALC可能通过抑制PI3K/Akt通路保护结核分枝杆菌感染小鼠模型的免疫功能。

     

PI3K/AKT通路在动物葡萄糖代谢中的研究进展

葡萄糖代谢稳态对维持动物健康水平至关重要.磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)和G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)共同调控的下游效应因子.它能够磷酸化磷...     

尼古丁通过PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬诱导BEAS-2B细胞凋亡

吸烟是慢性呼吸系统炎症疾病最主要危险因素.尼古丁是烟草烟雾中最主要成分,与尼古丁相关的慢性呼吸系统疾病的发病率与日俱增.因此,寻找与尼古丁相关的慢性呼吸系统炎症疾病的潜在靶点是急需解决的问题.本研究旨在探究尼古丁对BEAS-2B细胞凋亡的影响及其潜在作用机制.采用蛋白质印迹法检测各组中的细胞内凋亡、自噬和PI3K/Ak...     

PI3K和Akt蛋白在异丙肾上腺素所致大鼠心肌肥厚中的表达

目的研究异丙肾上腺素(ISO)致大鼠心肌肥厚中PI3K和Akt在心肌组织中的表达,为探讨心肌肥厚的信号转导机制和逆转心肌肥厚提供形态学资料.方法健康成年SD大鼠20只,随机分为实验组、对照组,每组10只.实验组给予异丙肾上腺素处理.1周后处死大鼠,取心肌组织,常规石蜡切片,HE染色,观察心肌组织的病理变化,测量心肌肥厚指标;免疫组织化学染色和免疫荧光染色,检测p-PI3K和p-Akt的表达及分布.结果实验组大鼠心肌肥厚指标与对照组相比均明显升高;免疫组织化学检测显示,实验组心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达面积和平均光密度较对照组高.免疫荧光检测实验组心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达较对照组高.结论小剂量持续给予 ISO 能建立大鼠心肌肥厚模型;p-PI3K和p-Akt蛋白表达均与心肌肥厚的发生和发展过程相关,PI3K/Akt信号通路激活,可能是导致心肌肥厚的机制之一.     

沉默脂肪细胞增强子结合蛋白2通过PI3K/Akt途径抑制肝癌细胞增殖和迁移

脂肪细胞增强子结合蛋白2(AEBP2)作为多梳抑制复合物2(PRC2)的组成蛋白质,参与多种肿瘤细胞的增殖和迁移,然而其在肝癌中的作用尚不清楚。本研究基于UALCAN和Kaplan-Meier Plotter数据库分析发现,AEBP2在肝癌组织中高表达,并且与患者的不良预后呈正相关。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹结果证实,AEBP2在肝癌细胞中的表达高于正常肝细胞。在HepG2和Huh-7细胞中转染AEBP2 siRNA,平板克隆、CCK-8、流式细胞术、划痕愈合和Transwell结果显示,沉默AEBP2可以抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡(P＜0.05)。免疫荧光检测和蛋白质印迹结果显示,沉默AEBP2能够抑制肝癌细胞上皮-间质转化(EMT)(P＜0.05)。生物信息学分析结果表明,AEBP2参与调控PI3K/Akt信号通路。蛋白质印迹结果证实,沉默AEBP2能下调PI3K、p-AKT (S473)、mTOR、MMP-2和MMP-9的蛋白质表达水平(P＜0.05)。此外,沉默AEBP2对HepG2细胞迁移和侵袭的影响可被PI3K/Akt通路激动剂胰岛素样生长因子1(IGF-1)部分逆转(P＜0.01)。综上所述,AEBP2可能通过调节PI3K/Akt途径促进肝癌细胞增殖和迁移。本研究为AEBP2在肝癌中的作用提供理论依据。     

PI3K信号通路通过Skp2、p27调节肝癌细胞的增殖

探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路调节肝癌细胞增殖的机制.用LY294002特异性阻断PI3K信号通路后,人肝癌细胞(SMMC-7721)的增殖明显被抑制.RT-PCR及蛋白质印迹结果显示,LY294002增加了p27蛋白的表达,但不影响p27的mRNA表达.在LY294002处理的细胞中转入p27的RNAi质粒以干扰p27蛋白的表达后,肝癌细胞的增殖能力可部分恢复.放线菌酮(Chx)处理实验表明,阻断PI3K信号通路使p27蛋白的半衰期延长,稳定性增加.进一步研究发现,LY294002可抑制介导p27蛋白降解的关键分子Skp2的mRNA表达,还可缩短Skp2蛋白的半衰期,降低Skp2蛋白的稳定性.但在SMMC-7721中分别转染PI3K下游重要靶分子Akt的持续激活和失活突变体,却并不影响p27蛋白的表达.这些结果表明,PI3K信号通路在转录及翻译后水平调节Skp2的表达而影响p27蛋白的降解,从而调节肝癌细胞的增殖,但Akt并没有参与这种调节.     

Downregulation of the PI3K/Akt survival pathway in cells with deregulated expression of c-Myc

Oncogenic transformation leads to an increased sensitivity to apoptosis, a characteristic that is selectively lost during tumor progression. The sensitization process affects the mitochondrial pathway of apoptosis through signaling events that are poorly defined. We previously showed that a deregulated expression of c-Myc in cells treated with toxic agents caused an enhanced activation of p38 that acts in a death-promoting pathway. Here, we show that deregulated expression of c-Myc causes a severe reduction in the basal activity of Akt, which was further accelerated by serum deprivation. Furthermore, c-Myc expression repressed the activation of Akt induced by the toxic agents doxorubicin, cisplatin and H₂O₂, and also by the physiological agonists PDGF and insulin. We determined that the activation of Akt was inhibited as a result of the action of c-Myc upstream of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) activation. c-Myc overexpression impaired the induced association of the p85 subunit of PI3K with phosphotyrosine containing proteins, causing a reduction in the activation of PI3K and recruitment of Akt to the membrane. Inhibiting Akt in addition to enhancing p38 further exacerbate the imbalance between the death and survival signals and results in an enhanced sensitivity to apoptosis. This study was supported by the Canadian Institutes of Health Research Grant MOP-37860 to J.L. and K.B. and the Canada Research Chair in Stress Signal Transduction (to J.L.).     

AZD9291 promotes autophagy and inhibits PI3K/Akt pathway in NSCLC cancer cells

AZD9291, a third-generation epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI), is highly selective against EGFR T790M-mutant non–small cell lung cancer (NSCLC). On investigating the growth inhibitory effects of AZD9291 on NSCLC and the underlying mechanism, we found that AZD9291 can trigger autophagy-mediated cell death in both A549 and H1975 cells by increasing the expression of phosphatidylethanolamine-modified microtubule-associated protein light-chain 3 (LC3) and decreasing the expression of p62. In the presence of the autophagy inhibitor chloroquine, the AZD9291-induced increase in LC3 level was further augmented. AZD9291 decreased the levels of phosphoinositide-3 kinase (PI3K), protein kinase B (Akt), and phosphorylated Akt. AZD9291-induced cell death was enhanced by Akt knockdown, and the levels of both EGFR and phosphorylated EGFR were decreased by AZD9291. AZD9291 was also found to significantly suppress the tumor growth in H1975 xenograft nude mice. Thus, AZD9291 was found to induce autophagy, decrease in EGFR levels, and show a strong inhibitory effect on NSCLC both in vitro and in vivo. Furthermore, the PI3K/Akt signaling pathway was found to play a critical role in AZD9291-induced cell death.     

体外缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡发生的机制研究

目的：研究体外大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）在缺血缺氧条件下发生凋亡的作用机制。方法：采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞（MNCs）,于体外培养并由牛垂体提取物（PEX）诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞（MSCs）。经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,骨髓间充质干细胞（BMSCs）在缺血缺氧条件下培养,通过Annexin V／PI双染细胞凋亡检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法（western blot）来观察细胞中蛋白的变化。结果：①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功。②对照组（无缺血缺氧）与缺血缺氧组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,而通过磷酸化Akt的表达量显著性增加提示PI3K（Phosphoinositide-3kinase）／Akt（ProteinkinaseB,PKB）信号通路被激活（P〈0．05）;同时缺血缺氧组与缺血缺氧＋PI3K／Akt抑制剂（LY294002）组比较,缺血缺氧＋PI3K／Akt抑制剂（LY294002）组的凋亡率显著降低,而通过磷酸化Akt的表达量显著减少提示PI3K/Akt信号通路被抑制（P〈0．05）。结论：PI3K／Akt信号通路对体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞凋亡发生有关键性作用。     

BMP2 accelerates the motility and invasiveness of gastric cancer cells via activation of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt pathway

Up-regulation of bone morphogenetic proteins (BMPs) and their receptors by tumor is an important hallmark in cancer progression, as it contributes through autocrine and paracrine mechanisms to tumor development, invasion, and metastasis. Generally, increased motility and invasion are positively correlated with the epithelial-mesenchymal transition (EMT). The purpose of the present study was to determine whether BMP-2 signaling to induce gastric cancer cells to undergo EMT-mediated invasion might pass through the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt pathway. Herein we showed that gastric cancer cell lines express all the components of BMP-2 signaling, albeit to different extents. Moreover, an increased concentration of BMP-2 strongly enhanced motility and invasiveness in gastric cancer cells, whereas no increase was observed in cells treated with either Noggin (a BMP-2 inhibitor) or BMP-2 blocking antibodies. The stimulation of BMP-2 in gastric cancer cells induces a full EMT characterized by Snail induction, E-cadherin delocalization and down-regulation, and up-regulation of mesenchymal and invasiveness markers. Furthermore, blockade of BMP-2 signaling by Noggin or BMP-2 blocking antibodies also restored these changes in EMT markers. In addition, phosphorylation of Akt was also enhanced by treatment with BMP-2, but not Noggin or BMP-2 blocking antibodies. Pretreatment of gastric cancer cells with PI-3 kinase/Akt kinase inhibitor (kinase-dead Akt [DN-Akt], Akt siRNA, or LY294002) significantly inhibited BMP-2-induced EMT and invasiveness. Overall, our studies suggest that BMP-2 promotes motility and invasion of gastric cancer cells by activating PI-3 kinase/Akt and that targeting of this signaling pathway may provide therapeutic opportunities in preventing metastasis mediated by BMP-2.     

体外缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡发生的机制研究

目的:研究体外大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在缺血缺氧条件下发生凋亡的作用机制。方法:采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞(MNCs),于体外培养并由牛垂体提取物(PEX)诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞(MSCs)。经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧条件下培养,通过Annexin V/PI双染细胞凋亡检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法(western blot)来观察细胞中蛋白的变化。结果:①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功。②对照组(无缺血缺氧)与缺血缺氧组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,而通过磷酸化Akt的表达量显著性增加提示PI3K(Phosphoinosi-tide-3kinase)/Akt(ProteinkinaseB,PKB)信号通路被激活(P<0.05);同时缺血缺氧组与缺血缺氧+PI3K/Akt抑制剂(LY294002)组比较,缺血缺氧+PI3K/Akt抑制剂(LY294002)组的凋亡率显著降低,而通过磷酸化Akt的表达量显著减少提示PI3K/Akt信号通路被抑制(P<0.05)。结论:PI3K/Akt信号通路对体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞凋亡发生有关键性作用。