供体细胞与哺乳动物体细胞核移植

哺乳动物体细胞核移植(克隆)技术在转基因动物生产、珍稀动物资源复原与保护、生物学基础研究等方面业已显示出重要的应用价值,而目前该技术还与诱导多能干细胞技术一同被认为是创制患者特异性多能干细胞,为再生医学临床"细胞治疗"提供素材的最佳手段。但是,体细胞克隆的效率仍不理想,关键机制还不清楚,严重制约了该技术的推广。因此,如何提高克隆效率已成为人们普遍关心的首要问题。在体细胞克隆技术所涉及的各环节中,供体细胞是影响克隆效率的最关键因素之一。该文从供体细胞的生物学因素和技术因素两方面进行了回顾,旨在为进一步探寻建立物种或供体细胞个性化准备方案,为提高动物克隆效率提供参考。     

哺乳动物体细胞核移植研究现状及应用前景

扼要介绍了继世界首例体细胞克隆羊诞生后,哺乳动物体细胞核移植技术在最近3年内取得的研究进展、目前存在的问题及应用前景。     

体细胞核移植胚胎核重编程的研究进展

尽管在多种哺乳动物种系中成功制备了体细胞克隆后代,但当前的克隆技术仍有许多亟待解决的问题。体细胞核移植胚胎大多存在许多发育异常,造成了妊娠早期高流产率和出生后高死亡率。有研究认为,克隆胚胎发育障碍的一个重要的原因是供体细胞的遗传重编程不完全。哺乳动物种系中,DNA甲基化是胚胎发育期转录调节的必需步骤,除了单拷贝基因序列外,在基因组很多的区域都可以观测到克隆胚胎的异常甲基化。此外,克隆胚胎的基因印迹也存在异常。     

细胞核重编程对克隆的影响

细胞核重编程是哺乳动物正常受精胚胎和克隆胚胎发育过程中的一个重要特性,主要是对表观遗传学特征进行重新编写,包括染色质重塑、组蛋白修饰、DNA甲基化、印记基因表达、X染色体失活等表观遗传修饰的改变。通过细胞核重编程,首先,受精卵和克隆胚胎的供体核停止其特有的基因表达程序,恢复为全能状态的基因表达程序;然后,受精胚胎和克隆胚胎的细胞再从全能状态重新进入分化状态,最终形成各种组织和器官。近年来,不少研究表明,克隆胚胎的细胞核重编程存在不同程度的表观遗传修饰异常,可能对克隆及其农业和医学应用有着重要影响。本文就正常和克隆胚胎细胞核重编程的研究进展以及克隆胚胎的细胞核重编程异常对克隆的影响作一综述,并对目前有关治疗性克隆前景的不同看法进行了讨论。     

体细胞核移植诱导的表观遗传学变化

体细胞核移植技术是指将一个分化的体细胞核置入去核的卵母细胞中,并发育产生与供体细胞遗传背景一致的克隆后代的技术。目前,世界上通过体细胞核移植技术已经产生了许多的克隆动物。但克隆过程中还存在着很多问题,比如,克隆效率太低、克隆个体常伴有表型异常和早亡等,从而使该技术应有的应用潜力不能得到充分的发挥。体细胞表观遗传学重编程的不完全或紊乱是造成核移植诸多问题的主要原因。近十多年来,人们对体细胞核移植后的重编程进行了广泛的研究,其核心内容包括核及核外结构的重塑、DNA甲基化模式的重建、基因印迹和x染色体失活、组蛋白乙酰化模式的重建、端粒长度恢复等,以期能够对其重编程加以人为干预,从而提高动物克隆效率。本文拟对体细胞核移植诱导的重编程研究进展加以综述,希望对体细胞重编程机制的阐明有所启发。     

哺乳动物体细胞核移植中供体细胞的研究进展

在哺乳动物体细胞核移植中,供体细胞是影响其效率的主要因素之一。供体细胞的类型、细胞周期、细胞的培养代数、冷藏与冷冻处理,以及供体动物的性别、年龄等都可能影响核移植胚胎的发育。根据现有资料,简要综述了在哺乳动物体细胞核移植中有关供体细胞的研究进展。     

DNA甲基化修饰与体细胞核移植的关系

成功的体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）有赖于供体细胞的基因组通过重编程恢复到支持胚胎发育的全能性状态。但是,相比起自然受精后发生的重编程来说,要诱导一个已经分化的供体细胞重编程为全能性状态,往往在时间上和程度上都是迟滞的和不完全的。同时,DNA甲基化状况又是影响克隆胚胎发育和基因表达的关键因素之一。因此,深入研究主导DNA甲基化修饰的分子机理,探讨DNA去甲基化在供体细胞重编程过程中扮演的角色,从而进一步提高供体细胞重编程效率,提高克隆胚的发育潜能,这对于体细胞核移植效率的提高具有重要的意义。     

维生素C与体细胞核移植介导的重编程

维生素C (vitamin C,VC)是一种常见的天然小分子,可作为抗氧化剂在各种生化反应中发挥重要作用.近年来有研究发现,体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)胚胎的发育率在VC的存在下可以显著提高,其中一个重要的原因可能是VC参与了DNA和组蛋白的去甲基化,使供体细胞...     

猪体细胞核移植的研究进展和影响因素

自2000年Polejaeva IA获得第1头克隆猪后,短短几年时间全世界已有10多例成功的报道,使得猪的体细胞核移植有了长足的发展,但目前猪的体细胞核移植效率依然低下（1—2％）,人们对核移植中重编程分子机理的认识知之甚少。简要综述了猪体细胞核移植近年来的研究进展,就猪核移植中的技术难点和影响因素进行了分析,涉及供体细胞种类的选择、体外长期培养和高压筛选对随后核移植的影响以及供核细胞细胞周期的选择,核质双方的协调,去核和注核方法的选择,融合和激活程序的优化,妊娠的维持等。     

体细胞核移植与中心体遗传

体细胞克隆虽然在多种哺乳动物中成功获得后代, 但仍存在一系列的问题需要解决。克隆胚胎的发育能力由核移植后几小时内的细胞和分子过程决定, 包括染色体分离和纺锤体的重新组装。中心体的正常组成和分布能保证染色体分离的准确性及新生和出生后克隆动物发育过程中的基因组稳定性。文章在分析哺乳动物体细胞克隆存在的问题和简介中心体结构功能的基础上, 综述了中心体在配子和受精卵发育过程中的遗传机制, 同时阐述了体细胞克隆胚胎中心体及其相关蛋白的研究现状。     

体细胞核移植后表观遗传重编程的异常及其修复

体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)是指将高度分化的体细胞移入到去核的卵母细胞中发育并最终产生后代的技术。然而, 体细胞克隆的总体效率仍然处于一个较低的水平, 主要原因之一是由于体细胞供体核不完全的表观遗传重编程, 包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、基因组印记、X染色体失活和端粒长度等修饰出现的异常。使用一些小分子化合物以及Xist基因的敲除或敲低等方法能修复表观遗传修饰错误, 辅助供体核的重编程, 从而提高体细胞克隆效率, 使其更好地应用于基础研究和生产实践。文章对体细胞核移植后胚胎发育过程中出现的异常表观遗传修饰进行了综述, 并着重论述了近年来有关修复表观遗传错误的研究进展。     

体细胞起源的人胚胎干细胞

根据治疗性克隆假设,可以通过体细胞核移植技术获得与病人具同样基因型的细胞或组织。这样起源的细胞或组织植回病人将不会引起免疫排斥反应。本研究将5岁、42岁、52岁和60岁4个不同年龄的人体细胞核植入去核的兔卵母细胞中重新启动,发育至囊胚,并分离人胚胎干细胞。研究结果提示,年龄不影响体细胞被重新启动的效率。经过核型分析,同源染色体分析,原位杂交,PCR和免疫组化染色等多种鉴定,ntES细胞具有人染色体。ntES细胞可以长期增殖并保持不分化状态,也可以形成类胚体并分化出包括神经和肌肉在内的多种细胞类型。由类胚体诱导生成的混合细胞群体表达所有三个胚层(外、中、内胚层)细胞类型标记,说明ntES细胞具有分化成所有三个胚层的潜力。因此,从人体细胞核获得的ntES细胞与普通人胚胎干细胞一样具有向多种细胞类型分化的能力。     

体细胞核移植的研究进展

自从克隆羊多利问世以后,体细胞核移植有了较大的发展,陆续有新的动物克隆成功,但克隆的效率仍然较低。本文综述了体细胞核移植技术研究的进展情况,介绍了基因背景、核移植步骤、胚胎相关支持技术对核移植成功率的影响以及核移植技术中的基因修饰和对核重新程序化的最新认识。     

影响哺乳动物细胞核移植因素的分析

细胞核移植(nuclear transplatation)是克隆具有相同遗传基础的优秀家畜的有效方法。在不远的将来,它可能成为一个广泛应用的生物技术。这一生物技术,可以使一群体内的优秀个体迅速增殖,导致快速的遗传改良,在一个繁殖周期内,获得大量与亲本遗传性状完全一致的复制子代。同时,细胞核移植又是研究哺乳动物早期胚胎发育及细胞分化过程中的基因表达与调控,不同细胞周期内,细胞核与细胞质的相互关系及其作用机理等理论问题的理想手段。在对几种哺乳动物(如小鼠、兔、羊和牛等)进行的具有开拓性研究实验中,已经显示出,哺乳动物细胞核移植作为克隆动物的一项生物技术,是进行科学研究的重要手段,并有可能投入商品化。然而,目前只有20～40％通过细胞核移植后重组的胚胎能够发育成形态学正常的桑椹胚或囊胚,能够发育产仔的就更少。这说明存在一     

体细胞核移植后核重编程的影响因素

近年来,人类核移植胚胎干细胞建系成为一项炙手可热的研究,用再生医学的理念治疗退行性疾病及器官移植为这一研究带来无穷的魅力和生命力;但是核重编程仍是核移植技术的瓶颈,制约了重构胚胎干细胞的研究。核重编程是指供体细胞核移入卵母细胞后必须停止本身的基因表达程序并恢复为胚胎发育所必需的特定的胚胎表达程序。只有供核发生完全重编程,重构胚胎才能正常发育。核重编程与供核者的年龄,供核细胞的组织来源、分化状态、细胞周期、传代次数,供核的表遗传标记以及供卵者的年龄、卵子的成熟度等因素有关。一般来说,颗粒细胞作为核供体最易被核重编程。供核者为胎体或新生体,供核细胞处于低分化状态或已传数代,供核细胞经过去表遗传标记处理,供卵者性成熟且年龄轻、卵子核与胞浆都成熟等均为有利于核重编程的因素。重构胚胎的培养方法对核重编程也至关重要,目前主张使用序贯培养及体细胞化培养。创造各种适于核重编程的条件有利于从更高的起点开展核移植胚胎干细胞研究,提高重构胚胎干细胞建系效率。     

家兔胚胎细胞核移植的研究

本研究以兔为实验材料,对细胞核过程中显微操作、电融合、电活化以及移核胚的培养等基本问题进行了研究。对兔进行PMSG－hCG超数排卵,收集成熟母细胞和16－细胞胚;后者经胰蛋白酶消化,去除胶膜和透明带,在不含Ca62 、Mg^2 的分离中分成单个卵裂球;然后,分别对两者做CB预处理;首次尝试采用WQilladsen法,去除卵母细胞核、并将单个卵裂球注入透明带,同时、与McGrath-Solter法进行比较;通过电融合使供体核进入去核的卵母细胞内;将所得移核胚在体外或在中间内体内培养并观察。结果表明：一、Willadsen法与McGrath-Solter法比较,核移植操作的成功率及以后的电融合率均无明显差异（Tab.1)。相对于后者,Willadsen法更简便、易于掌握并提高去核率。二、hCG超排注射后13－15h,观察卵母细胞发现：其中,67．8％保留有第一极体。此时的卵子若去除1／3胞质量,去核率可以达到58．3％。若推迟去核时间,第一极体退化,失去去核标志。三、比较不同电脉冲条件,发现强度为0．63kv/cm,持续160μs的一次电脉冲可获较高移核胚的融合率（70．8％）（Tab.2）;并可使61．1％的成熟卵母细胞活化。四、比较移核胚在体外和在中间有体内两种培养条件,前者只有34．6％能发育到6－8细胞期,而后者有23．0％能发育到桑椹胚或囊胚（Tab.3)。说明：需进一步优化家兔胚体外培养条件。     

克隆哺乳动物的胎盘发育缺陷

克隆又称体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT),该技术已在多种哺乳动物中成功建立并被逐渐应用。然而,利用该技术获得的哺乳动物克隆胚胎的发育效率非常低(一般只有1%~5%),这严重限制了克隆技术的应用。胎盘发育缺陷被认为是抑制克隆胚胎发育的一个主要原因。几乎所有的SCNT来源胎盘都会出现不同的发育缺陷,如胎盘增生、胎盘血管缺陷、脐带畸形等。胎盘异常的根本原因是滋养层细胞基因组在发育过程中未能建立正确的表观遗传修饰,导致胎盘发育调控相关的重要基因,特别是印迹基因的表达出现异常。印迹基因表达异常导致胎盘的形态异常和功能缺陷,进而影响克隆胚胎的发育能力。目前,虽然有许多提高克隆胚胎发育能力的研究报道,然而在大多数研究中克隆效率并没有得到大幅度的提高,主要原因之一是克隆胚胎的胎盘发育仍然存在诸多缺陷。本文综述了克隆哺乳动物的胎盘异常及其印迹基因表达,并对未来提高克隆效率的研究提出展望。     

兔体细胞核移植的初步研究

实验以兔胎儿成纤维细胞为核供体,对兔体细胞核移植技术的融合,激活和发育等环节进行了初步研究。实验通过比较不同电场强度对兔2细胞胚胎卵裂球融合以及卵母细胞激活的影响,证实200和260V/mm的电场强度可有效地诱导2细胞胚胎的融合和兔卵母细胞的孤雌激活。然后将200和260V／mm电场强度用于体细胞核移植,融合率分别为44．4％和48．4％,卵裂率分别为58．8％和53．8％,桑椹胚／囊胚发育率分别为5．9％和5．5%。但112枚核移植胚胎移植到5只受体后没有幼子出生。结果表明,实验中所建立的程序至少可以支持兔体细胞克隆胚胎的早期发育。     

硬骨鱼类细胞核移植的研究进展

自１９９７年世界首例体细胞核移植绵羊“多莉”诞生以来,动物细胞核移植引起世界范围内人们的关注。硬骨鱼类具有很多优点,是研究核移植良好的材料。作者综述了硬骨鱼类细胞核移植技术的发展和完善以及在核质互作、细胞核发育全能性、鱼类育种及纯系建立等方面的应用,并对鱼类核移植存在的问题和前景进行了概括。     

诱导多能干细胞研究进展

成熟的体细胞过表达转录激活因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc能够转化为具有多能性的干细胞,称为诱导多能干细胞。类似于胚胎干细胞,诱导多能性干细胞具有自我更新和多向分化潜能性两个主要特征。同胚胎干细胞相比,诱导多能干细胞不仅能够为以细胞替代治疗为核心的再生医学提供无限的细胞来源,而且有望解决胚胎干细胞临床开发面临的伦理道德及免疫排斥问题。从诱导多能干细胞技术的建立、重编程的机理及其在临床中的应用几方面作简要综述。