关于HCV不同区段抗原的反应性研究

目的　探讨各种丙型肝炎病毒 (HCV)抗原在诊断中的作用及其与HCVRNA的关系。方法　利用HCV不同区段抗原抗 -HCV酶联免疫试验 (EIA)和逆转录聚合酶链反应法 (RT PCR) ,对不同临床型HCV患者进行检测。结果　各组患者均以抗 NS3和抗 C阳性率最高。但均有一定比例患者抗 NS4和抗 NS5阳性。与各单个片段抗 HCV阳性率相比 ,抗 HCV总抗体阳性率最高。结论　NS3和C抗原在检测抗 HCV中起很重要作用 ,但NS4和NS5抗原在抗 HCVEIA中的作用也不容忽视。联合应用不同区段HCV抗原将大大提高抗 HCVEIA试剂的灵敏度。     

3种丙型肝炎病毒抗体确证试剂检测结果的比较

目的比较不同丙型肝炎病毒(HCV)抗体确证试剂的质量差异。方法应用3种HCV抗体确证试剂(分别命名为确证试剂1、2、3,包括两种进口试剂和一种国产试剂),检测经HCV抗体酶联免疫试剂检测为HCV抗体阳性的45份人血浆样本。结果 45份样本中,确证试剂1、2和3检测阳性的样本分别为31、28和33份,3种确证试剂共同阳性样本28份,共同阴性样本9份,检测结果不一致样本8份;不同确证试剂由于包被的片段不同,检测HCV不同片段的能力不同,确证试剂1对NS3片段的阳性检出率最高,为33份;确证试剂2对NS5片段的阳性检出率最高,为19份;确证试剂3对NS4片段和Core片段的阳性检出率最高,分别为31和34份。结论选择HCV确证试剂,既要考虑不同试剂总体检出情况的灵敏度和特异性,又要考虑每种试剂对每个HCV片段的侧重性,这样才可以兼顾灵敏度和特异性之间的矛盾,使确证试剂真正发挥其在HCV感染诊断的确证作用。     

酶联免疫双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒抗体试剂的质量评价

目的评价酶联免疫双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗体试剂的质量。方法采用3个厂家间接酶联免疫法的HCV抗体试剂各1批(A-1、A-2、A-3)和酶联免疫双抗原夹心法的HCV抗体试剂各1批(B-1、B-2、B-3),分别检测经Ortho和Dia Sorin公司抗HCV EIA试剂、CHIRON公司RIBA HCV 3.0 SIA及MP Biomedicals Asia Pacific Pte公司确证试剂检测的304份血浆样本(抗-HCV阳性139份及抗-HCV阴性165份);并经HCV BLOT 3.0确证试剂检测HCV假阴性样本的抗体谱。结果试剂A-1、A-2、A-3的阳性检出率分别为95.0%、97.8%、97.1%,阴性检出率分别为98.2%、92.7%、95.2%;试剂B-1、B-2、B-3的阳性检出率分别为98.6%、98.6%、99.3%,阴性检出率分别为95.8%、95.8%、96.4%,总符合率分别为96.7%∶97%、95.1∶97%、96.1%∶97.7%,不同厂家酶联免疫双抗原夹心法的HCV抗体试剂灵敏度均有提高,两种酶联免疫法的6种HCV抗体试剂检测均有不同份数的假阳性样本出现,该6种HCV抗体试剂的特异性无显著差异(P0.05)。HCV假阴性样本抗体谱分析结果表明,各HCV抗体试剂均有漏检现象。结论酶联免疫双抗原夹心法检测HCV抗体试剂具有较高的灵敏度和特异性,可在献血源筛查中推广应用。     

丙型肝炎抗体确证试剂检测结果的分析

目的分析丙型肝炎抗体确证试剂的检测结果。方法用两种国外抗HCV确证试剂(RIBA和MP)分别对89份抗HCVEIA试剂(Ortho)检测为高值阴性或弱阳性样品进行检测,按试剂说明判定结果。并对两种确证试剂对4种丙肝分片段抗体的检出率进行比较。结果两种确证试剂RIBA和MP与Ortho试剂的总符合率分别为43.8%和47.2%,均出现了较多的不确定样品。两种试剂对丙肝NS3抗体和NS5抗体的检出率基本一致,MP试剂对丙肝核心抗体和NS4抗体的检出率显著高于RIBA试剂。结论对于不确定样品,最好结合临床症状及病人追踪检测进一步确诊。     

丙型肝炎病毒核心总抗原检测试剂的评价

目的评价国外丙型肝类病毒核心抗原检测试剂盒的质量以及窗口期检测核心总抗原(HCVcAgTrak-C)的意义。方法用该试剂检测8649份自然献血员及566份HCV可疑感染者血清的核心总抗原,并与抗体试剂(Anti-HCV)、游离抗原(HCVfreeAg)试剂、核酸(HCVRNA)试剂进行比较。结果筛出核心总抗原和抗体同时阳性血清152份,抗体阴性而总抗原阳性血清5份。利用RNA试剂检测这5份血清,结果HCVRNA阳性。利用HCVfreeAg试剂检测这9215份血清,发现2份阳性,其中1份为抗原和抗体同时阳性,RIBA检测确证这份血清产生的是核心区抗体。另1份为单独抗原阳性。结论在应用HCV抗体试剂对血液进行筛查的同时使用HCVcAg试剂检测,可以减少因窗口期造成的漏检。     

输血后丙型肝炎病毒NS4区抗体的动态变化及其诊断意义

利用重组NS4抗原及合成肽5－11抗原分别检测5例输血后丙型肝炎患者的系列血清136份，并与HCV总抗体及HCVRNA检测结果比较，发现抗NS4抗体的动态变化虽然有两种模式，但在多数情况下为一种模式，即抗体阳转后很少转阴，并且其动态变化基本与总抗体相似。同时发现2例病人抗NS4抗体阳转时间早于总抗体，因此，推测HCV检测试剂中增加NS4抗原可能对提高HCV诊断试剂的灵敏度有一定意义。     

HCV Ag或HCV RNA试剂用于筛查丙型肝炎病毒感染样本的性能比较

目的比较丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗原(HCV Ag)与HCV RNA试剂检测HCV感染的性能。方法应用ABBOTT ARCHITECT HCV Ag和Abbott RealTime HCV RNA试剂分别检测经Ortho和DiaSorin公司抗HCV EIA试剂以及CHIRON公司RIBA HCV 3.0 SIA和MP Biomedicals Asia Pacific Pte公司确证试剂检测的304份血浆样本(抗-HCV阳性139份,抗-HCV阴性165份)。结果 139份抗-HCV阳性样本中,HCV RNA和HCV Ag试剂的阳性检出率分别为54.0%(75/139)和27.3%(38/139),HCV RNA试剂敏感性明显高于HCV Ag试剂(P0.01);检测165份抗-HCV阴性样本中,HCV RNA和HCV Ag试剂检测均为阳性的样本有5份,分别检出7份和2份单独阳性样本,特异性分别为7.3%(12/165)和4.2%(7/165),差异无统计学意义(P0.05);应用HCV Ab+HCV RNA或HCV Ab+HCV Ag筛查HCV感染,阳性检出率分别为49.7%(151/304)和48.0%(146/304),差异无统计学意义(P0.05)。在94份HCV Ag和HCV RNA阳性样本检测中,HCV Ag试剂阳性率随样本HCV RNA载量的升高而增加,HCV RNA载量与检测HCV Ag阳性率呈正相关。结论 HCV Ag或HCV RNA作为HCV筛查的补充试验方法,可有效降低HCV Ab窗口期的漏检率。     

丙型肝炎病毒抗体分片段检测方法的建立

目的建立丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗体分片段检测方法。方法以葡聚糖T500为骨架,将亲和素和HRP标记于葡聚糖的不同位置上,再分别与含有生物素标签的HCV的核心抗原、NS3、NS4B、NS5反应(亲和素及HRP与HCV抗原的摩尔比均为1∶10),制备HCV抗原聚合物,同时结合免疫层析技术建立HCV抗体分片段检测方法。采用建立的方法检测100份正常人和100份HCV感染者的血清样本,分析层析膜上不同抗原条带组合出现的比例,计算特异度和灵敏度,根据特异度和灵敏度指标来确定阴阳性的判定标准。分别采用本实验建立的方法及商业化的蛋白芯片法检测196份临床血清样本,计算两种方法的符合率。结果 HCV抗体分片段检测方法检测200份临床标本的灵敏度为100. 0%,特异性为100. 0%,检测结果的判定标准为:2条带显色为阳性,1条带显色为可疑,需进一步确认。该方法与蛋白芯片法对196份临床血清样本的4种抗体片段检测结果符合率均达98. 0%以上。结论本研究成功建立了HCV抗体分片段检测方法,该方法具有良好的灵敏度及特异度,可用于HCV感染的诊断。     

不同化学发光免疫分析法的丙型肝炎病毒抗体检测试剂性能评估

目的评估不同化学发光免疫分析法的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗体检测试剂性能。方法采用HCV抗体检测试剂(化学发光免疫分析法)行业标准验证方式,应用国内外市场占有较大份额及方法有代表性的9种试剂,对HCV抗体国家参考品的65份[HCV抗体阴性参考品30份(编号N1~30)、阳性参考品30份(编号P1~30)、最低检出限参考品4份(编号L1~4)和重复性参考品1份]血浆样本进行检测,通过分析HCV抗体检测试剂(化学发光免疫分析法)行业标准各项性能要求,评估不同化学发光免疫分析方法的HCV抗体试剂性能。结果 9种试剂检测阴、阳性参考品符合率均为96.7%(29/30)~100%(30/30),仅有3种试剂检测参考品符合率均为100%(30/30);最低检出限均检出L1、L2、L3阳性,检出L4阴性;重复性检测S/CO值的变异系数(CV)在1.6%~11.1%之间,化学发光免疫分析的双抗原夹心法比间接法试剂对同一阳性样本检测的S/CO值高;相同项目同一试剂的稳定性试验与常温条件下检测结果基本一致,对每种试剂检测3个批号的批间精密度,S/CO值的CV在2.3%~12.5%之间。结论 9种试剂对HCV抗体检测试剂(化学发光免疫分析法)行业标准各项指标验证显示,不同化学发光免疫分析法的HCV抗体检测试剂性能基本一致。     

利用HCV多表位复合抗原制备高效价抗体

目的利用HCV多表位复合抗原免疫家兔制备高效价抗HCV多克隆抗体,为改进丙型肝炎病毒抗原的诊断试剂盒提供必要条件。方法HCV多表位复合抗原与完全弗氏佐剂混合免疫家兔,获得高效价抗血清,经硫酸铵沉淀及PrintA/G亲和层析纯化。结果已获得效价大于1∶16000的抗HCV多克隆抗血清,经纯化后达电泳纯。该抗体能与HCVNS3、NS5及C抗原特异性结合。结论HCV多表位复合抗原具有较好的免疫原性,可用于改进HCV病毒抗原诊断试剂。     

应用免疫印迹法分析丙型肝炎相关性抗体

应用两种免疫印迹法对二代ELISA测试的69份血清进行了追加试验。结果表明:8份ELISA阴性血清免疫印迹均阴性,61份ELISA阳性血清有1份免疫印迹阴性。ELISA假阳性率为1.67％。在60份免疫印迹阳性血清中,抗结构区(capsid),非结构区NS_3和NS_4抗体的阳性率分别为83％、93.3％和70％。其中丙型肝炎相关性抗体的分布,以抗capsid、NS_3、NS_4抗体都阳性为主(58.7％)。在输血后急性肝炎和肝细胞癌患者中。丙型肝炎相关性抗体的分布没有统计学上的差异。     

几家HCV抗体诊断试剂盒检测系列血清的比较

应用Abbott、UBI及国内几家的HCV第二代抗体诊断试剂盒A、B、c及D检测25名HCV感染者的210份感染后不同时期的系列血清,首次采用ELISA及RIBA分片段检测抗体,并与敏感的PCR法检测血清中HCV RNA结果相比较。虽然各试剂盒的总体检测符合率无显著性差异,但个别国产试剂盒的早期检测能力尚有待提高。用任何一家抗体检测试剂盒均会漏检小部分标本,抗体检测阴性的血清在100000倍稀释后仍可检出HCV RNA,因此,有必要发展包括更多片段包被的第三代HCV抗体诊断试剂盒。     

抗-HCV多表位抗体在检测HCV抗原中的应用

目的应用丙型肝炎病毒多表位抗体,探索从血浆或血清样品中检测丙型肝炎病毒抗原(HCAg)的可能性,为献血员筛选及临床早期诊断提供检测方法。方法利用原核系统表达的丙型肝炎病毒(HCV)7个高度保守区基因的多表位复合抗原免疫动物,制备抗-HCV多克隆抗体,采用ELISA双抗体夹心法检测血浆或血清中的HCAg,并与RT-PCR法进行比较。结果制备的抗-HCV多表位复合抗原多克隆抗体,在用ELISA法检测HCAg中表现出较高的特异性及灵敏性,Cutoff值为0·239,批内CV值为5·60%~6·65%,批间CV值为7·80%。与RT-PCR比较,相关系数为0·816,灵敏度为88·89%,特异度为96·30%,一致性为95·24%,调整一致性为90·82%,阳性预测值为80·00%,阴性预测值为98·11%。HCAg检出率与美国ORTHO公司HCV-C抗原检测试剂盒差异无显著意义(P=0·06)。结论用HCV多表位复合抗原制备的多克隆抗体,采用ELISA双抗体夹心法检测HCAg,具有灵敏、特异、快速的优点,有望开发成为HCAg诊断试剂盒。     

多聚赖氨酸为载体的聚合物标记物在丙型肝炎病毒核心抗原检测中的应用

目的探讨以多聚赖氨酸为载体的聚合物标记物在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)核心抗原检测中的应用。方法以多聚赖氨酸作为载体,将HCV核心抗原单克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP)偶联形成聚合物标记物,同时制备过碘酸钠标记物,比较两种标记物中的抗体相对含量及抗体反应性;将两种标记物分别应用于ELISA和Western blot法检测HCV核心抗原中,比较二者的检测结果,并与市售试剂盒进行比较。结果通过竞争抑制和直接结合试验结果显示,当达到50%抑制率时,聚合物标记物和过碘酸钠标记物的游离抗体浓度分别为0.0019和0.0011mg/ml;当A403值为1.0时,聚合物标记物的稀释度为1:200000左右,而传统标记物为1:20000左右。聚合物标记物和过碘酸钠标记物应用于ELISA法,检测HCV核心抗原的最低检测限分别为2.0和10pg/ml,试验内、试验间变异系数均<10%,特异性良好,临床血清标本检测结果与市售试剂盒的符合率分别为97.0%和98.6%;在Western blot检测中,与过碘酸钠标记物相比,聚合物标记物至少可以提高检测灵敏度10倍。结论以多聚赖氨酸为载体的聚合物标记物可应用于HCV核心抗原的ELISA和Western blot检测,且能提高酶、抗体的比例,进而提高检测的灵敏度,防止漏检。     

检测HCV RNA的PCR试剂质控试行参考品的建立

选慢性丙型肝炎病人中HCVRNA含量不等的阳性血清作为阳性标准，采用选自HCV基因5’端非编码区的不同引物来扩增病毒基因，扩增产物与分子量标准进行比较，部分产物用酶切初步分析进行确证。选国家HCV抗体诊断试剂盒临床验证参考品中的阴性样品作为阴性标准，经反复检测显示HCVRNA为阴性。选强阳性血清经5%小牛血清稀释作为灵敏度标准，检测范围为10－5～10－7。应用该参考品对北医肝病研究所的三批HCVRNA诊断试剂盒进行检测，阳性和阴性标准均符合要求，灵敏度为10-5～10-6。     

狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,用于不同株狂犬病疫苗免疫后抗体水平的检测。方法用市售的不同狂犬病疫苗株抗原免疫NIH小鼠,制备免疫血清,用不同的疫苗株抗原包被酶标板,分别测定小鼠血清抗体效价,并通过不同株抗原抗体的交叉中和实验,分析抗原的差异性;在此基础上,将不同毒株抗原按不同比例混合包被酶标板,分别测定阳性血清样本,并与快速免疫荧光抑制试验(RFFIT)检测结果比较,确定包被抗原模式,建立狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,绘制标准曲线,确定最佳定量范围及灵敏度,确定Cut-off值;并对其特异性、精密性、准确性及稳定性进行验证;用建立的方法与其他市售狂犬病病毒抗体检测试剂分别检测血清样品,分析检测结果的一致性及相关性。结果狂犬病病毒抗原AG∶CTN-1=4∶1为最适包被抗原模式,试剂经优化后,检测抗体效价范围在535.00～33.44 mIU/ml之间,具有良好的线性关系(r>0.99),最低检出限为8.36 mIU/ml,Cut-off值为0.735 mIU。该方法检测人血清白蛋白、破伤风阳性血清、乙肝表面抗原阳性血清、白喉阳性质控血清均未发生反应;试验内变异系数在6.68%～7.84%之间;回收率在97.25%～104.50%之间;试剂置37℃3 d,与4℃保存试剂测定结果差异无统计学意义(P>0.05)。该方法检测血清样品与市售狂犬病病毒抗体检测试剂比较,均具有良好的一致性;与RFFIT测定结果比较,二者差异无统计学意义(P>0.05),回归方程为Y=-0.475+3.246 X,相关系数为0.801。结论已建立了狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,可用于大规模狂犬病病毒抗体的筛查。     

VIDAS HIV Duo Assay试剂的特异性及敏感性

目的评价HIV抗原/抗体联合检测快速法(VIDAS HIV Duo Quick)和超敏法(VIDAS HIV Duo Ultra)试剂的特异性及敏感性。方法用这2种试剂和HIV抗体参比试剂,分别检测287份HIV感染或疑似感染者样品、1240份非HIV感染者血清/血浆样品,对与参比试剂检测结果不一致样品,进行抗体的确认及HIV p24抗原和RNA的检测,并比较其特异性和敏感性。用这2种试剂和HIV-1p24抗原参比试剂,分别检测3株病毒培养上清的系列稀释样品,并比较其检测p24抗原敏感性的差异。结果共检测1277份HIV抗体阴性样品和250份HIV抗体阳性样品,与参比试剂相比,快速法试剂的特异性为99.45%,敏感性为100%,而超敏法试剂的特异性为99.14%,敏感性为99.20%。两种试剂检测病毒株培养上清的敏感性均不低于HIV-1p24抗原参比试剂,且能检出HIV感染窗口期样品。结论这2种试剂在增加HIV p24抗原检测的情况下,对HIV抗体检测的特异性和敏感性均没有明显降低,并且能检测出HIV感染窗口期样品。