液相色谱-质谱联用法测定U937细胞内胆固醇

目的利用液相色谱-质谱联用法测定细胞内胆固醇及胆固醇酯,建立一种精确鉴定泡沫细胞的方法.方法用氧化修饰低密度脂蛋白(oxidized loW density lipoprotein,oxLDL)干预U937巨噬细胞诱导泡沫细胞形成,然后用己烷/异丙醇(体积比3/2)抽提细胞内胆固醇及胆固醇酯,抽提液经真空干燥后再溶于甲醇,用液相色谱-质谱联用法直接测定细胞内游离胆固醇,胆固醇酯经胆固醇酯酶水解后测定总胆固醇,总胆固醇减去游离胆固醇即胆固醇酯.抽提脂质后的沉淀物溶于氢氧化钠溶液中,用BCA法测定蛋白含量,胆固醇及胆固醇酯用μg/mg细胞蛋白为单位来表示.结果氧化低密度脂蛋白干预后的巨噬细胞内存在高水平胆固醇及胆固醇酯的蓄积.在100μg的oxLDL处理组中,胆固醇酯与阴性对照组差异存在显著性[(25.733±2.970)μg/mg细胞蛋白vs(13.024±2.875)μg/mg细胞蛋白,P＜0.01],同样胆固醇的水平差异也存在显著性[(18.675±1.315)μg/mg细胞蛋白vs(24.428±2.370)μg/mg细胞蛋白,P＜0.01].结论液相色谱-质谱联用法测定细胞内胆固醇是一种鉴定泡沫细胞简便而精确的方法.     

人胆固醇酯水解酶在RAW 264.7巨噬细胞内瞬时表达对胆固醇代谢的影响

目的:以RAW264.7小鼠单核巨噬细胞为研究对象,探讨人胆同醇酯水解酶(Human cholesteryl ester hydrolase,hCEH)在鼠巨噬细胞内瞬时表达,对细胞内胆固醇代谢产生的影响.方法:利用FuGENE HD转染试剂将pEGFP-Nr-hCEH质粒,转染RAW264.7小鼠单核巨噬细胞.24h后将巨噬细胞与氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,oX-LDL)(100mg/L),共同孵育48 h.荧光显微镜观察及Western blot检测细胞内CEH的表达.油红O染色观察细胞内脂滴堆积情况,高效液相色谱检测细胞内游离胆固醇(Free cholesterol,FC)和胆固醇酯(Cholesterol esters,cE)含量.结果:转染72 h后,荧光细胞数最多,转染率接近40%.Westernblot检测显示,hCEH蛋白在鼠巨噬细胞内大量表达并部分抑制鼠胆固醇酯水解酶(Cholestery lester hydrolase,CEH)表达.转染hCEH组与OX-LDL诱导组相比,油红O染色阳性细胞数显著减少,细胞内总胆同醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量明显下降.结论:hCEH基因在RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞内成功表达,减少细胞内胆固醇水平,抑制泡沫细胞的形成.     

人胆固醇酯水解酶对泡沫细胞的影响及相关机制的研究

目的 探讨人胆固醇酯水解酶(hCEH)表达对泡沫细胞的影响及相关机制.方法 利用含hCEH的慢病毒转染RAW264.7小鼠单核巨噬细胞,转染成功后巨噬细胞泡沫化.油红O染色和高效液相色谱分析hCEH对细胞内脂滴堆积情况及游离胆固醇含量变化的影响;Western blot检测ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)、ATP结合盒转运蛋白G1(ABCG1)的表达情况.结果 转染72 h后,荧光细胞数量最多,接近50％,hCEH在细胞内大量表达;随着时间的延长,油红O染色阳性细胞数逐渐减少,细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量逐渐下降;Western blot显示在0～8 h,ABCA1和ABCG1表达逐渐增加,8h达高峰,以后逐渐减少.结论 hCEH表达可以促进巨噬细胞表面ABCA1、ABCG1的表达,并且ABCA1、ABCG1之间存在一定的协同性,从而有效增加了游离胆固醇外流、减少胆固醇酯在细胞内聚积,抑制泡沫细胞形成.     

氧化型低密度脂蛋白对人主动脉平滑肌细胞生长的影响

【摘要】目的 探讨氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）作用不同时间对人主动脉平滑肌细胞（HA-VSMC）生长的影响，分析其诱导HA VSMC形成泡沫细胞的最适诱导浓度和时间，为开展动脉粥样硬化（AS）及相关疾病研究建立体外细胞模型提供依据。方法 使用不同浓度的ox LDL（15 μg/mL和20 μg/mL）分别处理HA VSMC不同时间（36、48、60、72、84、96 h），通过测定细胞内总胆固醇和胆固醇酯含量以及使用油红O染色观察细胞内脂质空泡来检测泡沫细胞形成的情况；用噻唑蓝比色实验（MTT法）检测细胞活力变化的情况。结果 细胞内总胆固醇和胆固醇酯含量、胆固醇酯/总胆固醇的比值以及脂质空泡随着ox LDL浓度和处理时间的增加而增加。15 μg/mL ox LDL作用60 h细胞内胆固醇酯/总胆固醇的比值超过50%且脂质空泡形成，表明泡沫细胞形成；同时，与对照组相比，15 μg/mL ox LDL作用36、48 h对细胞增殖有促进作用，细胞活力显著增加（P＜005）；处理60、72和84 h细胞活力未发生显著性变化；处理96 h对细胞增殖有抑制作用，细胞活力显著下降（P＜005）。表明15 μg/mL ox LDL处理细胞建模不成功。20 μg/mL ox LDL作用48 h细胞内胆固醇酯/总胆固醇的比值超过50%且脂质空泡形成，表明泡沫细胞形成；同时，与15 μg/mL ox LDL处理的HA VSMC相比，20 μg/mL ox LDL处理细胞36 h细胞活力显著降低（P＜001），处理48、60、72和84h细胞活力显著增加（P＜005），处理96 h细胞活力无显著变化。20 μg/mL ox LDL处理细胞48、60、72和84 h建模成功。结论 浓度为20 μg/mL的 ox LDL处理HA VSMC细胞48 h细胞活力增加最为显著，其可作为建立AS体外细胞模型的最佳诱导时间和浓度。     

原花青素及其组合物对泡沫细胞形成的影响

目的观察原花青素及其与抗炎活性成分（积雪草苷、姜黄素、茶多酚）的组合物对氧化低密度脂蛋白（ox- LDL）刺激巨噬细胞形成泡沫细胞过程中炎症细胞因子和细胞内胆固醇含量的变化。方法以体外培养的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞为材料和ox- LDL刺激RAW264.7细胞24h形成泡沫细胞为模型,RT- PCR方法检测细胞因子IL-1β和TNF-αmRNA水平,试剂盒测定细胞内游离胆固醇和总胆固醇的含量。结果原花青素及其与积雪草苷、姜黄素、茶多酚组合物可明显降低泡沫细胞内的胆固醇酯与总胆固醇的比值,抑制泡沫细胞的形成,显著抑制泡沫细胞的IL-1β和TNF-αmRNA表达,其中原花青素与姜黄素的组合物作用最强。结论原花青素组合物通过降低细胞内胆固醇酯的含量,减轻细胞泡沫化程度和减轻细胞的炎症反应起到抗动脉粥样硬化的作用。     

胆固醇酯转移蛋白抑制剂Anacetrapib

高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）低于正常水平是诱发心血管疾病的因素之一,升高较低水平的HDL-C能够降低患心血管疾病的风险。一些代谢疾病,如胰岛素耐受、高三酰甘油血症都会增强胆固醇酯转移蛋白的活性,高活性的胆固醇酯转移蛋白可诱发动脉粥样硬化和增加患心血管疾病的风险。因此,抑制胆固醇酯转移蛋白是治疗动脉粥样硬化症的新靶点。Aanncetrapib是一小分子 唑烷酮类选择性胆固醇酯转移蛋白抑制剂,能很好地作用于低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）和HDL-C,安全有效地调节冠状动脉心脏病患者以及冠状动脉心脏病高危患者的脂质水平。     

白藜芦醇增强胆固醇酯水解酶的表达抑制动脉粥样硬化形成的机制

目的观察白藜芦醇是否能够通过增强胆固醇酯水解酶（cholesteryl ester hydrolase,CEH）的表达抑制动脉粥样硬化形成。方法构建表达CEH siRNA的载体并转染巨噬细胞,通过RT-PCR和Western Blot观察CEH的表达情况,检测白藜芦醇和CEH siRNA对CEH表达的影响;通过胆固醇含量分析和油红O染色观察白藜芦醇和CEH siRNA对细胞内胆固醇含量和脂滴形成的影响。结果 RT-PCR和Western blot检测结果显示CEH siRNA明显下调CEH的表达;Western blot检测结果显示与CEH siRNA、空白组、白藜芦醇＋CEH siRNA组相比白藜芦醇组CEH蛋白表达明显增强;油红O染色发现与CEH siRNA、空白组、白藜芦醇＋CEH siRNA组分别为81.2%±3.2%、74.3%±0.172 1%、69%±1.0%,而白藜芦醇组为17.45%±2.0%;胆固醇含量分析CEH siRNA、空白组、白藜芦醇＋CEH siRNA组胆固醇含量分别为0.62±0.41、0.59±0.10、0.51±0.12,而白藜芦醇组为0.23±0.06,白藜芦醇组胆固醇含量和脂滴形成明显降低。结论白藜芦醇可通过增强CEH的表达抑制动脉粥样硬化形成。     

酯酰辅酶A:胆固醇酯酰转移酶A2研究进展

酯酰辅酶A:胆固醇酯酰转移酶A(ACAT)是广泛存在于真核细胞中,催化胆固醇与长链脂肪酸连接生成胆固醇酯,从而调节体内胆固醇代谢平衡的关键酶.ACAT有两种同工酶,即ACAT1和ACAT2,研究表明:ACAT2参与了脂蛋白的装配,食物中胆固醇的吸收以及动脉粥样硬化斑块的形成等生理、病理过程,是代谢综合征的一个重要的候选基因.本文就有关方面的进展作一综述.     

橡胶种子油预防猴实验性动脉粥样硬化症超微结构观察

人和动物动脉粥样硬化病变中,最突出的是脂质在动脉内膜的沉积,而典型的泡沫细胞及其内含胆固醇、胆固醇酯则是反映这一过程的特征性形态改变。泡沫细胞(单核细胞源性和平滑肌细胞源性)既是脂质沉积的结果,又是后来各种病变的开端,故是动脉粥样硬化发病学和形态发生学上极为重要的受到关注的问题。已经公认,这类细胞是以     

氧化低密度脂蛋白循环免疫复合物诱导巨噬细胞胆固醇酯蓄积

目的:探讨氧化、天然低密度脂蛋白循环免疫复合物(Ox -LDL- IC)致动脉粥样硬化作用。　方法:采用人源的氧化、天然LDL与异源的抗载脂蛋白B(apoB)结合制备IC,观察不同浓度的Ox- LDL -IC对小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇酯蓄积和泡沫细胞形成的影响。　结果:氧化、天然LDL- IC均可引起巨噬细胞内胆固醇酯大量堆积,其效果强于Ox -LDL(P<0. 001),而且随剂量的增加而升高,并转化为泡沫细胞;而天然LDL、抗apoB处理的巨噬细胞内未见胆固醇酯的堆积。　结论:LDL- IC可导致巨噬细胞转化为泡沫细胞,参与动脉粥样硬化的形成。     

巨噬细胞源性与肌源性泡沫细胞的不同特性研究

目的：动脉粥样硬化损伤中的泡沫细胞来源于巨噬细胞和平滑肌细胞,本实验在离体细胞培养的基础上探讨了两种来源泡沫细胞的不同特性。方法与结果：选择Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠腹膜巨噬细胞与猪主动脉平滑肌细胞,在氧化低密度脂蛋白（Ｏｘｉｄｉｚｅｄ　ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ,ＯＬＤＬ）环境中孵育一定时间后,可形成特征性的泡沫样细胞。其中,巨噬细胞源性泡沫样细胞的形成环境为 １０ ｍｇ·Ｌ ＯＬＤＬ,作用时间为 ９６ ｈ,细胞内总胆固醇含量为 ７７．６±８．３ｍｇ·ｇ,胆固醇酯在总胆固醇中的构成比为５３.１％ ,胆固醇含量受消斑肽影响不大,第８ｄ开始大量死亡;而肌源性泡沫样细胞则不同,形成环境为 １５ ｍｇ·ＬＯＬＤＬ,作用时间为 ７２ ｈ,总胆固醇含量为 １８７．３±９．２ ｍｇ·ｇ,胆固醇酯构成比为 ６４．１％,胆回醇含量受消斑肽影响较大,第 ６ ｄ开始大量死亡。结论：两种来源的泡沫细胞在产生环境、形成速度、胆固醇含量、生存时间和逆转性等方面可能存在着一定的差异。     

胆固醇酯与动脉粥样硬化

研究人员在90年代初便发现胆固醇是动脉粥样硬化斑块的一种成分。该发现促使人们认识到高胆固醇血症在动脉粥样硬化发生过程中起重要作用。在哺乳动物中,胆固醇以一种甾醇或脂肪酸酯形式存在(胆固醇通过一种酯与任何长链脂肪酸结合而连接在一起)。在动脉斑块中蓄积的大多数胆固醇都是以酯的形式存在,并且是通过产生斑块的细胞(如巨噬细胞)从渗入的血浆脂蛋白中衍生出来的。经过长期研究后,研究人员分离出完成细胞内胆固醇酯化作用的这种酶(即酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶,ACAT),随后导致酰基转移酶ACAT家族的发现,其中包括ACAT-1、ACAT-2和一种甘油三酯合成酶,即二酰基甘油酰基转移酶(diacylglyc-erol acyktransferass,GDAT)。ACAT-1和ACAT-2与卵磷脂:卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)结合     

几种常见天然化合物对ABCA1表达影响的研究进展

动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病理基础,细胞内胆固醇蓄积引起的泡沫细胞形成是导致动脉粥样硬化发展的重要因素。三磷酸腺苷结合盒运转体A1(ABCA1)在胆固醇代谢中有着重要作用。许多天然化合物如葛根素、姜黄素、芍药醇等能够增加ABCA1的表达,促进胆固醇流出,减少细胞内胆固醇蓄积,抑制泡沫细胞形成。本文主要综述了天然化合物对ABCA1表达调控及动脉粥样硬化的影响,为心血管疾病的预防与治疗提供新的思路。     

脂联素对巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响

目的 通过研究脂联素对细胞内胆固醇的影响,探讨其抗动脉粥样硬化作用的可能机制.方法 以人急性单核细胞白血病细胞株(THP-1细胞株)来源的泡沫细胞模型为研究对象,用不同浓度的脂联素(1 mg/L,5 mg/L和10 mg/L)进行体外干预.采用油红O观察泡沫细胞形成,用胆固醇氧化酶法检测细胞内胆固醇含量的变化,用荧光显微镜观察巨噬细胞对Dil标记的氧化低密度脂蛋白(Dil-Ox-LDL)的摄取率.结果 脂联素(1 mg/L,5 mg/L和10 mg/L)干预对巨噬细胞内总胆固醇(TC)无显著影响,却能促进胆固醇酯(CE)转化为游离胆固醇(FC),CE/TC比值明显降低(P<0.05);同时观察到脂联素(10 mg/L)干预后可抑制巨噬细胞对Dil-Ox-LDL的摄取.结论 脂联素能减少巨噬细胞对Ox-LDL的摄取和促进巨噬细胞内胆固醇酯的水解,这可能是脂联素抑制胆固醇沉着从而发挥抗动脉粥样硬化作用的机制之一.     

miR-146a促进动脉粥样硬化斑块形成调控机制研究

目的 探讨miR-146a对动脉粥样硬化斑块的影响及其机制。方法 利用miR-146a增强剂（miR-146a mimic）和miR-146a拮抗剂（miR-146a inhibitor）转染大鼠外周血单核巨噬细胞,转染成功后予巨噬细胞泡沫化。油红O染色和脂质染色的半定量分析miR-146a对细胞的脂质堆积情况的影响。Western blot检测胆固醇酯水解酶（cholesteryl ester hydrolase,CEH）、ABCA1和ABCG1的表达情况。结果 Western blot检测显示,miR-146a mimic转染组的CEH表达明显降低,miR-146a inhibitor转染组的ABCA1和ABCG1表达量较对照组和miR-146a mimic转染组明显增多。油红O染色显示miR-146a mimic转染组、对照组和miR-146a inhibitor转染组的阳性细胞比例分别为82.1%±3.1%、73.2%±0.16%和16.25%±2.1%。结论miR-146a能够抑制大鼠外周血单核巨噬细胞细胞内CEH的表达,进而阻碍游离胆固醇的外流,最终导致动脉粥样硬化斑块的形成。     

脂蛋白（a）与巨噬细胞内脂质聚积关系的研究

目的：泡沫细胞形成是早期动脉粥样斑块的典型特征。本文通过对脂蛋白(a)[lipoprotein(a),Lp(a)]与巨噬细胞的相互作用进行研究，探讨Lp(a)与泡沫细胞形成的关系。方法：经生物素—亲和素—酶联法到定不同浓度生物素标记的天然及氧化型Lp(a)与小鼠腹腔巨噬细胞表面的结合量。天然及氧化型Lp(a)与小鼠腹腔巨噬细胞共同孵育后，酶法测定细胞内胆固醇及胆固醇酯含量的变化。结果：天然的Lp(a)能以一定的亲合力、可饱和的与巨噬细胞表面结合，氧化修饰后Lp(a)与巨噬细胞的结合量显著增加。天然及氧化型Lp(a)均能引起巨噬细胞的过量摄取，导致细胞内胆固醇含量增加，其中以氧化型Lp(a)的作用更为显著。与氧化型Lp(a)孵育后，巨噬细胞内胆固醇含量的增加是与天然Lp(a)孵育后的2．5倍，而胆固醇酯的含量增加是与天然Lp(a)孵育后的6．1倍。结论：Lp(a)能与巨噬细胞表面特异性结合，并促使细胞对其吞噬、降解；且巨噬细胞对氧化型Lp(a)的结合、摄取量显著增加。     

同型半胱氨酸对THP-1单核细胞源性泡沫细胞形成和胆固醇流出的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对THP-1单核细胞源性泡沫细胞形成和胆固醇流出的影响及其特点。方法将THP-1单核细胞与佛波酯(PMA)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共同培养,复制泡沫细胞模型,用50、100、200、500μmol.L-1浓度Hcy和100μmol.L-1Hcy+叶酸+维生素B12(VB12)干预24h,油红O染色检测泡沫细胞的形成;采用酶法测定细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)含量的变化,观察Hcy对泡沫细胞胆固醇流出的影响,人ox-LDL;酶联免疫(ELISA)试剂盒检测泡沫细胞胞内ox-LDL的含量。结果 Hcy加剧了泡沫细胞的形成,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),但不呈量效关系,以100μmol.L-1浓度的Hcy组效应最显著(P<0.01);在Hcy干预下泡沫细胞胞内TC、FC、CE的流出减少,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),以100μmol.L-1浓度的Hcy组效应最显著(P<0.01),同时100μmol.L-1Hcy+叶酸+VB12组与100μmol.L-1浓度的Hcy组比较显示前者泡沫细胞形成减少,胆固醇流出增多;在Hcy干预下泡沫细胞胞内ox-LDL的含量增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Hcy促进THP-1单核细胞源性泡沫细胞的形成,减少胞内胆固醇的流出,在动脉粥样硬化的发生发展中起了重要作用。     

刺梨汁对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响

目的 :探讨刺梨汁的抗动脉粥样硬化机制。　方法 :在刺梨汁参与下 ,氧化的极低密度脂蛋白 (Ox- VL DL)与小鼠腹腔巨噬细胞孵育一段时间 ,通过测定细胞胆固醇含量和观察细胞形态改变 ,分析刺梨汁对 Ox- VL DL 促泡沫细胞形成的影响。　结果 :较低浓度的刺梨汁能明显抑制 Ox- VL DL 对小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇酯的堆积 (P<0 .0 0 1) ,并呈浓度依赖性。刺梨汁浓度为 2 μl/m l和 4μl/ml时 ,Ox- VL DL 堆积的细胞胆固醇酯含量分别被抑制了 5 9.8%和 90 .1%。形态学观察显示 ,经刺梨汁处理的巨噬细胞猩红阳性染色显著减少。　结论 :刺梨汁通过抑制Ox- VL DL 的促泡沫细胞形成来实现其抗动脉硬化的功能。     

β-VLDL对巨噬细胞胆固醇含量及ACAT活性的影响

本文用含β-VLDL 的培养基体外培养小白鼠腹腔巨噬细胞,结果表明:β-VLDL 使细胞内胆固醇酯含量增加10倍;使胞内 ACAT 活性增加5倍.此提示β-VLDL 与动脉粥样硬化中泡沫细胞的形成密切相关.     

同型半胱氨酸对THP-1单核细胞源性泡沫细胞形成和胆固醇流出的影响

目的探讨同型半胱氨酸（Hcy）对THP-1单核细胞源性泡沫细胞形成和胆固醇流出的影响及其特点。方法将THP-1单核细胞与佛波酯（PMA）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）共同培养,复制泡沫细胞模型,用50、100、200、500μmol.L-1浓度Hcy和100μmol.L-1Hcy＋叶酸＋维生素B12（VB12）干预24h,油红O染色检测泡沫细胞的形成;采用酶法测定细胞内总胆固醇（TC）、游离胆固醇（FC）和胆固醇酯（CE）含量的变化,观察Hcy对泡沫细胞胆固醇流出的影响,人ox-LDL;酶联免疫（ELISA）试剂盒检测泡沫细胞胞内ox-LDL的含量。结果 Hcy加剧了泡沫细胞的形成,与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,但不呈量效关系,以100μmol.L-1浓度的Hcy组效应最显著（P〈0.01）;在Hcy干预下泡沫细胞胞内TC、FC、CE的流出减少,与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,以100μmol.L-1浓度的Hcy组效应最显著（P〈0.01）,同时100μmol.L-1Hcy＋叶酸＋VB12组与100μmol.L-1浓度的Hcy组比较显示前者泡沫细胞形成减少,胆固醇流出增多;在Hcy干预下泡沫细胞胞内ox-LDL的含量增加,与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 Hcy促进THP-1单核细胞源性泡沫细胞的形成,减少胞内胆固醇的流出,在动脉粥样硬化的发生发展中起了重要作用。