α-MEM培养基和高糖DMEM培养基对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响

目的比较α-MEM和高糖DMEM两种培养基对小鼠破骨细胞前体细胞系RAW264.7细胞分化的影响。方法 (1)根据培养基和是否添加核因子κB受体激活蛋白配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)将细胞分为4组:α-MEM培养基组、添加RANKL的α-MEM培养基组、高糖DMEM培养基组、添加RANKL的高糖DMEM培养基组;(2)于培养第3天收集细胞,分别通过q PCR、免疫印迹实验观察分化相关标记物抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)、活化的T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells 1,NFATc1)、核因子κB受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB,RANK)和组织蛋白酶(Cathepsin)K的mRNA及蛋白表达水平,并做TRAP染色观察各组成熟破骨细胞的形成情况,探讨添加RANKL后α-MEM培养基和高糖DMEM培养基对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响。结果 (1)与添加RANKL的高糖DMEM培养基相比,添加RANKL的α-MEM培养基使RAW264.7细胞的分化相关标记物TRAP、NFATc1、RANK及cathepsin K的mRNA表达水平增加,TRAP、NFATc1及cathepsin K的蛋白表达水平增加;(2)在α-MEM培养基或高糖DMEM培养基中添加RANKL均可使RAW264.7细胞分化为成熟破骨细胞,但添加RANKL的α-MEM培养基处理的细胞组中形成的成熟破骨细胞更多。结论添加RANKL的α-MEM培养基有利于RAW264.7细胞向破骨细胞分化。     

白细胞介素-21对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响

目的 了解白细胞介素-21 (IL-21)诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞向破骨细胞分化的作用,并探讨其可能的机制。方法1、以不同浓度IL-21(0,1,10,20,40 ng/ml)处理RAW264. 7细胞,培养5天后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,Western Blot和免疫组化法检测降钙素受体（CTR)表达,采用Real time PCR法检测CTR和组织蛋白酶（Cathepsin)-K的 mRNA表达水平。2、以信号通路抑制剂AG490、LY294002和PD98059作用30min后再加人IL-21,培养5天后观察破骨细胞形成情况,以Western Blot检测IL-21作用不同时间点时信号通路分子总蛋白和磷酸化蛋白水平,探讨IL-21直接诱导破骨细胞分化的作用机制。结果1、在无RANKL作用的情况下,随着IL-21浓度增加TRAP阳性细胞数逐渐增多,20 ng/ml作用最强,40ng/ml时减弱。IL-21能够诱导破骨标志分子CTR和Cathepsin-K mRNA水平表达上调。Western Blot和免疫细胞化学证实,与阴性组比较,IL-21能促进CTR蛋白水平表达增高。2、PI3K-AKT通路抑制剂（LY294002)可以显著抑制IL-21诱导的 RAW264. 7细胞向破骨细胞分化,IL-21刺激5 ~ 15 min时p-AKT表达增强。结论 IL-21可不依赖RANKL直接诱导小鼠巨噬细胞系RAW264. 7细胞向破骨细胞分化,该作用可能由PI3K-AKT通路介导。     

复合振动抑制RAW264.7细胞分化成熟

目的研究复合振动对核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导的RAW264.7细胞分化的影响,探讨复合振动对破骨细胞分化的影响及机制。方法 RAW264.7细胞RANKL诱导培养3或4d并施加复合振动干预,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察TRAP阳性多核细胞形成的变化,real-time RT-PCR分析破骨细胞特异性基因组织蛋白酶K(cathepsin K),金属蛋白酶-9(MMP-9)和TRAP表达的变化。结果复合振动能抑制RANKL诱导破骨细胞形成,下调破骨细胞特异基因cathepsin K,MMP-9和TRAP的表达。结论 RANKL促进RAW264.7细胞向破骨细胞分化,并增加特异基因的表达,但RANKL的促进作用受复合振动抑制。这进一步的阐释复合振动抗骨质疏松的作用机制。     

培养基对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7诱导分化破骨细胞的影响

目的 探讨培养基对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7向破骨细胞分化的影响。方法 实验分为3组：高糖DMEM培养基组（DMEM组）;高糖DMEM/α-MEM培养基组（DMEM/α-MEM组）;α-MEM培养基组（α-MEM组）。按常规方法采用上述3种培养基进行破骨细胞培养,培养5 d后,采用抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase, TRAP）染色观察各组破骨细胞的形成情况,并采用实时荧光定量PCR方法观察破骨细胞分化相关标志物NFATc-1、c-Fos和TRAF-6 mRNA的表达;培养11 d后采用甲苯胺蓝染色进行骨陷窝面积分析,观察破骨细胞骨吸收功能情况。结果 3组均可以观察到典型的TRAP+破骨细胞。与DMEM组相比,DMEM/α-MEM组、α-MEM组TRAP+破骨细胞数量明显增加（P<0.01）,但各组形态略有不同。在骨吸收功能上,与DMEM组和DMEM/α-MEM组相比,α-MEM组骨陷窝面积明显增加（P<0.01）。在破骨细胞分化相关调控因子表达上,与DMEM组相比,α-MEM组NFATc-1、c-Fos 和TRAF-6 mRNA表达显著增加（P<0.01,P<0.05）;DMEM/α-MEM组NFATc-1 mRNA表达显著增加（P<0.01）,c-Fos 和TRAF-6 mRNA表达有增加的趋势,但差异无统计学意义;α-MEM组与DMEM/α-MEM组比较差异无统计学意义。结论 高糖DMEM培养基、高糖DMEM/α-MEM培养基、α-MEM培养基均可用于小鼠单核巨噬细胞RAW264.7诱导分化破骨细胞的实验;从破骨细胞数量、状态及功能来看,α-MEM培养基更适合做为破骨细胞分化培养基。     

不同浓度白藜芦醇对破骨细胞分化的影响及自噬的作用

目的研究不同浓度白藜芦醇(RSV)对破骨细胞分化的影响及自噬在其中的作用。方法RANKL诱导RAW264.7细胞分化过程中,加入不同浓度(0、0.1、0.5、1、5及10μmol/L)RSV,CCK-8检测干预后12、24、48、72 h时的细胞活力;TRAP染色观察破骨细胞分化程度。加或不加入3-甲基嘌呤(3-MA)抑制自噬,RT-PCR检测破骨分化相关标志物TRAP、MMP-9、CTSK和自噬相关标志物LC3、Beclin-1、P62的mRNA表达情况;Western blot检测自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin-1、P62的表达情况。结果RANKL诱导分化过程中,细胞增殖活力提高,加入0.1~10μmol/L的RSV,细胞活力先上升后下降,在0.5μmol/L时达到最大;0.1μmol/L和0.5μmol/L的RSV能提高TRAP染色阳性的破骨细胞数和TRAP、MMP-9、CTSK、LC3、Beclin-1、P62的mRNA表达,自噬相关蛋白LC3II/I和Beclin-1也增加,P62的蛋白表达则减少;而1~10μmol/L RSV随浓度升高相关mRNA及蛋白LC3II/I和Beclin-1的表达减少,P62的蛋白表达增加;加入3-MA后,相关mRNA及蛋白LC3II/I和Beclin-1的表达减少,P62的蛋白表达增加。结论RSV浓度在0.1~10μmol/L范围内,破骨细胞分化和自噬水平先升高后降低,抑制自噬可以抑制破骨细胞的分化。白藜芦醇影响破骨细胞分化可能部分是通过调节自噬发挥作用。     

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）的培养及其在诱导破骨细胞中的应用

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)是通过Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后得到的细胞株。RAW264.7细胞在医学研究中应用十分普遍:它是许多白血病相关研究模型的常用细胞株;在微生物学、免疫学等研究中也十分常用;同时也是小鼠源性破骨前体细胞,可通过特定细胞因子的诱导在体外获得成熟破骨细胞,因此也成为许多骨骼疾病研究的体外模型。但RAW264.7细胞形态和分化状态多变,在实际培养中较难把握,给科研工作带来了一定困难。科研工作者在RAW264.7细胞的培养方法、细胞的形态及分化状态等方面始终观点不一,对于用RAW264.7细胞在体外诱导获得破骨细胞的方法也有许多差别。本文结合文献资料及实践,探索了RAW264.7细胞的培养条件,冻存、复苏、传代方法,以及用核因子κB受体活化因子配基(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导其成为成熟破骨细胞的技术关键;旨在总结RAW264.7细胞的培养及诱导其分化为破骨细胞的经验教训,探讨RAW264.7细胞的培养和在体外用RANKL诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的方法、技巧,供广大科研工作者借鉴。     

诱导小鼠破骨前体细胞成熟分化的实验条件探讨

目的探讨小鼠单核细胞RAW264.7能否在RANKL诱导下向破骨细胞成熟分化。方法 RANKL作用RAW264.7细胞7天～9天,光镜、透射电镜、扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)分别观察其细胞形态学变化,用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色法观察TRAP阳性的多核细胞,RT-PCR检测破骨细胞表型和功能基因表达变化情况,扫描电镜观察破骨细胞在骨片上形成骨吸收陷窝。结果光镜、透射电镜下可见细胞胞体增大,为椭圆形或不规则形,胞核5～10个,扫描电镜下可见细胞表面大量的伪足样突起;此外,RANKL能诱导RAW264.7细胞分化为TRAP染色阳性的多核破骨细胞,细胞多为超过5个核的多核巨细胞;RAW264.7细胞成熟分化后具有骨吸收功能,并且能上调Cathepsin-K、TRAP、RANK等典型破骨细胞表型和功能基因mRNA的表达。结论 RAW264.7细胞是一种较好的破骨前体细胞模型,单用50ng/ml的RANKL体外连续诱导7天以上,能明显促进它向成熟的破骨细胞分化。     

CTGF对破骨前体细胞RAW264.7增殖及碳酸酐酶Ⅱ分化的影响

目的研究结缔组织生长因子(CTGF)对体外培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7增殖及对核因子Kappa B配体受体(RANKL)诱导体外培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7分化为成熟多核破骨细胞的影响。方法使用200 ng/mLCTGF干预培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7,采用3H-TdR掺入法检测RAW264.7细胞增殖率;使用200 ng/mL CTGF与RANKL单独或共同处理RAW264.7细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察TRAP阳性多核细胞,Western blot检测碳酐酶Ⅱ蛋白的表达。结果 CTGF可显著促进RAW264.7细胞增殖;200 ng/mLCTGF与RANKL共同处理RAW264.7细胞可促进RAW264.7细胞分化为成熟多核破骨细胞;200 ng/mL CTGF与RANKL共同处理RAW264.7细胞可促进RAW264.7细胞碳酐酶Ⅱ蛋白的表达。结论 CTGF促进体外培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7增殖,促进RANKL诱导的破骨细胞前体细胞RAW264.7分化为成熟多核破骨细胞。     

槲皮苷抑制RANKL诱导的破骨细胞形成及骨吸收

[目的]探讨槲皮苷对核因子κB受体激动剂配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)诱导的破骨细胞形成及骨吸收功能的影响。[方法]通过CCK-8法观察不同浓度槲皮苷(0~800μmol/L)干预不同时间(48 h、96 h)对RAW 264.7细胞的生存影响,确定合适的体外用药浓度;利用体外RANKL诱导RAW 264.7细胞形成破骨细胞体系,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色计数评价槲皮苷(200、400μmol/L)对破骨细胞形成和生存的影响;通过骨片吸收实验对骨凹陷和骨吸收面积统计分析评价槲皮苷(200、400μmol/L)3 d内对成熟破骨细胞骨吸收功能的影响;釆用实时定量(Real-Time)PCR技术,检测槲皮苷(200、400μmol/L)对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因NFATc1、TRAP和c-fos表达水平的影响。[结果]细胞生存实验发现槲皮苷干预96 h后,槲皮苷(0~800μmol/L)对RAW 264.7细胞4 d内生存未发现显著影响;通过TRAP染色发现200、400μmol/L槲皮苷能显著抑制体外RANKL诱导的破骨细胞形成;通过骨片吸收实验发现200、400μmol/L槲皮苷3d内能显著降低骨吸收面积,提示其抑制成熟破骨细胞骨吸收功能;同时,槲皮苷能呈剂量依赖性抑制RANKL诱导活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)c1、TRAP和c-fos基因表达。[结论]槲皮苷通过抑制NFATc1,TRAP和c-fos的表达,来抑制体外RANKL诱导的破骨细胞形成和骨吸收功能,是一种潜在治疗骨质疏松药物。     

破骨前体细胞异质性与破骨细胞分化之间的联系

破骨细胞是一种在体内主要发挥溶骨作用的细胞,其由破骨前体细胞融合形成多核巨细胞。近来,活细胞成像技术显示破骨细胞多核化过程具有异质性改变。这种异质性不仅体现在破骨细胞表面分子、蛋白表达等细胞水平上存在差异,同时在体内迁移分布也有时间、空间的差别。而干扰破骨细胞异质性改变不仅能阻止破骨细胞融合,同时也可以抑制其功能。研究破骨细胞异质性体内体外表现,有助于提升对细胞融合的生理病理学理解,同时对抗骨吸收治疗及减少副作用起到一定作用。     

致敏淋巴细胞对破骨细胞分化及骨吸收的影响

目的研究致敏淋巴细胞对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响.方法从被骨水泥单体甲基丙烯酸甲酯(MMA)致敏的新西兰兔外周血中分离淋巴细胞并提取培养介质(LCM),分离培养兔颅骨成骨细胞和兔骨髓细胞,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TrACP)染色和骨磨片扫描电镜观察对破骨细胞进行鉴定.在成骨细胞与骨髓细胞的培养体系中,分别在无LCM,未经MMA刺激的LCM和经MMA刺激的LCM等3种情况下,进行成熟破骨细胞计数和TrACP活性检测.结果骨髓细胞能够分化成破骨细胞并且能在骨磨片上形成骨吸收陷窝,致敏淋巴细胞培养介质能够明显促进破骨细胞数量的增加和TrACP的分泌,在加入MMA刺激后,这种作用更加显著.结论致敏淋巴细胞能够促进骨髓破骨细胞的分化和骨吸收能力.     

致敏淋巴细胞对破骨细胞分化及骨吸收的影响

目的；研究致敏淋巴细胞对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响。方法：从被骨水泥单体甲基丙烯酸甲酯（MMA）致敏的新西兰兔外周血中分离淋巴细胞并提取培养介质（LCM），分离培养兔颅骨成骨细胞和兔骨髓细胞，通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TrACP)染色和骨磨片扫描电镜观察对破骨细胞进行鉴定。在成骨细胞与骨髓细胞的培养体系中，分别在无LCM，未经MMA刺激的LCM和经MMA刺激的LCM等3种情况下，进行成熟破骨细胞计数和TrACP活性检测。结果：骨髓细胞能够分化成破骨细胞并且能在骨磨片上形成骨吸收陷窝，致敏淋巴细胞培养介质能够明显促进破骨细胞数量的增加和TrACP的分泌，在加入MMA刺激后，这种作用更加显著。结论：致敏淋巴细胞能够促进骨髓破骨细胞的分化和骨吸收能力。     

唑来膦酸抑制RAW264.7细胞系分化的最佳浓度体外实验

目的观察唑来膦酸盐对RAW264.7细胞系毒性作用的浓度范围和抑制RAW264.7分化为破骨细胞的最佳实验浓度。 方法以小鼠前破骨细胞系RAW264.7为研究对象,应用MTT法检测唑来膦酸盐对小鼠前破骨细胞系RAW264.7的毒性作用范围。使用TARP染色法观察不同浓度的唑来膦酸盐作用下破骨细胞的生成数目。 结果体外培养24 h后,酶联免疫反应吸光度结果显示,10^-3 mol/L（0.511±0.920）,10^-4 mol/L（0.615±0.577）唑来膦酸对小鼠前破骨细胞系RAW264.7增殖有毒性作用,与空白对照组（0.789±0.061）相比,差异有统计学意义（F=5.880,P<0.01）。TRAP染色破骨细胞计数结果显示：10^-5 mol/L（8.333±0.817）、10^-6 mol/L（10.400±1.817）、10^-7 mol/L（11.250±2.750）及10^-8 mol/L（11.143±1.864）唑来膦酸盐实验组破骨细胞数与空白对照组破骨细胞数（13.833±2.483）相比,差异具有统计学意义（F=27.972,P<0.05）,且呈浓度依赖性,当唑来膦酸盐浓度为10^-5 mol/L时,抑制效果最明显（P<0.01）。 结论唑来膦酸盐抑制RAW264.7细胞系分化为破骨细胞的最佳体外实验浓度为10^-5 mol/L。     

物理因素对破骨细胞分化及功能的影响

物理治疗学是医学物理学发展最快、在医学中应用最为广泛的领域之一,物理治疗正广泛应用于肿瘤、炎症、创伤等的治疗,其内容包括力学、热学、光学以及电磁学4方面。目前,物理治疗应用最多,研究最广泛的就是与破骨细胞（osteoclast,OC）相关的骨组织吸收、再生和改建方面。     

痩素对小鼠破骨细胞分化及功能的影响

目的 观察瘦素（leptin）对体外骨髓诱导培养的小鼠破骨细胞分化和功能的作用效应,探索leptin和骨吸收之间的关联.方法 建立由巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和骨保护素配体（RANKL）为共同细胞因子的小鼠破骨细胞骨髓诱导培养体系,将不同浓度的leptin作用于破骨细胞.实验中根据培养液中是否加入M-CSF和RANKL并依据leptin浓度的不同分为：A组,M-CSF和RANKL;B组,M-CSF、RANKL和leptin（80 ng/ml）;C组,M-CSF、RANKL和leptin（160 ng/ml）;D组,M-CSF、RANKL和leptin（240 ng/ml）;E组,M-CSF、RANKL和leptin（320 ng/ml）;F组,M-CSF、RANKL和leptin（400 ng/ml）;同时设立空白对照组G组.于作用后第7天取细胞玻片进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色,观察破骨细胞并计数;于第10天取出骨片进行甲苯胺蓝染液染色,在光镜和扫描电镜观察骨吸收陷窝形态.结果：诱导培养的小鼠破骨细胞形态特征明显;A组在破骨细胞数量与D、E、F组相比较有明显的统计学差异（P＜0.05）;A组骨吸收面积比与B、C、D、E、F组都有明显的统计学差异（P＜0.05）.结论：leptin抑制体外培养的破骨细胞的分化和骨吸收功能.     

CGRP在糖尿病足神经与骨膜中的表达及其对破骨细胞分化及金属蛋白酶表达的影响

【摘要】〓目的〓研究降钙素基因相关肽(CGRP)在糖尿病足神经与骨膜中的表达及其对破骨细胞分化及金属蛋白酶(MMPs)表达的影响。方法〓取糖尿病足截肢病人与车祸导致截肢病人组织作CGRP免疫组化,以了解其在糖尿病足周围神经与跟骨骨膜中的表达。用CGRP处理RAW264.7培养体系,了解其对破骨细胞分化及金属蛋白酶表达的影响。结果〓糖尿病足周围神经纤维与骨膜组织中CGRP表达下降,CGRP可抑制RAW264.7细胞向破骨细胞分化及抑制,MMP-3,MMP-9的表达。结论〓糖尿病周围神经病变导致的CGRP水平的下降,可使破骨细胞的活化与MMPs的表达失去调节,与异常的骨破坏和难治性溃疡有着密切的关系,在糖尿病足的发病机制中起着重要作用。     

艾拉莫德对类风湿关节炎外周血破骨细胞分化及破骨细胞相关基因表达的影响

目的观察艾拉莫德对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)外周血破骨细胞分化形成及破骨细胞相关基因表达的影响。方法使用人核因子kB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)及人巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)诱导RA患者外周血淋巴细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)分化为成熟破骨细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色进行鉴定。CCK-8法筛选艾拉莫德抑制破骨细胞形成的浓度。观察艾拉莫德25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL对RA患者PBMCs生成破骨细胞的影响,RT-PCR法检测不同浓度艾拉莫德对破骨细胞分化过程中TRAP、组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)、细胞核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)、激活蛋白-1(Activator protein-1,AP-1)mRNA表达的影响。结果 100 ng/mL RANKL和50 ng/mL M-CSF在第14天将RA患者PBMCs诱导为破骨细胞。CCK-8检测结果显示艾拉莫德25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL三个浓度对PBMCs细胞活力无明显影响,且均能抑制破骨细胞的生成,以25μg/mL组最为显著。艾拉莫德能抑制TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA的表达水平,且随艾拉莫德浓度的升高抑制作用越明显。结论艾拉莫德通过抑制破骨细胞特异性基因表达来抑制破骨细胞分化、增殖。     

盐酸二甲双胍抑制破骨细胞分化的研究

目的探讨盐酸二甲双胍对破骨细胞分化抑制作用的研究。方法核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导小鼠骨髓巨噬细胞分化成破骨细胞,在诱导过程中加入不同浓度的盐酸二甲双胍。培养7 d后固定,抗酒石酸酸性磷酸酶染色,计数破骨细胞的数量,骨吸收培养板观察骨陷窝面积,Western blot检测盐酸二甲双胍对ERK磷酸化的影响。结果盐酸二甲双胍能抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成,并且能减少骨陷窝面积,以及抑制ERK磷酸化。结论盐酸二甲双胍可抑制破骨细胞分化及功能,其机制可能与抑制ERK磷酸化有关。