维氏气单胞菌hfq基因敲除菌株的构建及鉴定

RNA分子伴侣蛋白Hfq是细菌中普遍存在的全局调控因子,对于细菌的生长增殖、毒性和逆境耐受等都有重要影响。维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种新型人—鱼共患条件致病菌,会在水产养殖中造成巨大危害。本研究从维氏气单胞菌基因组DNA中扩增hfq基因上、下游序列,连接到pRE112质粒中,构建敲除质粒pRE112-Δhfq,通过接合转移将敲除质粒从大肠杆菌感受态转入维氏气单胞菌后,基于同源重组原理,利用蔗糖压力筛选得到hfq基因敲除的维氏气单胞菌突变株C4-Δhfq。生长曲线分析表明,hfq基因敲除显著延缓维氏气单胞菌的生长速率,同时,回补hfq使细菌恢复生长。本研究获得的hfq基因敲除菌株,可为进一步研究维氏气单胞菌中Hfq调控因子的功能及其调控机制提供一定帮助。     

38株维氏气单胞菌分离株的AFLP基因分型研究

试验通过人工设计合成的通用接头以及与接头序列相匹配的专用引物, 对38株维氏气单胞菌分离株和1株维氏气单胞菌标准菌株进行AFLP基因分型研究。结果显示, 采用5对引物使39株维氏气单胞菌扩增出1080条可见条带, 片段长度在50-1000 bp之间, 其中多态性条带727条, 平均每对引物组合产生154条多态性条带, 平均多态性检出率为66.7%。按UPGMA方法对条带进行聚类分析, 建立聚类分支树状图, 将39株维氏气单胞菌分为9个基因型, 其中第四类群基因Ⅳ型包含了14株菌株, 约占总菌数的35.9%, 分布在5个不同的地区, 推测其可能是引起斑点叉尾 发病的主要流行性基因型。不同地区分离的维氏气单胞菌具有地域性差异, 而同一地区分离株既存在相同基因型现象, 也存在基因型多样性现象。       

维氏气单胞菌tmRNA突变体构建及其用于反式翻译底物的鉴定

SmpB-tmRNA介导的反式翻译,是细菌中普遍存在的一种主要核糖体拯救机制,对细菌的生存和增殖都具有重要影响。为了探明反式翻译系统在人-鱼共患病原菌维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)中的作用机制,本研究基于维氏气单胞菌tmRNA的二级结构预测,将tmRNA标记肽的后5个氨基酸残基的密码子以及1个终止密码子突变为组氨酸密码子,从而构建tmRNA突变体。生长曲线测定结果表明,该tmRNA突变体能够回补tmRNA缺失导致的细菌生长缺陷;同时,免疫印迹实验确证该突变体能够成功地将反式翻译拯救的蛋白底物标记上组氨酸标签,表明其能够行使tmRNA的正常功能。本研究构建的tmRNA突变体为后续分离和纯化tmRNA-SmpB介导的反式翻译底物,进而研究反式翻译系统在细菌中的作用机制提供了理论基础。     

大肠杆菌ptsG基因敲除及其缺陷株生长特性研究

在大肠杆菌磷酸转移酶系统中,葡萄糖主要由ptsG基因编码的酶ⅡCB^Glc转运入细胞。利用代谢工程技术构建ptsG基因缺陷株,有望降低葡萄糖的摄取速率,减少乙酸累积,促进菌体生长。运用PCR技术,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段。经电转化,将外源DNA片段分别转入Escherichia coli DH5a、JM109中。在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上同源区域重组,将基因ptsG敲除,构建ptsG基因缺陷株：DH5αP,JM109P。在LB培养基中,ptsG基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异。在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αP、JM109P的最高菌密度分别是对照菌株DH5α,JM109的3．47倍和4．25倍,ptsG基因缺陷株对葡萄糖的摄入量也明显高于对照菌株。重组蛋白肿瘤坏死因子(TNF)在DH5αP、JM109P中的表达量分别占全菌蛋白的24．3％、20．8％,A600分别为8．28、7．62,TNF在缺陷株中单位体积的表达量明显高于对照菌株。以上结果说明,大肠杆菌ptsG基因缺陷株具有良好的生长能力和表达外源蛋白的能力,在大肠杆菌高密度发酵研究方面具有良好的应用前景。     

鲟源维氏气单胞菌分离鉴定及药敏特性研究

从发病的鲟肝、胰、肾脏及血水分离到5株细菌,命名为4s-11,4s-12,4s-13,4s-14及4s-15。经人工感染,菌株4s-15具有致病性,鲟感染发病症状与自然发病症状相似,并再次分离到此菌株,故菌株4s-15是鲟此病病原菌。菌株4s-15经生理生化细菌鉴定,16S rDNA基因序列分析,结果为维氏气单胞菌。菌株4s-15对左氧氟沙星等13种抗生素高度敏感,本研究为防治鲟此病提供了理论依据。     

台湾泥鳅源维氏气单胞菌Zy01株的分离鉴定及药敏特性研究

【目的】从患病台湾泥鳅体内分离到一株优势菌Zy01,通过鉴定并筛选敏感药物,为台湾泥鳅维氏气单胞菌病的防控提供参考。【方法】从患病台湾泥鳅肌肉溃烂处分离细菌,经理化特性及16S rRNA基因序列分析对其进行鉴定,通过人工感染试验确定病原,并利用K-B法进行药敏分析。【结果】菌株Zy01为2015年11月引发台湾泥鳅疾病的病原菌,其对台湾泥鳅的LC50为2.0×10~6 CFU/m L。菌株Zy01理化特性与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)基本一致,16S rRNA基因序列与维氏气单胞菌相似性为99%,综合判断该病原菌为维氏气单胞菌。菌株Zy01对环丙沙星、头孢拉定、诺氟沙星、阿奇霉素及庆大霉素等10种抗生素高度敏感;对苯唑西林、青霉素、阿莫西林等9种抗生素不敏感。【结论】分离菌株Zy01对台湾泥鳅有致病性,养殖时可选用庆大霉素及新霉素等药物进行防控。     

黄鳝病原性维氏气单胞菌温和生物变种的分离与鉴定

从养殖患出血病黄鳝(Monopterus albus)的肝脾肾中分离到大量菌落形态和色泽一致的细菌。16S rRNA序列分析证实随机挑选的5个分离株为同一种细菌,其中一株编号为HS120920进一步鉴定。结合细菌的形态特征,生理生化特征及16S rRNA和gyrB序列分析结果,鉴定该菌为维氏气单胞菌温和生物变种(Aeromonas veronii biovar sobria)。该菌对黄鳝的半致死浓度约为5.79×107 CFU/mL。药敏试验结果显示,菌HS120920对7种喹诺酮类,5种氨基糖苷类等17种抗菌药物高度敏感,对其他3种抗菌药物低敏,或有抗性。     

一株凡纳滨对虾源维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏特性

【目的】凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是世界范围内最主要的对虾养殖品种之一,2017年5-6月上海某凡纳滨对虾养殖场出现不明原因的死亡病例,发病急,死亡率高。从患病凡纳滨对虾体内分离到一株优势菌AVZ01,旨在确定病因并筛选出敏感药物,为今后凡纳滨对虾维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的防治提供参考。【方法】从患病凡纳滨对虾肝胰腺和肠道中分离致病菌,通过理化特性及16S r RNA基因序列分析进行鉴定,通过人工感染试验确定病原,使用Bliss法计算出半数致死剂量(LD50),并通过纸片扩散法进行药敏试验。【结果】从患病凡纳滨对虾体内分离到一株优势菌AVZ01,进行人工回归感染试验后,对虾发病症状与自然发病症状相似,凡纳滨对虾的LD50为8.7×105 CFU/m L。根据该菌株的形态特征、理化特性、16S r RNA基因序列分析,综合判断该病原菌为维氏气单胞菌。药敏试验结果显示,该菌株对米诺环素、诺氟沙星、庆大霉素等16种抗生素高度敏感,对青霉素、苯唑西林、头孢氨苄等9种抗生素耐药。【结论】分离菌株AVZ01对凡纳滨对虾有较强的致病性,养殖过程中可选用庆大霉素及新霉素等药物进行防控。     

鳜源致病性维氏气单胞菌的鉴定及药敏试验

【目的】通过对从患病的鳜(Siniperca chuatsi)肝脏中分离得到的一株优势菌WJ2014-1进行鉴定,旨在确定病因并筛选出敏感药物,为今后鳜维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的防治提供参考。【方法】从患病鳜肝脏分离致病菌,通过对其生理生化特征与16S r RNA基因序列分析进行鉴定,并通过纸片扩散法进行药敏试验。【结果】用菌株WJ2014-1进行人工回归感染试验后,鳜发病症状与自然发病症状相似。根据该菌株的形态特征、生化特性、16S r RNA基因序列分析结果鉴定为维氏气单胞菌。该菌株对复方新诺明、强力霉素、罗红霉素、头孢噻肟、哌拉西林等21种抗生素敏感,对氯霉素、诺氟沙星、萘啶酸等9种抗生素耐药。【结论】分离得到的菌株WJ2014-1对鳜有致病性,生产中可选用复方新诺明、强力霉素、罗红霉素等药物进行防治。     

一株维氏气单胞菌发酵培养基优化及其制备疫苗免疫效力比较

采用单因素试验、响应面试验法对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)发酵培养基的氮源、碳源、无机盐和磷酸盐成分及用量进行优化组合,确定优化培养基组成：胰蛋白胨10.8 g/L,葡萄糖5.0 g/L,牛肉膏3.0 g/L,磷酸二氢钾2.0 g/L,硫酸镁0.4 g/L,NaCl 5.0 g/L。并与基础培养基的发酵活菌数、制备的灭活疫苗免疫效力进行比较,经过验证试验绘制维氏气单胞菌在优化培养基条件下的7 L发酵罐生长曲线。在优化发酵培养基条件下,维氏气单胞菌活菌数为5.94×10⁹ cfu/mL,比基础培养基增幅43.13%;制备的灭活疫苗相对保护率为77.78%,比基础培养基提高了14.81%。7 L发酵罐发酵培养10 h,活菌数达到最大8.85×10⁹ cfu/mL。通过对发酵培养基的优化,可以获得低成本、优质高效的维氏气单胞菌发酵菌液,为今后维氏气单胞菌灭活疫苗规模化发酵培养提供参考。     

维氏气单胞菌新型sRNA N155的鉴定及功能研究

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,A.veronii)是一种新型病原体,既能感染鱼类,又可以感染包括人在内的哺乳动物,其致病机理尚不完全清楚。基于A.veronii C4野生型菌株转录组数据一个新的sRNA N155被鉴定,进一步利用同源重组等分子生物学手段构建了sRNA N155的缺失菌株。转录组数据和RT-qPCR分析结果表明,sRNA N155独立转录。序列比对分析发现,sRNA N155具有物种特异性,仅存在于气单胞菌属中。生长曲线测定和运动性实验结果表明,sRNA N155的敲除不影响A.veronii生长,但会导致A.veronii运动能力下降。本研究成功构建的ΔsRNA N155敲除菌株,为进一步研究sRNA N155在A.veronii中的功能提供了可靠材料。     

草鱼源致病维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏分析

为确定广东惠州某渔场养殖草鱼(Ctenopharyngodon idellus)突发性死亡病因,本研究从患病死亡草鱼病灶鳍、鳃、肌肉、脾脏、肝脏等病灶组织分离到1株优势菌HZ08,随后对分离菌形态特征、生理生化特性、回归感染、16S rRNA基因进化及药物敏感性进行研究.结果 显示,该菌葡萄糖产气、甘露醇、覃糖、ONP...     

罗氏沼虾源维氏气单胞菌的分离鉴定、毒力基因检测及组织病理学观察

为鉴定江苏省高邮市某养殖场罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)发病死亡的病原体,研究从患病濒死的罗氏沼虾肝胰腺中分离出一株优势菌WSQ-1,对其进行纯化培养、革兰氏染色、生理生化特征鉴定、16S rRNA及gyrB基因序列分析,鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。回归感染实验表明,分离株WSQ-1对罗氏沼虾有较强致病性,且出现与自然发病类似的症状:感染虾活力减弱,食欲下降,肌肉发白; 72h半致死浓度(LD50)为2.51×10⁶ CFU/mL。组织病理学观察可见其肝胰腺组织病理损伤,并随感染浓度的增加或感染持续时间的延长而逐渐加重:低浓度或感染前期结缔组织间隙增大并积聚少量炎性细胞;继而肝小管管腔变形,肝细胞空泡化,部分组织坏死;高浓度或感染后期肝小管及结缔组织大面积坏死导致不可逆损伤。毒力基因检测显示该菌携带Acsv、AexT、Act、Aer、GcaT、Acg和OmpAI共7个毒力基因,表明分离菌具有较强致病性。药敏试验显示,该分离菌对头孢哌酮等16种药物敏感,对克拉霉素等10种药物耐药,仅对卡那霉素表现为中度敏...     

酿酒酵母SNF4基因敲除缺失菌株的构建

构建一株酿酒酵母SNF4基因缺失菌株并研究其对乙醇产量的影响。扩增带有SNF4基因上下游同源序列和Kanr筛选标记的SNF4基因敲除组件,转化到酿酒酵母YS2获得阳性克隆子,然后将质粒pSH65转到阳性克隆子中,半乳糖诱导pSH65表达Cre酶切除Kanr筛选标记,获得SNF4等位基因完全缺失菌株YS2-△SNF4。发酵实验结果表明,缺失菌株YS2-△SNF4乙醇产量较出发菌株提高了7.57％。利用Cre-LoxP系统,成功构建了SNF4等位基因完全缺失菌株并提高乙醇产生量。     

鳗鲡病原性维氏气单胞菌的分离与鉴定

从养殖患病的日本鳗鲡(Anguilla japonica)肾脏分离得到1株优势菌株,形态特征和生理生化测试结果显示,分离菌在4%羊血平板培养基上呈α型溶血,革兰氏阴性,有运动性,氧化酶阳性,在pH6.0和1%NaCl中生长等。结合Biolog自动微生物鉴定系统和16S rRNA、gyrB基因序列分析结果,确定该分离菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。人工腹腔注射感染鳗鲡的试验结果表明,分离菌对鳗鲡的半数致死量LD50为2.15×107CFU/mL。药敏试验结果显示,在13种抗菌类药物中,分离菌对左氧氟沙星、氟哌酸、阿奇霉素和萘啶酸等8种药物敏感,而对利福平和新生霉素等5种药物敏感度低。     

大肠杆菌ptsG基因敲除及其缺陷株生长特性研究

在大肠杆菌磷酸转移酶系统中,葡萄糖主要由ptsG基因编码的酶ⅡCB^Glc转运入细胞。利用代谢工程技术构建ptsG基因缺陷株,有望降低葡萄糖的摄取速率,减少乙酸累积,促进菌体生长。运用PCR技术,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段。经电转化,将外源DNA片段分别转入Escherichia coli DH5α、JM109中。在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上同源区域重组,将基因ptsG敲除,构建ptsG基因缺陷株DH5αP、JM109P。在LB培养基中,ptsG基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异。在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αP、JM109P的最高菌密度分别是对照菌株DH5α、JM109的3.47倍和4.25倍,ptsG基因缺陷株对葡萄糖的摄入量也明显高于对照菌株。重组蛋白肿瘤坏死因子（TNF）在DH5αP、JM109P中的表达量分别占全菌蛋白的24.3%、20.8%,A600分别为8.28、7.62,TNF在缺陷株中单位体积的表达量明显高于对照菌株。以上结果说明,大肠杆菌ptsG基因缺陷株具有良好的生长能力和表达外源蛋白的能力,在大肠杆菌高密度发酵研究方面具有良好的应用前景。     

结核分枝杆菌硫醇乙酰基转移酶基因敲除株的构建及其生物学特性分析

为探索硫醇乙酰基转移酶(mycothiol acetyltransferase,MshD)在结核分枝杆菌中的生物学特性,本实验利用噬菌体为载体的同源重组技术,构建结核分枝杆菌mshD基因敲除株、mshD基因回补株,用实时定量聚合酶链反应(real time-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)对所构建的菌株进行验证。分别收集H37Ra野生株、mshD基因敲除株、mshD基因回补株对数生长期菌液各5 mL, 离心收集菌体并培养,以观察菌落形态、生物膜形成及生长曲线测定;用5 mmol/L H₂O₂、0.05% SDS,50 ℃热激及低氧条件下分别处理基因敲出菌株和野生菌株,将菌液进行10倍梯度稀释,培养4～6周后检测抗胁迫能力并计算存活率。结果显示, 与野生株H37Ra相比,mshD基因敲除株菌落褶皱减少且菌落偏小,生长趋势较为缓慢;生物膜形成所需时间增长且褶皱明显减少;抗逆能力下降,存活率略低于野生株和回补株。揭示了mshD基因对结核分枝杆菌的生长具有重要作用,为进一步揭示该基因的功能和作用机制奠定了基础。     

鲟源致病性豚鼠气单胞菌的分离及其生长特性

从患细菌性败血综合征的杂交鲟(Husohuso♀×Acipense rruthenus♂)肝和达氏鳇(H.dauricus)腹水中共分离出4株优势菌,经人工回归感染实验测定了其致病性,并通过ATB细菌鉴定仪对致病菌株进行了鉴定,此外,研究了致病菌株的生长特性。实验结果表明,菌株XL2-T对杂交鲟和达氏鳇具有致病性。经鉴定,菌株XL2-T为豚鼠气单胞菌(Aeromonas punctata caviae);其在无菌营养肉汤中摇床振荡培养时的生长曲线:0～1.5h为生长延迟期,1.5～28h为对数生长期,28～32h为稳定期,32h以后为衰亡期;其最适生长温度为25～30℃,最适生长pH为7,在NaCl含量范围0～10%、沙拉沙星浓度范围0～40μg/ml下均能够生长,但NaCl、沙拉沙星对其生长具有较大的抑制作用。     

维氏气单胞菌菌蜕疫苗免疫后鲤免疫应答与hepcidin基因表达特征

【目的】为探讨接种维氏气单胞菌菌蜕疫苗后鲤的应答反应特征及与甲醛灭活苗的效果比较,在实验条件下研究了接种疫苗后鲤(Cyprinus carpio)的特异性、非特异性免疫指标及hepcidin基因表达量的变化。【方法】在开始实验的第1、15和29天使用菌蜕疫苗(CLGs)和甲醛灭活疫苗(FKC)对鲤进行注射3次免疫,并设一个注射磷酸缓冲液(PBS)的对照组,每个组设3个重复。从第一次免疫后每隔7 d从每个重复中随机取三尾鱼进行取样,对血清抗体滴度、相对免疫保护率(RPS)、溶菌酶(LZM)、呼吸暴发、补体C3、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)及hepcidin基因表达量进行测定。【结果】二次免疫后,CLGs组抗体凝集效价达2~6-2~8,显著高于FKC和PBS组(P0.05),且其呼吸暴发、LZM、MPO含量和hepcidin基因表达量显著高于PBS组(P0.05),MDA含量显著低于PBS组(P0.05);CLGs组C3含量在35和42 d显著低于PBS组(P0.05);FKC组MPO含量和hepcidin基因表达量显著低于菌蜕组(P0.05)。CLGs组的RPS为57.70%,FKC组RPS为30.77%。【结论】接种一定强度维氏气单胞菌菌蜕疫苗,能够提高鲤血清抗体效价和呼吸暴发、LZM、MPO等非特异性免疫指标及hepcidin基因表达,而且整体免疫效果好于甲醛灭活苗。     

克氏原螯虾源维氏气单胞菌的分离鉴定及组织病理学观察

为确定克氏原螯虾(Procambarus clarkii)暴发性死亡的病原体, 研究从一例患病克氏原螯虾的肝胰腺分离到了一株优势菌株QD160502, 根据菌株形态、生理生化特性, 16S rDNA及gyrB序列分析, 将其鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。回归感染实验证明, 该分离株可使克氏原螯虾出现与自然发病相同症状。组织病理学观察可见克氏原螯虾肝胰腺、肠道与心脏组织病理损伤, 且随感染持续时间而逐渐加重, 在感染12h后肝小管分泌细胞中出现内含棕色颗粒的转运小泡; 感染24h后肝小管间炎性细胞浸润, 肠道结缔组织萎缩, 心脏组织出现空泡样扩张; 感染48h后肝小管储存细胞与分泌细胞大量解体并空泡化, 肠道上皮皱嵴减少, 心肌空泡样扩张增加; 感染72h后肝小管和肠道上皮细胞坏死, 且在心脏组织中发现透明血细胞聚集。药物敏感性检测发现QD160502菌株对恩诺沙星、诺氟沙星、四环素、强力霉素等敏感, 但对青霉素、链霉素、卡那霉素等抗生素耐药。研究为克氏原螯虾的健康养殖和细菌性疾病的防控提供指导依据。