春兰SRAP-PCR反应体系的建立与优化

[目的]构建适合春兰SRAP-PCR反应的最佳体系。[方法]对影响PCR反应的5个变量(dNTPs浓度、Mg~(2+)浓度、引物浓度、Taq酶量、模板DNA用量)采用L16(45)正交试验设计,建立春兰SRAP-PCR最适反应体系。[结果]最佳优化体系为0.25 mmol/L d NTPs、2.50 mmol/L Mg~(~(2+))、0.80μmol/L引物、1.00 U Taq酶、200.00 ng模板DNA,共20μL。扩增程序:94℃预变性4 min,反应前5个循环在94℃变性1 min、35℃复性1 min、72℃延伸1 min的条件下运行,随后的30个循环复性温度提高至50℃,最后72℃延伸10 min。[结论]该体系有利于SRAP分子标记在春兰材料上的应用,为春兰分子遗传育种奠定了基础。     

枫香树DNA提取及SRAP-PCR反应体系的建立与优化

通过不同处理的枫香树叶片及基因组DNA提取方法的对比,并采用L16(45)正交试验设计,对影响SRAP-PCR反应体系的Mg2+,d NTPs,引物浓度及Taq DNA聚合酶和模板DNA用量等5个因素进行优化,确立枫香树SRAP-PCR最佳反应体系。结果表明,改良CTAB法提取枫香树基因组DNA的产率和纯度均可满足下游试验需要。SRAP-PCR最优反应体系为:总体积20μL,含1×PCR Buffer,1.5 mmol·L-1Mg2+,0.16mmol·L-1d NTPs,0.5μmol·L-1引物,0.9 U Taq DNA聚合酶和40 ng模板DNA。各因素对反应结果的影响大小顺序为Taq DNA聚合酶量d NTPs浓度Mg2+浓度模板DNA用量引物浓度。运用优化的SRAPPCR反应体系对10个不同居群的枫香树基因组DNA扩增检测,结果均能获得稳定性高、多态性丰富和重复性好的条带图谱。     

荷花SRAP-PCR反应体系的优化与确立

以荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)品种‘新红’叶片为材料,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素进行了优化,并确立了适用于荷花SRAP-PCR的最佳反应体系.结果表明:荷花的SRAP-PCR最佳反应体系为:反应总体积10 μL,包含2.0 mmol ·L-1Mg2+、300 μmol·L-1dNTPs、0.5UTaqDNA聚合酶、4μmol·L-1上下游引物、50 ng DNA及10×PCR Buffer.各因素水平变化对反应体系影响由大到小依次为:TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs、DNA.用48个荷花品种对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了条带清晰、多态性丰富的扩增图谱,证实了该体系的稳定性和适应性.     

用正交设计法优化臭椿SRAP-PCR反应体系

[目的]确定臭椿SRAP-PCR反应条件,为进一步研究臭椿SRAP分子标记提供依据。[方法]以新疆吐鲁番3号和江西臭椿叶片DNA为材料,利用引物组合EM1-EM8进行SRAP-PCR反应的L16(45)正交试验,建立了臭椿SRAP-PCR反应体系,新复极差法对体系进行方差分析,并对体系的稳定性进行检测。[结果]确定臭椿SRAP-PCR反应体系为:模板DNA 2.5 ng/μl、Mg2+1.75 mmol/μl、dNTPs0.3 mmol/μl、Taq酶0.3 U/μl、引物0.6μmol/μl、10×PCR Buffer 2.5μl;该体系稳定,适用于臭椿的SRAP反应。[结论]该试验优化的SRAP反应体系,将为臭椿种质资源多样性评价、分子标记,以及遗传连锁图谱构建奠定基础。     

中国兰SRAP-PCR体系的建立及优化

序列相关扩增多态性(SRAP)是新一代的分子标记技术,尚未在兰花中应用过.本实验运用改进了的CTAB法提取国兰总DNA,并L16(45)正交设计,对影响中国兰PCR反应的4个因素(引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs 浓度、扩增模版)在4个水平上进行优化试验,结果采用DPS软件分析.结果表明,在25 μl总体积中,Taq酶为1个单位的情况下,中国兰SRAP-PCR反应最佳扩增体系为: Mg2+ 2 mmol·L-1、DNA模版100 μg、dNTPs 0.25 mmol·L-1、引物0.3 μmol·L-1.这一优化的SRAP-PCR体系的建立为后续国兰SRAP分析奠定基础.     

桑树SRAP-PCR反应体系的建立与优化

以广西地方桑树种质资源＂平武1号＂为材料,以引物组合Me8/Em3对其SRAP反应体系的模板DNA、引物、dNTPs和Taq DNA聚合酶等条件进行优化。结果表明,最优反应体系为：在25.0μL反应体系中含模板DNA 45.0 ng,引物1.0μmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,Taq酶1.0 U。用42个引物组合对6份桑树二倍体品系（农桑8号、璜桑37号、湖桑197号、湖桑32号、湖桑199号、育711、桐乡青、国桑20号）及其同源四倍体进行扩增,其中引物组合Me6/Em2的扩增条带清晰,品种间有不同程度的多态性。该研究建立的反应体系应用于桑树遗传多样性研究,重复性好,稳定性强,结果可靠,可用于下一步研究。     

剑豆SRAP-PCR反应体系的建立及优化

【目的】建立和优化剑豆Canavalia ensiformis的SRAP-PCR体系,为分析剑豆遗传多样性和建立遗传图谱打下基础.【方法】首先用单因素试验法对SRAP-PCR反应体系的5个主要影响因素(Mg2+、d NTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA)各设8个浓度梯度进行试验,找到5个因素的适宜浓度范围,再采用均匀设计法进行5因素4水平和5因素3水平的2轮优化.【结果和结论】建立了剑豆SRAP-PCR最佳反应体系(25μL):Mg2+1.75 mmol/L,d NTPs 200μmol/L,引物0.36μmol/L,Taq DNA聚合酶0.06 U/μL,模板DNA 40 ng.所建立的体系稳定可靠,适用于剑豆后续的SRAP分析.     

苦楝RAPD反应体系的优化

以苦楝叶片提取的基因组DNA为材料,通过单因素多水平梯度试验,筛选DNA模板,Mg^2＋,Taq DNA聚合酶,dNTPs和随机引物的浓度及用量,建立苦楝RAPD技术分析体系.结果表明：当基因组DNA浓度为60 ng/μL,镁离子浓度为3.0 mmol/L,dNTP浓度为0.25 mmol/L,引物浓度为0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U/20μL,反应体系总体积20μL时,出现可辨认的清晰谱带.其扩增程序为：94℃预变性2 m in;然后38个循环（94℃变性30 s,37℃退火1 min,72℃延伸80 s）;最后72℃延伸8 min,4℃保存.     

正交设计优化日本落叶松SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对日本落叶松SRAP-PCR反应体系的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶浓度五因素在四个水平上进行优化试验,PCR结果采用统计软件SPSS13.0进行分析,结果表明:各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中模板DNA影响最大;筛选得到日本落叶松SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL)为模板DNA浓度为120ng·20μL-1,dNTPs的浓度为0.15mmol·L-1,引物浓度为0.3μmol·L-1,Mg2+浓度为1.5mmol·L-1,Taq酶浓度为0.SU·2μL-1.这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术对日本落叶松遗传多样性的研究奠定基础.     

无患子SRAP-PCR反应体系的优化

建立适合无患子Sapindus mukurossi的相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应(SRAP-PCR)最佳反应体系,为研究无患子种质资源的遗传多样性、亲缘关系及遗传改良等奠定基础。以南平产的无患子叶片为材料,采用单因素法对体系中的DNA模板、镁离子、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs),引物和TaqDNA聚合酶等5因素进行优化。确立了适合无患子SRAP的最佳反应体系(20μL):1×PCR缓冲液,50 ng模板DNA,2.0 mmol·L-1镁离子,0.2 mmol·L-1dNTPs,0.5×16.67 nkat(0.5 U)TaqDNA聚合酶,0.4μmol·L-1引物。利用该体系对12份无患子种源材料进行PCR扩增,获得了清晰、稳定的DNA谱带,说明优化后的体系适宜无患子地理种源的遗传多样性分析。     

苦楝SRAP分子标记及遗传多样性分析

【目的】为快速分析苦楝Melia azedarach不同种源提供方法,揭示苦楝遗传多样性,为苦楝的开发、利用及选择育种提供一定的理论依据。【方法】从783对SRAP引物组合中筛选出20对多态性较高的引物组合,对苦楝国内全分布区的37个种源和肯尼亚1个种源样品进行SRAP遗传多样性分析。【结果】20对引物组合共扩增出242条谱带,其中多态性条带101条,多态性百分率平均值为40.89%,每对引物组合扩增条带5~17条,平均每对引物扩增条带12.1条;其多态性信息量（Polymorphism information content,PIC）值介于0.188~0.488,平均值为0.299。基于UPGMA法聚类以0.350为阈值可将38个苦楝种源划分为7类,在此基础上,去掉2个种源,将其余36个种源划分5个地理类群。【结论】SRAP分子标记可以很好地反映苦楝的遗传多样性,聚类类群划分结果有明显的地理趋势和气候生态特征。     

苦楝种源幼林期生长性状地理变异的研究

【目的】了解苦楝Melia azedarach种源的生长性状地理变异及其规律,选择适宜在广东地区造林的优良种源,为苦楝造林种子调拨提供依据。【方法】采集苦楝分布区53个种源,在广州增城开展种源试验,观测了幼林期树高、地径、侧枝数、干型和冠幅等性状,分析其地理变异规律,并探讨种源地理变异的气候生态学基础。【结果】各种源在6个性状间均存在明显的差异,其中树高和地径在种源间的差异最大,变异幅度分别为5~280 cm和1.2~64.0 cm。方差分析结果显示,除干型在种源间的差异达显著(P0.05)水平,其余5个性状在种源间的差异均达到极显著(P0.01)水平。树高、东西冠幅和南北冠幅等性状的重复力达到40%以上,说明这些性状较其他3个性状在种源间的差异更为稳定,而地径重复力仅为29.92%,表明地径在种源间表现的差异稳定性较弱。苦楝苗期生长性状地理变异趋势为:采种点由南至北,苗期生长变慢,高海拔种源生长更快。各性状受纬度、经度和海拔多重控制,但各生长性状多以纬向变异为主。生长性状的地理变异存在明显的气候生态学特征。气温较高、降水丰富、气压低、平均最低气温高、日照丰富地区的种源苗期生长快,生物量大。根据种源幼林生长性状采用欧氏距离离差平方和进行聚类,可以将53个种源大致划分为6个类群,且分类群具有明显的地理格局。【结论】各种源存在明显的地理变异规律,初步挑选出生长快、生物量大、干型优良、适应性好的种源740、629、843和349作为适宜广东地区造林的优势种源。     

镉胁迫下苦楝(Melia azedarach L.)幼苗的生长及生理响应

采用盆栽试验研究不同浓度Cd(0、30、60、90、120、150、180 mg·kg~(-1))处理对苦楝(Melia azedarach L.)幼苗生长、Cd积累、光合、质膜透性以及渗透调节的影响。结果表明,当Cd2+浓度≤60 mg·kg~(-1)时显著促进苦楝幼苗生物量的积累(P0.05),Cd2+浓度60mg·kg~(-1)时抑制作用逐渐增强,但≤120 mg·kg~(-1)Cd处理对株高影响不显著(P0.05),植株能正常生长且保持较大的生物量;苦楝对Cd具有一定的积累能力,其根、茎、叶中Cd含量随Cd处理浓度的增加而增加,且根系是主要积累部位;随着Cd处理浓度的增加,叶绿素(Chla+b)含量和光合速率(Pn)下降,相对电导率(REC)和丙二醛(MDA)含量增大,但≤60 mg·kg~(-1)Cd处理时均无明显变化;随Cd浓度的升高,可溶性糖含量下降,可溶性蛋白和游离脯氨酸呈先升后降趋势,游离脯氨酸含量始终高于CK,苦楝通过增加可溶性蛋白和游离脯氨酸的含量来维持Cd胁迫下的渗透平衡,从而降低Cd毒害。上述结果表明,苦楝对Cd具有一定耐性,其耐Cd胁迫的阈值浓度大约是120 mg·kg~(-1),可以将其应用于土壤Cd污染区域,在美化环境的同时修复土壤Cd污染。     

黑翅土白蚁ISSR-PCR体系的建立与优化

采用单因子梯度优化的方法,对已初步建立的黑翅土白蚁ISSR-PCR的反应体系在dNTPs浓度、Mg²⁺浓度、引物浓度、模板量及TaqDNA聚合酶用量等方面进行了优化。结果表明,适用于黑翅土白蚁的ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为：dNTPs 0.2 mmol·L^-1,Mg²⁺ 3.0 mmol·L^-1,引物浓度0.4 μmol·L^-1,模板用量DNA 20 ng,TaqDNA聚合酶2.5 U。     

1株间座壳属真菌抗松材线虫的活性

筛选对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)有致死作用的内生真菌。从苦楝(Melia azedarach)健康组织(茎、叶、果实)中分离纯化内生真菌,菌株采用摇瓶培养,发酵液和菌丝体分别用乙酸乙酯萃取制备胞外和胞内代谢产物,采用浸渍法进行杀线虫活性筛选。共计分离纯化31株内生真菌,其中菌株J352-03的发酵液对松材线虫有显著的毒杀活性,在2 mg·mL^-1质量浓度下处理48 h,菌株J352-03胞内、胞外的次生代谢产物对松材线虫校正死亡率均达到100%,LC₅₀值分别为0.46 mg·mL^-1、0.42 mg·mL^-1;对松材线虫卵的孵化抑制率分别为66.54%、76.04%,松材线虫体内三磷酸腺苷酶(ATP酶)、过氧化氢酶(CAT)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著低于对照组。菌株J352-03经形态学与rDNA-ITS序列分析鉴定为间座壳属一未知种Diaporthe sp.。综上所述,菌株J352-03对松材线虫有良好的生防潜力,具有进一...     

暗纹东方鲀SRAP-PCR体系的建立与优化

以暗纹东方鲀基因组DNA为材料,利用正交设计L16(45)对影响暗纹东方纯SRAP-PCR反应的5个因素(Mg2、Taq酶、dNTPs、模板DNA、引物)在4个水平上进行正交组合,确立了暗纹东方鲀SRAP反应最佳体系为:20 μL的PCR体系中含有Mg2+ 1.5 mmol·L-1、Taq酶0.5U、模板DNA 75 ng、dNTPs 0.15 mmol·L-1、引物0.2 μmol·L-1.利用30个暗纹东方纯样本对该体系进行验证,结果表明该体系稳定可靠.     

福建柏组织培养体系的建立及优化

【目的】探究福建柏不同外植体再生过程中最适激素配比,为建立福建柏组织培养体系提供技术支持。【方法】以福建柏鳞叶和茎段作为外植体,在饱和洗衣粉液浸泡20 min和体积分数75%酒精浸泡30 s条件下,研究体积分数0.1% HgCl₂浸泡不同时间(5,8,10,12,15 min)后的消毒效果;以福建柏鳞叶和茎段为材料,通过单因素试验,研究生长素（NAA和2,4-D）对不同外植体愈伤组织诱导的影响,再通过正交试验研究NAA、2,4-D、6-BA不同配比对外植体愈伤组织诱导的影响;以福建柏愈伤组织为材料,采用正交试验研究NAA、2,4-D、6-BA、KT对愈伤组织继代增殖的影响;以福建柏带芽茎段为材料,研究细胞分裂素6-BA对芽诱导和萌发的影响;以福建柏分化苗为材料,采用正交试验研究6-BA、2,4-D、KT对分化苗继代生长的影响;以福建柏无根苗为材料,研究无根苗扩增繁殖的效果。【结果】（1）福建柏鳞叶最适消毒配方为体积分数75%酒精30 s+体积分数0.1% HgCl₂ 10 min,污染率为16.67%;茎段为体积分数75%酒精30 s+体积分数0.1% HgCl₂ 15 min,污染率为23.33%。（2）鳞叶愈伤组织诱导最适配方为MS培养基+NAA 2.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L,诱导率为81.67%;诱导出的愈伤组织白色近透明,长势良好。而茎段为MS培养基+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L,诱导率为78.33%,诱导出的愈伤组织淡绿色,长势良好。（3）愈伤组织最适增殖配方为MS基本培养基+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L,增殖质量为1.984 g,褐化率23.33%。（4）芽诱导萌发最适配方为MS基本培养基+6-BA 2.0 mg/L,平均诱导芽数2.05个,平均萌动数1.70个,分化率100%。（5）分化苗生长和扩繁的最适配方为1/2MS基本培养基+2,4-D 0.5 mg/L+KT 1.0 mg/L,平均生长长度为2.241 cm,无褐化,扩繁成活率为95.50%,扩繁系数为3.18。【结论】福建柏以带芽茎段作为芽增殖再生途径外植体,鳞叶作为愈伤组织再生途径的外植体进行组织培养效果最佳,长势好且稳定。     

苦楝内生真菌的初步分离和筛选

从苦楝（Meliaazedarach L．）的根、茎、叶、果实中分离得到99株14个属的内生真菌（33株因不产孢子未鉴定）。其中7月分离得到7个属，10月得到14个属的内生真菌。由分离结果可知，根、茎中内生真菌的属多于叶和果实，且曲霉属的灰绿曲霉组、链格孢属和未见孢子Ⅰ在全株均有分布。对各菌株次生代谢物进行检测，可知O-L-5、O-SCⅡ-4和O-RC-3能产生较多的苦楝素，为目的菌株。     

枸杞SRAP反应体系建立和优化

以宁杞1号为试验材料,探讨Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度、模板DNA用量对枸杞SRAP-PCR反应的影响.建立20μL反应体系,模版DNA 50 ng,Buffer 1×,Mg2+1.5 mmol.L-1,dNTPs 0.3 mmol.L-1,引物0.3μmol.L-1,Taq DNA聚合酶用量为1 U,并利用该反应体系,两对不同引物组合Me1/Em1和Me3/Em5对12份枸杞样品DNA进行SRAP-PCR扩增,1.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,不同品种(系)间DNA谱带多态性丰富,说明该体系稳定可靠.