“人流血”中早孕因子的分离、纯化及鉴定

目的　分离、纯化并鉴定“人流血”中的早孕因子。方法　采用DEAE纤维素离子交换层析 ,S Sepharosefastflow离子交换层析 ,ConA SepharoseCl 4B亲和层析 ,Heparin SepharoseCl 6B亲和层析等方法进行纯化。用花结抑制实验检测出其活性。以SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其肽图。以等电聚焦电泳法检测其等电点。结果　从人流血中分离出EPF活性样物质 ,其蛋白含量为 0 .375mg/ml,SDS PAGE见 1条均匀带 ,其相对分子质量为2 6 5 0 0 ,等电点为 6 .87。结论　本研究提取的早孕因子性质与国内外报道的从妊娠初期孕妇血清中提取的基本一致     

人和BALB/c小鼠对梭子蟹过敏组分的比较及主要过敏原的分离纯化

目的比较人和BALB/c小鼠对梭子蟹过敏的组分差异,评价用小鼠构建过敏模型对研究人类过敏症的可靠性,并对主要过敏原进行分离纯化。方法制备梭子蟹蛋白浸液,经皮下注射建立小鼠过敏模型,获得特异的小鼠IgE(sIgE)血清,同时收集蟹过敏患者血清,采用Western blot法鉴定蟹的过敏组分,通过硫酸铵分段盐析和DEAE离子交换层析对主要过敏组分进行分离纯化。结果用梭子蟹蛋白浸液成功建立了BALB/c小鼠过敏模型,并获得了高效价的sIgE血清。梭子蟹中有一相对分子质量为89 000的蛋白组分为人和小鼠共有的主要过敏原,通过硫酸铵分段盐析法和DEAE离子交换层析法分离到了该组分。结论小鼠和人对梭子蟹过敏的组分基本一致,提示小鼠过敏模型可成为人类过敏症研究的可靠动物模型,纯化单一的过敏原组分有望提高过敏症诊断和治疗的特异性。     

重组人溶菌酶的分离纯化及鉴定

目的建立重组人溶菌酶(human lysozyme,h LYZ)的分离纯化方法,并对纯化产物进行鉴定。方法采用固液分离、膜过滤、疏水层析及离子交换层析对hLYZ进行分离纯化;SDS-PAGE及HPLC法检测hLYZ纯度;按《中国药典》二部(2015版)蛋清溶菌酶效价检查法检测其效价;Western blot法检测其特异性;基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其相对分子质量。结果该分离方法可获得单一组分的重组hLYZ;SDS-PAGE检测纯度达99%,HPLC分析纯度达98. 8%;纯化后的hLYZ可与抗人LYZ抗体特异性结合,活性为1. 2×105 U/mg,相对分子质量为14 697。结论建立的分离纯化方法易操作,成本低,得到的hLYZ纯度大于98%,该分离方法可用于hLYZ的规模化生产。     

胸腺素α1串联体的表达、纯化及生物学活性检测

目的　表达胸腺素α1 (Thymosinalpha1,Tα1 )三串体 ,并进行纯化及生物学活性鉴定。方法　使用大肠杆菌偏爱密码子 ,人工合成Tα1 三串体 (Tα1 ③ )基因 ,在表达载体pET -2 2b(+)中克隆 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,经DEAE SepharoseFF阴离子柱纯化Tα1 ③蛋白 ,采用Westernblot鉴定表达产物 ,MTT法检测其生物学活性。结果　获得了纯化的Tα1 ③蛋白 ,相对分子质量约为 10 0 0 0 ,并具有Tα1 ③的生物学活性。结论　利用基因串联表达小分子多肽是一种可行的方法。     

HPV16 MuE6/E7嵌合蛋白的原核表达、纯化及其免疫效果

目的表达HPV16型MuE6/E7嵌合蛋白,并检测其免疫原性及抗肿瘤活性。方法将构建的重组MuE6/E7蛋白的表达载体转化大肠杆菌BL21(λDE3)进行诱导表达,表达的包涵体蛋白经分离、纯化、变性及复性后,通过离子交换和分子筛层析进行纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot、HPLC和质谱分析鉴定,并免疫C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性。结果重组MuE6/E7蛋白相对分子质量约为21 000,表达量约为23.06%,表达形式为包涵体,经复性、纯化后,纯度达97.17%。免疫3针后,小鼠可产生高滴度的HPV特异性抗体,并且与注射剂量呈正相关。免疫小鼠能抵抗TC-1肿瘤细胞的攻击,并可延长TC-1致瘤小鼠的存活期。结论已表达并纯化了重组MuE6/E7蛋白,其对TC-1致瘤小鼠具有一定的免疫治疗作用,为进一步研制HPV治疗性疫苗奠定了基础。     

抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组蛋白p GEX-MIC6作为抗原免疫BALB/c小鼠,收集脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,对融合后的杂交瘤细胞进行筛选后,经腹腔注射BALB/c小鼠,制备腹水,鉴定单抗的亚类。采用辛酸-硫酸铵法结合蛋白亲和层析柱纯化腹水,SDS-PAGE分析抗体的相对分子质量,间接ELISA法检测抗体效价及特异性,BCA蛋白浓度检测试剂盒测定抗体浓度。结果最终获得两株能稳定分泌新孢子虫MIC6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A1和1H11,分泌的抗体分别属于Ig G1和Ig G2b亚类。纯化后的腹水经SDS-PAGE分析,分别可见相对分子质量约为50 000的重链和25 000的轻链条带,纯化效果较好;1A1和1H11的腹水效价分别为5.12×104和1.024×105,浓度分别为0.935和2.010 mg/ml,两株单抗均能特异性识别新孢子虫,与弓形虫无交叉反应。结论制备的抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体特异性较强,为进一步研究新孢子虫MIC6的生物学功能及建立特异敏感的新孢子虫检测方法奠定了基础。     

Pichia酵母表达重组人可溶性TRAIL的纯化与生物活性

目的分离纯化Pichia酵母表达的重组人可溶性TRAIL,并检测其生物活性。方法以Pichia酵母分泌型表达TRAIL,采用硫酸铵沉淀和柱层析纯化可溶性TRAIL蛋白。以SDSPAGE、ESIMS和Westernblot法鉴定其纯度及特异性。以细胞透射电镜、DNALadder和MTT法检测其诱导肿瘤细胞凋亡活性。结果目的蛋白以可溶形式存在,蛋白相对分子质量22000,纯化后纯度95%。Westernblot证实为TRAIL蛋白。电镜、DNALadder和MTT均证实其具有诱导肿瘤细胞凋亡活性。结论Pichia酵母表达rhsTRAIL可用柱层析法纯化,并具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性。     

重组人Tau蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 重组人Tau蛋白的诱导表达和纯化。方法 将携带 Tau蛋白基因的工程菌株经IPTG诱导表达后,通过超声破碎、硫酸按盐析、离子交换层析、电洗脱等方法纯化Tau蛋白,以SDS-PAGE、非变性PAGE、Westem blot和N末端氨基酸测定等方法进行鉴定。结果 纯化Tau蛋白的得率为28.5％,在SDS-PAGE和非变性PAGE上呈均一的蛋白条带,其相对分子质量约为59000,N末端5个氨基酸测定结果为NH2-Met-Ala-Glu-Pro-Arg-。结论 本实验采用纯化重组人Tau蛋白方法是可行的。     

自制填充介质对人血浆凝血因子Ⅸ的层析分离

目的采用自制的DEAE Bio-SepFF和肝素Bio-Sep FF介质,从人血浆中快速分离纯化凝血因子Ⅸ(FⅨ)。方法低温离心去除冷沉淀后的人血浆,在不同淋洗条件下,经过两步弱阴离子交换和一步亲和层析分离纯化FⅨ,用活性检测试剂盒检测各组分凝血因子的活性,Bradford法测定蛋白浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品的纯度。结果经过三步层析分离,得到的FⅨ比活达到99.40IU/mg,纯化倍数为3823倍,回收率约为30%,纯度较高。结论采用该方法和介质,可从人血浆中纯化FⅨ,且效果较好。     

人组织激肽释放酶成熟蛋白的纯化及活性分析

目的　制备纯化人组织激肽释放酶 ,并检测其生物活性 ,为中试放大及纯化工艺奠定基础。方法　使用麦芽糖 (MBP)融合分泌载体pMBP P ,构建并筛选出 1株工程菌株 ,在 6L培养基中经IPIG诱导表达人组织激肽释放酶融合蛋白。目的蛋白经亲和层析纯化及凝血酶切割后 ,采用电位滴度法测定其活力。结果　筛选出的工程菌株表达相对分子质量约 70 0 0 0的激肽释放酶融合蛋白 ,大小与预计大小相符。纯化后共获得 2 8mg蛋白 ,并具有水解苯甲酰精胺酸乙酯 (BAEE)的能力。结论　成功进行了人组织激肽释放酶融合成熟蛋白的小量制备 ,经纯化后的产物具有生物活性 ,为中试放大、纯化工艺研究奠定了基础。     

破伤风毒素及其片段的纯化

本文报道了破伤风毒素及其片段AB、BC、A和C的纯化方法。应用硫酸铵沉淀和Ultrogel AcA_(34)凝胶过滤制备的纯化毒素,于SDS-PAGE和PAGE中均形成单一的蛋白带,分子量为15万,pI为5.95,毒力为1～3×10~4MLD/μg。毒素经DTT还原、尿素处理、再用Ultrogel AcA_(44)凝胶过滤制备A和BC片段。A片段的分子量为54000,pI为4.8。BC片段的分子量为98 000,pI为7.2。木瓜酶处理毒素后用高压液相层析制备AB和C片段。纯化的AB片段分子量为98 000,于等电聚焦中为2条主要区带,pI为5.3和5.5,另有数条小区带;纯化的C片段分子量为51000,于PAGE中形成5条蛋白带,于等电聚焦中主要区带的等电点为7.3,另有几条小区带。     

载脂蛋白A—Ⅰ的简易快速提纯方法

本文应用Phenyl-Sepharose CL-4 B、DEAE-Sepharose CL-6 B和Sephadex G-200柱层析法,分离提纯人血浆载脂蛋白A-I (apoA-I)。获得的制品在SDS-PAGE上为一条蛋白带,进行双向免疫扩散与兔抗人apoA-I抗血清有特异的免疫沉淀反应,免疫电泳检查与抗人全血清抗血清反应只形成单一沉淀弧,分子量和氨基酸组成与文献报道相符。本提纯方法具有简便、快速、不需要超速离心机等优点。     

重组类人胶原蛋白的分离纯化

目的 建立重组类人胶原蛋白分离及纯化工艺。方法 将工程菌株E.coli BL21 3.1在L1523型12.8L自控发酵罐中培养14h,发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后,依次经DEAE-52和Sephadex G-100柱层析分离纯化。结果 发酵菌体干重达到71g/L,表达量为菌体蛋白量的29.4％,最终产物纯度达98％,回收率为80.5％,纯化倍数为3.4。结论 纯化的类人胶原蛋白达电泳纯,相对分子质量为90 000,N端序列为NH_2-H-D-P-V-V-L-Q-R-R-D-W-E-N-P-G,均与其因序列设计一致。     

重组人抗HBs-Fab抗体的纯化及结构分析

目的研究重组人抗HBs-Fab抗体的纯化工艺,并对其结构等特性进行分析。方法采用离子交换-分子筛层析法分离纯化由酵母工程菌(GS115/Fab)发酵的重组人抗HBsAg Fab抗体,并经ELISA检测其抗体活性,等电聚焦电泳法检测其等电点(pI),基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测其相对分子质量和肽质量图谱。结果纯化的重组Fab抗体的纯度可达90%以上,经Sephacryl-100进一步层析后,纯度达99%以上,总收率可达80%以上。Fab抗体具有较好的抗体活性,其pI值为7·6,为一碱性蛋白,相对分子质量为50494,比其理论值约多2579·35,经Endoglycosidase H内切酶消化后的相对分子质量为49609,证明Fab的一级结构中有糖基化现象,且分布于Fab抗体的H链和L链上。胰酶酶解肽段中有21个与理论肽段相符,另检测到1对二硫键正确。结论已建立了重组人抗HBs-Fab抗体的稳定的纯化工艺,且Fab抗体的一级结构正确。     

牛神经生长因子的研制

目的 寻找新的制备神经生长因子的材料和方法。方法 利用牛精液为原料，进行两次阳离子交换层析。结果 获得了纯的牛神经生长因子，相对分子质量为30000，比活性为400000BU/mg，FPLC检测结果为一个峰，电泳检测纯度大于95％。结论 可以从牛精液中制备神经生长因子。     

葡萄球菌蛋白A的纯化新工艺

目的建立一种高效、简便、实用的分离纯化葡萄球菌蛋白A(SPA)的工艺。方法采用超声波破菌和IgG-Sepharose4B亲和层析分离纯化SPA;以Lowry法检测蛋白含量;双向琼脂免疫扩散法测定效价和特异性;用还原和非还原SDS-PAGE法检测纯度和相对分子质量。结果此法制得的3批SPA的蛋白含量分别为4·7、4·4和5·4mg/ml,收率分别为2·70、2·64和3·78g/100g湿菌。对人IgG的免疫双扩散效价均为1:64;与正常人、豚鼠、家兔和小鼠的血清反应均出现一条沉淀线,而与鸡和羊不出现沉淀线。经非还原SDS-PAGE检测只呈现一条蛋白带,相对分子质量约为160000～180000;经还原SDS-PAGE检测呈现两条蛋白带,相对分子质量分别约为67000和34000。结论已成功建立了分离纯化SPA的新工艺。     

肺炎链球菌表面蛋白C对人嗜中性粒细胞释放CXCL8的影响

目的原核表达肺炎链球菌表面蛋白C(Pneumococcal surface protein C,PspC),并分析该蛋白对人嗜中性粒细胞释放CXCL8的影响。方法将重组质粒pET-32a(+)/PspC转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达TRx-His-PspC融合蛋白并纯化;通过肠激酶切掉融合蛋白的TRx-His部分,获得PspC蛋白,免疫小鼠,获得抗PspC抗体。分离人外周血嗜中性粒细胞,经MTT法检测PspC蛋白对嗜中性粒细胞增殖活力的影响;QRT-PCR检测PspC蛋白及抗PspC抗体对人嗜中性粒细胞释放CXCL8的影响。结果表达的TRx-His-PspC融合蛋白相对分子质量约为80 000,目的蛋白约占菌体总蛋白的21%,可与His Tag McAb特异性结合。获得的PspC蛋白相对分子量约为60 000,免疫小鼠获得了高滴度的抗PspC中和抗体(1∶12 000)。分离的人外周血嗜中性粒细胞纯度>98%,活细胞比例大于96%,经不同浓度的PspC蛋白刺激人嗜中性粒细胞,不会引起宿主细胞的细胞毒作用;不同浓度的PspC蛋白刺激人嗜中性粒细胞8 h后,CXCL8基因mRNA转录水平显著上调(P<0.01),且呈剂量依赖性;CXCL8的释放均呈剂量依赖性增强(P<0.01),且24 h高于12 h;抗PspC抗体可显著抑制PspC蛋白刺激人嗜中性粒细胞释放CXCL8。结论 PspC蛋白可上调人嗜中性粒细胞趋化因子CXCL8的合成和释放,揭示了嗜中性粒细胞和肺炎链球菌致病因素之间的关系,为控制肺炎链球菌侵入性疾病奠定了基础。     

人层粘连蛋白α4链LG1组件融合蛋白的表达

目的表达重组人层粘连蛋白α4链LG1组件(HumanLamininAlpha4LG1Module,hLNα4LG1)蛋白并检测其抗原性。方法采用RTPCR方法从人胎盘组织扩增hLNα4LG1的cDNA片段,用TA克隆法将其插入pMD18T载体进行测序。用DNA重组技术构建原核表达载体pET28aLG1,用BL21(DE3)pET系统表达hLNα4LG1融合蛋白,SDSPAGE鉴定表达产物,用NiNTA亲和柱对表达蛋白进行纯化,并进行Westernblot分析。结果已成功获得hLNα4LG1cDNA序列,与GenBank中序列同源性为100%。12%SDSPAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)pET28aLG1总蛋白中出现一条相对分子质量为26000的新蛋白带,纯化后目的蛋白纯度达90%以上,且Westernblot可特异地检测到目的蛋白所对应转移带。结论成功表达和纯化hLNα4LG1蛋白,且具有良好的抗原性,为研究LG组件在疾病发生过程中的作用及其功能位点打下了基础。