口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的高效表达

将牛源O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)China／99株非结构蛋白基因3ABC从pGEM-T-3ABC重组质粒中亚克隆到原核表达载体pTriEx-4Neo上,成功构建重组表达质粒pTriEx-3ABC。将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达,表达产物经SDS-PAGE可检测到分子量约为59．1ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的31．4％。Western blotting分析证明表达产物能被FMDv阳性血清所识别。表达产物纯化后作抗原进行ELISA检测,结果表明,表达的蛋白显示特异的免疫学活性,并能区分自然感染动物和注苗动物。研究为以FMDV非结构蛋白为抗原,建立自然感染动物和注苗动物的鉴别诊断方法提供了材料。     

口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术，扩增出口蹄疫病毒（FMDV）VP2基因，并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞，获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后，感染sf9细胞，表达VP2融合蛋白，分子质量为33ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体，通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定，说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达，且可以与牛抗。型FMDV血清发生特异性反应。     

3A蛋白间接ELISA试验检测猪口蹄疫感染抗体的研究

用表达的口蹄疫3A蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA试验，对口蹄疫病毒感染血清、免疫血清和其它非口蹄疫病毒血清进行了检测研究。结果表明，3A蛋白间接ELISA试验对口蹄疫具有较好的特异性，可以区分感染口蹄疫病毒的猪血清和疫苗免疫猪血清。     

Asia1型FMDV非结构蛋白3A基因的克隆、表达与抗原性鉴定

为了研究Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A的抗原性,试验对Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3A基因进行扩增、亚克隆及测序,将3A克隆至表达载体pET-32a(+)中,选取阳性克隆转化Rosetta(DE3)pLysS大肠杆菌感受态细胞,用IPTG诱导表达和纯化3A蛋白,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-blot分析。结果表明:在大肠杆菌中成功地表达了3A蛋白,表达的目的蛋白能与Asia1型FMDV阳性血清发生特异性反应。说明非结构蛋白3A具有较好的抗原活性。     

口蹄疫病毒VP2基因的原核表达及抗原性检测

将口蹄疫病毒VP2基因连接到原核表达载体pPROEX^TM HTb上，获得重组质粒pPR-VP2。将此质粒转化感受态菌DH5α中，经终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导，1h～6h依次收集菌液，SDS-PAGE电泳分析，在4h后表达量可达到高峰。经过软件分析，表达产物占总菌体蛋白的23．1％，大小为33Ku左右。根据Ni-NTA纯化系统说明操作，获得较纯的VP2融合蛋白。以牛抗O型口蹄疫病毒血清为第一抗体，通过Western blot和Dot ELISA鉴定，纯化后的VP2融合蛋白可以与牛抗O型口蹄疫病毒血清发生特异性反应。     

口蹄疫3ABC蛋白基因的克隆与序列分析的研究

采用RT—PCR扩增FMDV的3ABC蛋白DNA，将其与pUCm—T栽体连接，构建pUCm—3ABC重组质粒，序列分析表明，pUCm—3ABC重组质粒的插入DNA与多种血清型FMDV的相同DNA区段有较高的同源性，提示可进一步用pUCm—3ABC重组质粒研究FMDV3ABC蛋白的表达抗原。     

口蹄疫非结构蛋白3ABC的融合表达及纯化研究

扩增了口蹄疫非结构蛋白3ABC基因，经双酶切后与表达载体pQE30Xa连接，构建了重组质粒pQE3ABC，并转化到宿主菌M15中进行表达，并对表达条件进行了优化。Western-blot结果表明，所表达的蛋白氨基酸序列正确，且表达的融合蛋白可与标准抗FMDV-O抗体特异性结合。本研究在大肠杆菌中成功地表达了口蹄疫非结构蛋白3ABC，为研制和开发口蹄疫感染和注苗动物鉴别诊断试剂盒奠定了基础。     

口蹄疫病毒P1 2A和3C基因重组逆转录病毒表达载体的构建

以A型口蹄疫病毒（FMDV）AV88（L）和XJ99株的P12X基因和AV88（L）3C基因的阳性克隆质粒为模板，用PCR扩增各基因片段，酶切后分步定向亚克隆至逆转录病毒表达载体pBABE-puro上经PCR、酶切鉴定及测序。结果表明，获得了2个含不同RGD基序的A型FMDV衣壳蛋白和蛋白酶基因的重组逆转录病毒表达载体pBABE-AV88（L）P1 2X3C和pBABE-XJ99 P1 2X3C，为研究安全、高效、低成本的FMDV空衣壳亚单位疫苗奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆及3AB基因的原核表达

从感染口蹄疫病毒 (foot- and- m outh disease virus,FMDV)的细胞中提取总 RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT- PCR)获得了长度约为 14 0 0 bp的核酸片段 ,与预期长度相符。扩增产物经克隆后 ,测序证明其含有完整的 3ABC基因。该序列与国外参考序列 0 1K/ 6 6相比 ,同源性在 99%以上。亚克隆 3ABC基因至表达载体 p Tri Ex- 4 Neo中 ,通过序列分析发现 ,克隆到 p Tri Ex- 4 Neo载体上的片段于 3ABC基因 70 9～ 72 5 bp之间有 17bp的缺失 ,碰巧在 3AB基因后形成一终止密码子 ,但 3AB基因的阅读框架完整。选出含有 3AB基因完整阅读框架的阳性克隆 ,用 IPTG诱导表达 ,收集菌液进行 SDS- PAGE电泳、Western blotting分析 ,结果表明 ,3AB基因在大肠杆菌中成功表达 ,其表达产物为分子质量 33.5 ku的融合蛋白 ,并能被口蹄疫病毒阳性血清识别。经薄层扫描分析 ,表达的目的蛋白占总蛋白量的 2 6 %以上。该项研究为应用重组 FMDV非结构蛋白为抗原建立感染和免疫的鉴别诊断方法提供了依据     

口蹄疫病毒O/Laos/00株非结构蛋白3A基因特征分析

经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增得到口蹄疫病毒O/Laos/00株的非结构蛋白3A基因核苷酸序列,与其他8株代表性参考毒株的3A基因进行比较,分析口蹄疫病毒3A基因的特征.结果表明:O/Laos/00株3A基因含有429核苷酸,编码143氨基酸残基.9株病毒3A氨基酸序列相比较,可分成3种不同的类型:一类是具有全长3A的毒株,一类是具有133～143位氨基酸缺失的毒株,这两类毒株均来源于牛体,核苷酸差异小(＜15 %);另一类是具有93～102位氨基酸缺失的毒株,毒株相互之间核苷酸差异较大(7.25 %～22.2 %).     

O型口蹄疫病毒VP1基因在2种原核表达载体上的表达

设计1对引物将口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)VP1基因克隆到T载体上,通过NdeⅠ和Xho Ⅰ双酶切VP1基因和pET-28(a),在T4连接酶的作用下构建重组表达载体pET-28a-VP1;然后用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切VP1基因与pET-41(a),在T4连接酶的作用下构建重组表达载体pET-41a-VP1;然后将这2个新构建的载体分别通过热冲击法转化BL21(DE3),37℃不同IPTG浓度和32℃、0.01 mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示pET-28a-VP1的表达量高于pET-41a-VP1,在DTT和乙醇的作用下,二者均没有可溶性蛋白出现.     

猪口蹄疫病毒抗原位点及其抗原性差异分析

为了分析 3株猪口蹄疫病毒 ( FMDV- B、D、S)的抗原位点 ,采用 5株具有 EL ISA反应特性的抗猪口蹄疫病毒的单克隆抗体 ( Mc Ab- A6、F9、G17、G5 2、S2 5 ) ,通过 EL ISA试验分别测定 3个抗原的最适包被浓度以及 5株单抗对各抗原的饱和工作浓度。 EL ISA叠加试验的增值结果表明 ,5株 Mc Ab分别针对 4个不同的抗原位点 ,其中 Mc Ab- A6和 F9识别同一个抗原位点。FMDV- B株含有这 4个不同抗原位点 ,而 FMDV- D、S株只有 3个抗原位点 ,没有 Mc Ab-A6、F9识别的抗原位点。根据抗原位点差异 ,可以将 3个毒株分成 2个不同组     

口蹄疫病毒完整病毒粒子定量方法的研究进展

口蹄疫疫苗的有效抗原成分为完整的口蹄疫病毒粒子(146S),疫苗的效力与疫苗中含有的146S具有极大的相关性。因此对疫苗的生产过程及产品进行146S的定量检测是非常重要的环节。目前对146S定量的方法主要是超速离心的方法,除此之外,ELISA检测也越来越受到关注,同时很多研究人员也在积极探索其他更为简便快捷的检测方法。作者主要对各种146S的定量方法作一综述。     

抗猪口蹄疫病毒单克隆抗体的抗原识别位点分析

用ELISA叠加试验，对5株具有ELISA反应特性的抗猪口蹄疫病毒(FMDV)单克隆抗体(McAb—A6、F9、G17、G52、S25)的抗原识别位点进行检测。抗体反应增值结果表明，5株单抗分别针对4个不同抗原住点，McAb—G17、G52、S25识剐的住点各不相同，其中McAb—G7、G52识别的位点有部分重叠，McAb—A6、F9识别同一位点，位于G17、G52位点的重叠区内。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因的克隆表达及3B-ELISA鉴别诊断方法的初步建立

从口蹄疫病毒（foot—and—mouth disease virus，FMDV）细胞培养物中提取总RNA，经一步法RT—PCR获得了长约230bp的3B基因片段，将PCR产物连接到pMD-18T载体上并测序，用BamH Ⅰ与Hind Ⅲ双酶切后，将3B基因融合到pGEX—KG载体上形成表达质粒pGEX—KG—3B，转化到BL21（DE3）中在27C诱导表达，将表达产物进行SDS—PAGE和蛋白质斑点ELISA。结果表明3B基因主要以可溶形式高效表达，表达产物具有免疫原性。以纯化的表达产物为抗原建立了间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）。方阵滴定其最佳包被浓度是6．1μg／孔，最佳血清稀释倍数为1：80，通过测定36份FMDV阴性血清，确定了该方法的阳性判定标准。结果表明，该方法特异性强、重复性好；用3B—ELISA方法与美国联合生物医学公司（UBI）生产的合成肽检测试剂盒UBI FMDV NS-ELISA对比检测44份血清样品，符合率为93．1％。证明3B—ELISA方法可用于口蹄疫的鉴别诊断。     

猪口蹄疫和水泡病病毒免疫鉴别诊断方法的比较研究

通过单克隆抗体斑点酶联免疫吸附试验（ＭｃＡｂＤｏｔＥＬＩＳＡ）和反向间接血凝试验（ＲＩＨＡ）分别对猪口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）和水泡病病毒（ＳＶＤＶ）检测比较。试验表明,ＭｃＡｂＤｏｔＥＬＩＳＡ特异性强,快速简便,比ＲＩＨＡ更为敏感、稳定、直观。本研究在猪口蹄疫和水泡病单抗联合诊断药盒的研制方面是一个有益的尝试。     

利用SUMO表达系统高效表达猪O型口蹄疫病毒VP0、VP1、VP3基因

根据GenBank中公布的猪O型口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)全基因合成了FMDV结构蛋白前体蛋白P1基因,同时设计了扩增FMDV结构蛋白VP0、VP1和VP3基因的引物。以P1基因为模板,分别经PCR扩增获得FMDV VP0、VP1和VP3基因。扩增产物克隆于Blunt载体中,酶切后将目的片段连接到原核表达载体SUMO中,构建重组表达质粒SUMO-VP0、SUMO-VP1和SUMO-VP3,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳可见融合蛋白均获得高效表达,融合蛋白表观分子质量分别约为55、48和40 ku。在IPTG浓度为1.0 mmol/L,温度为37 ℃,诱导5 h时融合蛋白表达量最大。Western blotting结果表明,融合蛋白均可被FMDV阳性血清识别,反应原性良好。     

口蹄疫病毒VP1基因的原核可溶性表达

针对重组原核表达载体表达目的蛋白以包涵体形式存在的问题,作者对影响外源蛋白表达的IPTG的浓度、温度、时间等因素均进行了探索.以观察VP1蛋白的可溶性情况.通过PCR技术将VP1基因克隆至pGEM-T载体中,然后将pET-28a(+)和pGEM-T载体分别进行双酶切.构建重组的pET-28a-VP1载体,将重组载体转化至BL21中,诱导后经SDS-PAGE检测可见约29 ku的目的蛋白条带.插入的外源目的蛋白主要以包涵体的形式存在,上清中的可溶性蛋白甚微.试验结果表明,这可能与蛋白本身的氨基酸组成有重要关联.