Bcl-2反义寡核苷酸诱导HL-60细胞凋亡的研究

目的：探讨bcl-2反义寡核苷酸诱导ＨＬ－６０细胞的凋亡。方法：将人工合成的bcl-2反义寡聚脱氧苷酸片段与ＨＬ－６０,细胞共培养,在作用的第０天、３天、５天通过免疫组化法（ＡＰＡＡＰ法）检测细胞内bcl-2蛋白表达水平的变化,通过流式细胞仪分析细胞凋亡的情况。结果：bcl-2反这寡核苷酸可下调ＨＬ－６０细胞内bcl-2的蛋白表达水平,其作用与其浓度和时间呈正相关,同时可诱导细胞凋亡,而bcl-2反义寡核苷酸及对照无此作用。     

bcl—2反义寡核苷酸抑制HL—60细胞增殖的研究

目的 研究ｂｃｌ－２反义寡核苷酸在抑制ＨＬ－６０细胞增殖和下调细胞内ｂｃｌ－２蛋白表达水平的作用。方法 将人工合成的ｂｃｌ－２反义寡核苷酸片段与ＨＬ－６０细胞共培养,在作用的第０天,１天,３天,５天通过细胞计数和锥虫蓝染色法检测细胞的生长,存活情况,同时通过免疫组化法（ＡＰＡＡＰ法）检测细胞内ｂｃｌ－２蛋白表达水平的变化情况,结果 ｂｃｌ－２正,反义寡核革酸均可抑制ＨＬ－７０细胞增但ｂｃｌ－２反义     

bcl-2/bcl-xL反义寡核苷酸对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的　观察靶向bcl 2 /bcl xL基因的反义寡核苷酸 (ASODN )对乳腺癌细胞株MCF 7增殖和凋亡的影响。方法　将bcl 2 /bcl xLASODN及其对照序列通过脂质体转染MCF 7细胞。采用MTT法测定MCF 7细胞增殖 ,荧光显微镜定量检测MCF 7细胞凋亡率。结果　与对照序列相比 ,bcl 2 /bcl xLASODN能抑制MCF 7增殖和诱导其凋亡 (P <0 .0 1)。结论　bcl 2 /bcl xLASODN在乳腺癌治疗方面作为 1种新的化合物值得进一步研究     

脂质体转染bcl-2反义寡核苷酸诱导Raji细胞凋亡的研究

目的:通过脂质体分别转染bcl-2两个靶点的反义寡核苷酸(ASODN1、ASODN2)及G3139,观察bcl-2反义寡核苷酸对淋巴瘤细胞株Raji凋亡的影响.方法:采用MTT法检测药物的半数抑制率(IC50);免疫荧光标记观察细胞bcl-2蛋白水平;用姬姆萨染色和流式细胞仪观察细胞凋亡.结果:MTT测定显示:ASODN1、ASODN2组IC50值分别与G3139组进行比较无显著差异,P＞0.05.5μmol/L ASODN1、ASODN2作用于Raji细胞72h后,姬姆萨染色均可见凋亡细胞.5μmol/L ASODN1、ASODN2和C3139作用于Raji细胞后,bcl-2蛋白阳性率均明显下降,细胞凋亡率均明显增加,P<0.05,但ASODN1、ASODN2组分别与G3139组进行比较无显著差异,P＞0.05.5μmol/L无义寡核苷酸对Raji细胞的生长活性、bcl-2蛋白水平及细胞凋亡率均无明显影响,P>0.05.结论:针对bcl-2两个靶点的反义寡核苷酸能特异性促进Raji细胞的凋亡,并且与G3139具有近似的反义效应.     

hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞凋亡及细胞周期的影响

目的:研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞诱导凋亡作用及细胞周期的影响。方法:应用hTERT ASODN封闭HL-60细胞hTERT基因,RT-PCR方法检测目的基因的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分析,TUNEL方法检测细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞DNA梯带。结果:hTERT ASODN作用细胞72h后,hTERT基因表达明显受到抑制(P<0.01)。流式细胞仪检测显示:ASODN组细胞阻滞于G₀/G₁期,S、G₂/M期细胞减少(P<0.05);细胞增殖指数(PI)明显降低(P<0.05);检测出早期凋亡峰。Annexin V/PI检测及TUNEL检测均显示:ASODN组凋亡细胞阳性率明显高于SODN组(P<0.01)。琼脂糖凝胶电泳显示:ASODN组出现凋亡DNA梯带。结论:hTERT ASODN能够封闭目的基因表达,阻滞HL-60细胞于G₀/G₁期,并诱导细胞凋亡,对治疗白血病具有潜在应用价值。     

bcl-2 siRNA的设计、合成及其对HL-60 bcl-2基因表达的干扰作用

 目的 应用RNA干扰技术研究bcl-2 siRNA对白血病细胞HL-60 bcl-2基因表达的干扰作用。方法 扫描bcl-2 mRNA的全序列,记录从AUG启动子的AA及下游19个核苷酸肽作为潜在作用靶点。GC含量控制在30 % ~ 65 %之间。由BLAST分析排除与其他基因有高度同源性的序列。由体外转录合成法合成双链bcl-2 siRNA,将bcl-2 siRNA转染入HL-60细胞。收集转染48 h后的细胞,流式细胞术检测蛋白表达情况,筛选出最佳作用序列进一步作各项指标检测。从mRNA水平、蛋白质水平等观察bcl-2 siRNA对细胞HL-60 bcl-2基因表达的干扰作用。结果 收集转染48 h后的细胞,经细胞免疫荧光、RT-PCR、MTT及Hoechst33258荧光染色等指标检测,可见转染bcl-2 siRNA阳性组的细胞bcl-2基因表达降低及HL-60细胞凋亡等现象。而转染GAPDH siRNA组的细胞对bcl-2表达无影响。结论 采用生物信息学的方法设计出有效siRNA靶位点;bcl-2 siRNA可通过降低bcl-2 mRNA水平特异性抑制bcl-2蛋白质的表达。     

C-erbB-2反义寡核苷酸抑制乳腺癌细胞增殖

目的观察反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)能否降低人乳腺癌细胞株MCF-7、c-erbB-2基因的表达,以及能否抑制其细胞增殖.方法将c-erbB-2 ASODN及其对照序列(空白对照和错配序列)通过脂质体转染MCF-7细胞,应用Western blot观察c-erbB-2蛋白表达的变化,然后应用MTT观察细胞增殖.结果c-erbB-2 ASODN能特异性下调MCF-7细胞c-erbB-2蛋白,而且能抑制其细胞增殖.结论实验结果认为应用c-erbB-2 ASODN抑制乳腺癌细胞增殖具有可行性.     

bcl-2反义寡核苷酸增强足叶乙苷诱导原代白血病细胞凋亡的研究

目的：研究bcl-2的反义寡核苷酸对足叶乙苷(VP(16)诱导原代培养的急性白血病(AL)细胞凋亡的影响。方法：用细胞计数法观察细胞的生存情况；用免疫荧光标记法通过流式细胞仪观测细胞bcl-2蛋白水平；用形态学观察及流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：靶向bcl-2 mRNA翻译起始区与靶向蛋白编码区的两个反义寡核苷酸分别与VP(16)联合作用AL细胞48 h，细胞的生存受到明显的抑制，分别同无关寡核苷酸(NS-ODN)联合VP(16)组、单用VP(16)组进行比较，差异有显著性(P＜0.05)。这两个不同靶点的反义寡核苷酸分别与VP(16)联用，均能明显下调AL细胞bcl-2蛋白的表达，并且联合作用AL细胞48 h的凋亡细胞百分率分别与NS-ODN联合VP(16)组、单用VP(16)组进行比较，差异有显著性(P＜0.05)。结论：针对bcl-2 mRNA翻译起始区和蛋白编码区两个靶点的反义寡核苷酸能增强VP(16)诱导急性白血病细胞的凋亡。     

bcl-2基因反义寡核苷酸增强放射线诱导Raji细胞凋亡的研究

目的研究bcl-2基因反义寡核苷酸作用淋巴瘤细胞株Raji后,放射线对细胞凋亡的影响.方法bcl-2基因反义寡核苷酸作用Raji细胞后,台盼蓝拒染法计数活细胞;免疫荧光标记观测细胞Bcl-2蛋白水平;用姬姆萨染色和碘化丙啶染色法、流式细胞仪检测细胞凋亡.结果bcl-2基因反义寡核苷酸与放射线联合作用Raji细胞,显著抑制细胞的生长,并呈时间依赖性,活细胞数分别与单用放射线组及无义寡核苷酸联合放射线组相比,统计学上有显著性差异(P＜0.05).bcl-2基因反义寡核苷酸与放射线联合作用于Raji细胞后显著抑制bcl-2蛋白表达,蛋白水平分别与单用放射线组或无义寡核苷酸联用放射线组比较,差异有显著性(P＜0.05).bcl-2基因反义寡核苷酸与放射线同时作用于Raji细胞后,姬姆萨染色可见凋亡细胞,通过流式细胞仪检测的细胞凋亡率显著增加,分别与单用放射线组或无义寡核苷酸联用放射线组相比,具有显著性差异,P＜0.05.结论bcl-2反义寡核苷酸能增强放射线诱导Raji细胞凋亡.     

有效bcl-2 siRNA对HL-60细胞生长的抑制作用

 目的　应用RNA干扰（RNAi）技术观察有效bcl-2 siRNA对白血病细胞HL-60凋亡的影响。方法　将有效bcl-2 siRNA转染入HL-60细胞;用MTT法、流式细胞术（FCM）及Hoechst 33258荧光染色法观察细胞增生及凋亡情况。结果　有效bcl-2 siRNA有抑制HL-60细胞生长及促进细胞凋亡的作用。结论　有效bcl-2 siRNA能特异性促进HL-60细胞凋亡,抑制其生长。     

大蒜素抑制人急性早幼粒白血病细胞生长的体外实验

本实验采用体外直接杀伤测定法，荧光偏振技术，ＭＴＴ比色分析法，ＤＮＡ合成的［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入法，微量量热法五种测定技术从细胞膜流动性改变、线粒体功能，ＤＮＡ合成速率、细胞总代谢率变化等细胞和分子生物学方面的变化研究大蒜素对ＨＬ－６０细胞的作用，结果表明，大蒜对对ＨＬ－６０细胞的增殖有抑制作用，高浓度（＞３０ｍｇ／Ｌ）时还有较明显的直接杀伤作用。     

Cell Cycle-Independent Down-Regulation of BCL-2 Protein Expression in Differentiating HL-60 Cells

To understand the relationship between bcl-2 protein expression and the cell cycle during the processes of differentiation, we examined bcl-2 protein levels expressed during cell cycle phases in differentiating HL-60 human leukemia cells by using a two-color flow cytometric method. In exponentially proliferating HL-60 cells bcl-2 protein was constitutively expressed throughout the cell cycle phases, but a small population of G0/G1 cells expressed decreased levels of protein as compared with other cell cycle phases. HL-60 cells can be induced to differentiate to granulocytic pathway by retinoic acid or dimethylsulfoxide, and to monocytic/macrophagic pathway by 1, 25 dihydroxyvitamin D3 or 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. During treatment with any of these inducing agents, bcl-2 protein expression was time-dependently down-regulated after 24h. A two-color flow cytometric analysis revealed that this down-regulation occurred throughout cell cycle phases, indicating that bcl-2 protein expression was down-regulated in cell cycle-independent manner during induction of differentiation in HL-60 cells. To our knowledge, this is the first demonstration suggesting that the regulation of bcl-2 protein expression is not related to the cell cycle during induction of differentiation in HL-60 cells.     

H2O2对HL-60细胞DNA中8-羟基鸟嘌呤含量影响的研究

目的与方法：本文采用气相色谱／氢火焰离子检测器（ＧＣ／ＦＩＤ）和气相色谱－质谱仪选择性离子检测器（ＣＧＣ／ＭＳ－ＳＩＭ）探讨Ｈ２Ｏ２致ＨＬ－６０细胞氧化损伤时ＤＮＡ中氧化修饰碱基８－羟基鸟嘌呤（８－ｏｈ－Ｇ）含量的变化,观察ＨＬ－６０细胞脂质过氧化程度和细胞内还原型谷胱甘肽／氧化型谷胱甘肽（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）比值的变化。结果：结果显示Ｈ２Ｏ２可使ＨＬ－６０细胞丙二醛（ＭＤＡ）含量增高（Ｐ〈０．０１     

反义核酸对癌基因C-myc和N-ras蛋白表达的影响

目的为了研制新型的抗肝癌药物,观察了反义寡核苷酸对整合乙型肝炎病毒(HBV)的肝癌细胞基因治疗的作用.方法设计合成针对HBVPreS2基因翻译起始位点的反义寡核苷酸(ASON),并设非互补序列作对照,选择2.2.15细胞为细胞模型,ASON以10μmol/L浓度用药,用ELISA法观察了细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的变化,MTT法检测ASON对细胞的毒性作用,放射免疫方法检测细胞培养上清液中血清铁蛋白浓度.免疫细胞化学染色检测ASON对癌基因C-myc和N-ras蛋白表达的影响.结果ASON能有效地抑制HBV抗原表达,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为66%和91%.而ASON以20μmol/L或40μmol/L浓度用药4天对宿主细胞无毒性作用,ASON以10μmol/L浓度用药后第二天用药组和对照组血清铁蛋白浓度分别为(28.26士0.02)μg/L和(28.14土0.02)μg/L,两者相比差异无显著性(P＞0.05).用药后第3天C-myc和N-ras蛋白表达降低,和对照组相比差异有显著性(P＜0.05).结论该段反义寡核苷酸不仅抑制HBV抗原表达,而且抑制肝癌细胞的恶性表型而对宿主细胞无毒性,有可能成为有前途的抗肝细胞肝癌新药.     

反义核酸与维甲酸对NB4和HL-60细胞生长分化的影响

目的：急性早幼粒细胞白血病染色体ｔ（１５；１７）易位形成的ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因作为早幼粒细胞白血病的标志与ＡＰＬ的发病及维甲酸诱导分化效应密切相关。本研究将针对ＰＭＬ－ＲＡＲα基因的反义核酸和维甲酸对ＮＢ４细胞和ＨＬ－６０细胞生长分化的影响加以比较，探讨ＰＭＬ－ＲＡＲα基因对维甲酸诱导分化作用的影响。方法：用反义核酸来封闭ＰＭＬ－ＲＡＲα融合基因的表达并用ＲＴ－ＰＣＲ的方法检测。ＮＢ４细胞的生长、分化及功能通过细胞生长曲线、形态学、细胞表面标志及ＮＢＴ还原试验加以判定，细胞周期应用流式细胞仪进行分析。结果：①反义核酸仅能够抑制ＮＢ４的生长，促进ＮＢ４细胞的分化，具有特异性；②维甲酸能够同时影响ＮＢ４和ＨＬ－６０细胞的生长分化；③反义核酸能够降低ＮＢ４细胞Ｓ期细胞百分比，而维甲酸不能。结论：ＡＳＯＤＮ和维甲酸影响ＡＰＬ细胞的生长分化作用机制可能不同，而且反义核酸作用特异性强，作用时相早。     

siRNA-2提高HL-60细胞对高三尖杉酯碱敏感性的实验研究

 目的 研究以bcl-2基因为靶标的有效siRNA对HL-60细胞高三尖杉酯碱（HT）药物敏感性的影响。方法 通过脂质体将siRNA转入HL-60细胞株并与HT联合培养，于24，48，72 h，用MTT法检测对细胞生长的抑制，用流式细胞仪检测HL-60细胞bcl-2蛋白的表达率，细胞内活性氧（ROS）水平变化及细胞线粒体膜电位的变化。结果 siRNA明显提高HT对HL-60细胞的生长抑制效应；抑制细胞bcl-2蛋白的表达，提高细胞内ROS水平，降低线粒体膜电位（P＜0.05）。结论 以bcl-2基因为靶标的siRNA能提高白血病细胞HL-60对HT敏感性。     

Bromelain对HL—60细胞的诱导分化作用

为获得对ＨＬ－６０细胞具有高效低毒作用的天然诱导分化剂而进行的研究。方法；以菠萝酶Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ为药物，对人前髓细胞性白血病细胞株ＨＬ－６０进行作用，通过不同浓度及不同作用时间的药物作用，统计ＨＬ－６０细胞的增殖率，生化变化有形态不的变化。     

烷化溶血磷脂对HL-60细胞生长及药物敏感性的影响

目的：探讨烷化溶血磷脂（ALP）对HL60细胞生长及药物敏感性的影响。方法：以ALP对HL60细胞克隆形成率及生长曲线影响来反映它的抗拉殖效应。用MTT法检测HL60细胞对ALP及其他化疗药物敏感性。结果：ALP能显著抑制HL60细胞的增殖能力，并且呈时间、剂量依赖性。ALP与阿糖胞苷、氨甲蝶呤联合用药产生相加效应；与柔红霉素、地塞米松、三尖酯碱产生协同效应。结论：ALP可抑制HL－60细胞增殖，增强HL－60细胞的药物敏感性。