银杏GbASR基因的克隆、生物信息学及表达分析

为了明确银杏ASR(ABA-stress-ripening)在应答非生物逆境胁迫中的作用,以便为ASR基因功能、环境胁迫研究提供材料。本研究以银杏(Ginkgo biloba)为材料,利用分子生物学技术对ASR基因进行了克隆,构建pCAMBIA1300-ASR-GFP融合表达载体,进行亚细胞定位分析。采用序列比对方法分析GbASR蛋白结构域及系统进化;利用qRT-PCR方法进行组织特异性表达及非生物逆境胁迫下的基因表达分析。结果表明,银杏ASR基因编码区全长546 bp,共编码182个氨基酸;蛋白质等电点为5.33,分子量大小为20111.24 Da,为亲水性稳定蛋白;GbASR蛋白含有1个高度保守的ABA/WDS结构域,且与火炬松PtASR蛋白同源性较高;GbASR蛋白定位于细胞核。此外,GbASR基因在银杏幼苗根、茎、叶各组织中均有表达,且在叶部有较高的表达;在高盐、干旱和高温胁迫下,GbASR基因均受诱导,且在不同胁迫处理时间0 h、6 h、24 h和48 h的表达存在显著的差异。以上分析说明GbASR基因参与响应高盐、干旱和高温等非生物胁迫,这为植物的育种及解释ASR基因功能提供依据。     

小麦TaHPPR基因的克隆与表达分析

为研究羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)在小麦逆境胁迫中的作用,本研究利用同源克隆法获得1个小麦HPPR基因,命名为TaHPPR,并对其组织表达特性和逆境胁迫表达特性进行了分析.以'太原806'、'小白麦'、'京冬8'及'京411'为供试材料,用荧光定量方法获得组织表达和逆境胁迫表达数据.序列分析表明:TaHPPR基因含有...     

1个新棉花bHLH类基因GhbHLH130的克隆及表达分析

近年来,已发现碱性/螺旋-环-螺旋(basic/Helix-Loop-Helix,bHLH)类转录因子家族在植物的生长发育调控中发挥重要作用。本研究通过电子克隆方法得到1个新的棉花bHLH类转录因子基因的全长序列,利用反转录-PCR技术从陆地棉中分离出1个bHLH类转录因子基因,并命名为GhbHLH130。该基因包含1个552 bp的开放阅读框,编码184个氨基酸残基。序列分析表明GhbHLH130蛋白包含1个螺旋-环-螺旋(Helix-Loop-Helix)保守结构域,属于bHLH转录因子家族。实时荧光定量分析结果表明GhbHLH130基因的表达受干旱、高盐、低温以及外源脱落酸的显著诱导。亚细胞定位结果表明GhbHLH130基因在细胞核内表达。本研究结果表明GhbHLH130基因可能作为调控基因参与棉花的逆境应答响应过程。     

甘薯蔗糖转运蛋白基因IbSUT3的克隆及功能分析

蔗糖作为光合产物的主要运输形式,其跨膜运输主要由蔗糖转运蛋白介导。本研究采用RACE技术,仍甘薯[Ipomoeabatatas (L.)Lam.]中兊隆得到甘薯蔗糖转运蛋白基因IbSUT3(GenBank登录号为MN233361)。IbSUT3基因全长1607 bp,开放阅读框为1518 bp,编码505个氨基酸。IbSUT3蛋白预测分子量为53.82 kD,等电点(pI)为9.19,含有12个跨膜结构域。序列比对表明, IbSUT3属于Group Ⅰ亚族,与其他物种的SUTs蛋白高度相似,但与Group Ⅳ亚族的蔗糖转运蛋白在进化上具有明显差别。利用酵母表达体系SUSY7/ura3证明IbSUT3编码有功能的蔗糖转运蛋白。亚细胞定位収现, IbSUT3蛋白定位在烟草原生质体膜上。实时荧光定量PCR结果表明, IbSUT3基因在甘薯不同组织中均有表达,但在叶片中表达最高;非生物胁迫(低温、高盐、干旱)和外源脱落酸均可诱导IbSUT3基因在叶片中的表达,表明该基因响应多种非生物胁迫,参与植物对脱落酸的响应。     

小麦TaMKK2基因的克隆及功能分析

小麦在生育周期内会遭遇多种非生物胁迫，制约小麦的生长发育。为了提升小麦新品种的抗逆性，本研究基于MAPK抗逆性基因开展实验，以冬小麦新品种‘新冬43号’为实验材料，采用同源克隆方法，获得了MKK2基因，暂命名为TaMKK2，对其编码的基因序列进行了生物信息学分析，并对该基因进行了亚细胞定位和原核表达分析。结果表明，该基因的cDNA序列全长为531 bp，含有1个完整的开放阅读框，编码176个氨基酸，相对分子量约20.07 kD，等电点为8.37；与山羊草、二穗短柄草MKK2基因的亲缘性较近；理论定位于细胞核上，然而实验操作未能检测到荧光信号；各诱导条件下目的蛋白均以包涵体形式存在，纯化复性后得到大小为20.07 kD的目的蛋白。本研究结果为小麦应对非生物胁迫以及利用基因育种技术改良植物抗逆性提供理论依据。     

玉米ZmPP2C6-01基因的克隆及表达分析

为了研究玉米蛋白磷酸酶2C (PP2C)基因对非生物胁迫的响应及生理功能,以耐旱玉米自交系豫882为试验材料,对玉米20%PEG6000胁迫处理转录组进行分析,筛选受干旱诱导强烈表达的PP2C基因,然后对其进行克隆、生物信息学分析及表达模式分析。结果表明,在玉米20%PEG6000胁迫处理转录组中筛选到一个干旱胁迫下显著上调表达的PP2C蛋白基因,命名为ZmPP2C6-01。ZmPP2C6-01基因的开放阅读框为1 242 bp,编码413个氨基酸,编码蛋白质的分子质量为43.8 ku,等电点为6.6,是一种亲水性蛋白。ZmPP2C6-01蛋白与高粱的PP2C蛋白亲缘关系最近,而与冬小麦、粗山羊草等的PP2C蛋白亲缘关系相对较远。ZmPP2C6-01蛋白定位于细胞核中。利用实时荧光定量PCR分析发现,ZmPP2C6-01基因在玉米根中的表达量最高,其次是叶,茎中最低;PEG胁迫下,ZmPP2C6-01基因在根中的表达量大部分时间点均高于对照,同时在叶中呈上调表达模式;在ABA、NaCl、高温胁迫下,ZmPP2C6-01基因在根中大部分时间点的表达量均低于对照,整体呈下降趋势,而在叶中的表达量均高于对照,呈上调表达模式。综上表明,ZmPP2C6-01基因响应干旱等逆境胁迫,但表达模式不一致。     

一个棉花GDSL脂肪酶基因的克隆与功能分析

GDSL脂肪酶与GXSXG脂肪酶是2个重要的脂肪酶亚家族。其中, GDSL家族脂肪酶具有水解酶活性, 能水解多种酯类物质。本试验根据新乡小吉无绒无絮(XinWX)和无绒有絮(XinFLM)近等基因系纤维起始期29K芯片竞争杂交结果, 选择了一个在纤维起始期具有极显著表达差异的EST序列(GenBank登录号为DR458916), 以该序列信息为探针, 利用电子克隆方法并进行cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆获得一个陆地棉GDSL脂肪酶基因(GhGDSL;GenBank登录号为KC186125)。该基因ORF长1065 bp, 编码354个氨基酸, 含有5个外显子和4个内含子。该基因在二倍体棉种基因组中含一个拷贝, 在四倍体棉种基因组中含2个拷贝。序列比对显示该基因在四倍体棉种的2个亚组中独立进化, 且D亚组比A亚组变异大。染色体定位显示该基因2个拷贝分别位于A4 (Chr. 4)和D4 (Chr. 22)染色体上。定量RT-PCR结果表明, GhGDSL在开花后3~10 d的纤维组织中表达量高, 其中在海7124中表达高峰在8DPA, 在TM-1中表达高峰从5DPA持续到10DPA。利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]的BC₁S₁群体开展GhGDSL功能与纤维、种子品质性状关联分析, 发现该基因A亚组的拷贝与种子脂肪含量存在显著相关(P=0.048);D亚组的拷贝与种子蛋白含量存在极显著相关(P=0.008)。推测GhGDSL基因功能与种子中脂肪、蛋白代谢相关, 同时也参与纤维伸长过程。     

小麦脂质转运蛋白基因TaLTP克隆及功能分析

脂质转运蛋白(lipid transfer protein,LTP)是广泛存在于植物中的一类小分子蛋白,因其能在植物细胞膜间运输脂类物质而得名,在植物角质层合成和适应多种环境胁迫中起重要作用。本研究利用同源克隆方法得到Ta LTP-s的c DNA全长序列510 bp,开放阅读框为339 bp,编码112个氨基酸。利用RIL群体将Ta LTP-s定位在染色体1A上,距离两侧标记WMC449和WMC93的遗传距离分别为2.1 c M和5.9 c M。通过原生质体亚细胞定位显示Ta LTP-s定位于细胞膜和细胞质中。小麦开花期Ta LTP-s在小花中表达量较高,尤其是在花药中的表达量远高于在根和叶中。在ABA、PEG、Na Cl及4℃低温胁迫诱导下,小麦Ta LTP-s均上调表达,可能与抗逆性调节相关。在高盐胁迫处理下,转基因拟南芥幼苗的细胞膜稳定性和存活率显著高于野生型。研究结果为利用小麦脂质转运蛋白基因改良作物抗逆性奠定了基础。     

拟南芥核酸酶基因AtCaN2克隆及功能分析

为了研究拟南芥核酸酶AtCaN2基因在植物生长发育过程中的作用与功能,从拟南芥中克隆了核酸酶AtCaN2基因,并对该基因进行生物信息学分析,亚细胞定位分析,蛋白质诱导、表达、纯化及功能研究。结果表明,AtCaN2蛋白等电点为8.45,化学式为C₁₁₁₆H₁₇₈₈N₃₁₀O₃₃₅S₃,共含有3 552个原子数,为亲水性蛋白;AtCaN2与十字花科亚麻荠的同源性较高,同源性为87.89%,与谷子、高粱和玉米的同源性较低,同源性分别是56.42%,57.35%,56.47%,且在氨基酸序列中间具有高度保守的D-X-D序列;同时进化树分析显示AtCaN2与十字花科亚麻荠的亲缘性最近,与谷子、玉米等禾本科植物的亲缘性比较远,这些结果同氨基酸序列比对的结果一致;亚细胞定位结果显示其定位于细胞质,与预测结果相符;蛋白质诱导和纯化得到大小约为35 ku的His-AtCaN2融合蛋白;Western Blot分析显示,诱导表达的融合蛋白正确翻译表达,且没有出现结构上的断裂或者降解的情况;小量诱导...     

小麦TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定

WRKY是植物特有的转录因子基因, 在植物对外界胁迫响应及生长发育的过程中发挥重要作用。本研究克隆了一个新的小麦WRKY转录因子基因TaWRKY44, 获得其全长cDNA, 其中开放阅读框长度为897 bp, 编码298个氨基酸。半定量RT-PCR的结果表明, TaWRKY44在叶片中表达水平较高, 并且受干旱和低温胁迫诱导表达。转基因功能分析结果表明, TaWRKY44的拟南芥超表达株系叶片变小, 叶柄缩短, 并且叶片细胞也明显小于野生型。另外, 转基因系对ABA、干旱和盐等胁迫处理的敏感性也高于野生型, 说明该基因可能作为一个转录抑制子参与逆境胁迫信号转导过程。     

玉米分子伴侣基因ZmBiP2在逆境下的功能分析

BiP(binding protein)基因编码的蛋白是一类重要的分子伴侣,在动植物的逆境胁迫响应过程中具有重要的作用。从玉米抗旱自交系旱21中分离到分子伴侣基因ZmBiP2,序列分析结果显示,该基因开放阅读框长1989 bp,编码含663个氨基酸的蛋白,包含热激蛋白家族特有的TVIGIDLGTTYSC保守结构域和ATP结合位点。实时荧光定量PCR结果显示,Zm Bi P2基因在玉米的雄穗和子房中表达量最高;在盐、甘露醇胁迫条件下,该基因在植株的地上部分上调表达。过量表达Zm Bi P2基因的拟南芥转基因株系在种子萌发时期对盐和甘露醇胁迫的耐受能力减弱,在苗期对盐胁迫敏感。推测在植物响应非生物胁迫的过程中,过量表达的ZmBiP2蛋白可能发挥负调节蛋白的功能。     

乌拉尔图小麦WRKY转录因子的筛选与分析

WRKY转录因子广泛参与植物抗逆胁迫反应,全面分析挖掘小麦A染色体组供体物种乌拉尔图小麦中的WRKY转录因子,对进一步挖掘分析六倍体小麦WRKY转录因子的分子功能具有重要意义。本研究通过生物信息学分析,在乌拉尔图小麦基因组数据中鉴定得到62条全长WRKY转录因子,其中14条能被准确定位在染色体上,并发现2对WRKY转录因子发生了复制;通过进化树分析,发现62条WRKY转录因子被分为8个小亚族,且小亚族内部的基因结构相对保守。通过荧光定量分析所选基因在非生物胁迫下的表达模式,筛选到2条在不同非生物胁迫下均上调表达的WRKY转录因子,为进一步分析其功能打下基础。     

甘蓝型油菜LPAT4基因的克隆与表达

植物溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophospholipid acid actyltransferase, LPAT)是三酰甘油生物合成过程中的一个关键酶, 在脂质的合成、种子的发育以及生物膜的流动性等方面有重要作用。本研究采用同源克隆的方法, 获得LPAT4基因的2条全长CDS序列, 长度分别为1143 bp和1140 bp。生物信息学分析表明, 它们均具有LPLAT_LCLAT1样结构域, 同属于LPLAT超基因家族, 并分别被命名为BnLPAT4-1和BnLPAT4-2。时空表达分析表明, 它们均为组成型表达基因, 其中BnPAT4-1在叶中的表达量最高, 而BnPAT4-2在胚中的表达量最高。逆境分析表明, BnLPAT4-1和BnLPAT4-2在NaCl、PEG-4000、水渍、6BA和ABA的胁迫下呈现出不同的表达模式。极差分析显示, ABA对BnLPAT4-1的表达影响较大, 而BnLPAT4-2的表达却对PEG4000更敏感。为进一步研究油菜BnLPAT4基因功能奠定了基础。     

高粱中SbDREB2基因的克隆与表达分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)在植物非生物逆境胁迫中调节下游一系列抗逆基因的表达。本研究利用电子克隆和RT-PCR方法从高粱中克隆到1个DREB类基因SbDREB2,该基因ORF 789 bp,推测编码蛋白含262个氨基酸残基,相对分子质量28.6 kD,理论等电点为5.52,在DNA序列内包含1个740 bp的内含子,符合GT-AG剪接规则。氨基酸序列分析表明,该蛋白在82~145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域,与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白相似度分别为84%和69%。成功构建了原核表达载体pET28a-SbDREB2,经IPTG诱导获得32.5 kD左右蛋白,与理论值一致。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达,根中表达量约是茎中的2.5倍;受干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导,但对低温几乎没有响应。     

谷子非特异性磷脂酶C基因SiNPC4的克隆及功能分析

非特异性磷脂酶C(NPC,nonspecific phospholipase C)水解磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺产生第二信使二酰甘油(DAG),NPC类基因在植物处于干旱、高盐、低磷等非生物胁迫条件下时发挥重要的作用,并参与脱落酸(ABA)、油菜素内酯(BL)等激素信号传导途径。本研究以谷子品种龙谷25为试验材料,通过序列比对,克隆到一个新的NPC类基因,命名为Si NPC4。该基因被定位在谷子第8条染色体上,编码区全长2877 bp,由3个外显子和2个内含子组成,编码512个氨基酸,蛋白分子量为56.77 k D。系统进化树分析表明该基因位于NPC基因家族第3亚族,保守结构域分析表明该蛋白含有保守的磷脂酶结构域和4个基序。亚细胞定位结果显示,Si NPC4蛋白被定位在细胞质、细胞膜、细胞核中。基因表达谱分析结果表明,该基因主要在谷子根部表达,并受干旱、盐、低温、黑暗、ABA、BL、赤霉素(GA)和茉莉酸甲酯(Me JA)等的诱导表达。将Si NPC4基因转入拟南芥中,转基因拟南芥与野生型拟南芥相比对ABA和BL激素的敏感性降低,推测该基因可能作为负调控因子参与植物对ABA和BL激素的响应过程。在干旱和高盐处理下,过表达植株与野生型植株长势没有明显差异。     

大豆GmGLDH基因的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究大豆L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因Gm GLDH-Glyma.02G166300 (以下简称GmGLDH)的功能,本研究采用同源克隆法获得大豆GmGLDH基因,开展了相关生物信息学分析,并对其非生物胁迫下表达模式进行调查。结果表明,GmGLDH基因包含一个长度为1 752 bp的ORF序列,编码584个氨基酸。GmGLDH蛋白为亲水性较强的蛋白;二级结构中以无规则卷曲和α螺旋结构为主;预测亚细胞定位GmGLDH主要分布在线粒体中,分析结果并未发现跨膜结构域和信号肽结构;该蛋白序列中存在磷酸化位点56个。进化分析表明,克隆的GmGLDH氨基酸序列与菜豆、苜蓿的同源关系较近。基因上游顺式调控元件分析表明该基因可能参与光应答、激素响应、高温响应等,但光处理下大豆子叶中Gm GLDH基因的表达变化不大,且和子叶中抗坏血酸含量无相关性;4种非生物胁迫处理下大豆叶片中Gm GLDH基因是先下调后上调表达,和抗坏血酸含量变化呈反相关。本研究为进一步研究GmGLDH基因在大豆抗逆中的作用提供了重要的帮助。     

芝麻中一个富含脯氨酸新基因的克隆与特征分析

芝麻青枯病是影响我国南方芝麻产量及品质的重要病害。该病属细菌病害,由青枯雷尔氏菌引起。本研究利用随机引物对芝麻受青枯雷尔氏菌诱导前后进行基因差异表达分析,发现一个诱导明显下调的基因(片段)。将该片段克隆、测序后,在芝麻基因组数据库中比对其序列,得到一个ORF完整的全长基因。序列分析表明该基因无内含子,ORF长度为1458 bp,编码486氨基酸,其N端富含脯氨酸及富含脯氨酸的重复序列,属于富含脯氨酸蛋白(proline-rich protein,PRP),将其命名为Si PRP(Sesamum indicum proline-rich protein)。根据该基因ORF两翼序列设计引物在芝麻c DNA中克隆到该基因,测序结果与预测序列一致。Blast分析表明该基因编码蛋白与其他植物中发现的PRP蛋白同源性很低,且其富含脯氨酸的重复序列在其他植物中也未发现,推测为一个新型富含脯氨酸蛋白。进一步设计基因专化的定量及半定量PCR引物进行其诱导表达分析,再次证明该基因受病菌诱导后下调表达。与其他植物中发现的大多数PRP蛋白定位于细胞壁不同,Si PRP主要定位于细胞膜,少量可以分泌到细胞外。烟草表皮细胞瞬时表达显示该蛋白定位在细胞膜上的特殊结构,推测该蛋白在芝麻和青枯雷尔氏菌的互作中发挥重要作用。     

玉米ZmWRKY53基因克隆及诱导表达分析

WRKY是植物细胞中进化较为保守的一类转录因子,参与了生物和非生物逆境胁迫应答反应的调控。本研究基于干旱诱导的玉米(Zea mays L.)B73转录组数据库,成功克隆到1个WRKY基因,命名为Zm WRKY53。序列比对发现,该基因含有904 bp的完整开放读码框,编码302个氨基酸,在C端含有1个保守的WRKYGQK结构域,同源比对ZmWRKY53属于IIc类WRKY转录因子。生物信息学预测,Zm WRKY53为碱性不稳定亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构域。洋葱内表皮亚细胞定位显示,Zm WRKY53蛋白位于细胞核中。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,Zm WRKY53基因在玉米的根和叶中有较高的表达水平,而在茎、玉米须、雄穗和胚中的表达量较低。不同的非生物胁迫如低温(8℃)、NaCl、H2O2和PEG均能显著提高Zm WRKY53的表达水平,尤其是PEG诱导使其表达水平上调9.5倍。接种玉米纹枯病的叶片中,Zm WRKY53的表达量提高了13倍。对比不同的激素处理情况,脱落酸(abscisic acid,ABA)和水杨酸(salicylic acid,SA)处理后,Zm WRKY53的表达水平持续上调;而在赤霉素(gibberellin,GA)和乙烯处理的玉米根中,Zm WRKY53呈现无规律的变化特征。蛋白互作预测,十个候选基因可作为后续Zm WRKY53调节机制的靶目标研究。上述实验表明,Zm WRKY53基因通过对不同激素信号的调节,不仅参与玉米对纹枯病的抗性反应,还参与对非生物胁迫信号的转导。     

小麦TaABC1L的克隆及表达特性分析

通过反向Northern筛查小麦旱选10号幼苗水分胁迫诱导表达的cDNA文库，选择一个在水分胁迫1、6和12 h均上调表达的cDNA克隆作为“种子”序列，利用电子延伸和RT-PCR方法，获得一个开放阅读框为1 434 bp，编码477个氨基酸的cDNA序列。由该序列推测编码的蛋白含有1个典型的ABC1保守域（123~243氨基酸）和1个AARF域（42~369氨基酸），但是没有发现ABC1向线粒体转移的信号肽前体序列（PD017350），因此，将该基因命名为TaABC1L。同源比对结果表明，TaABC1L只与水稻、拟南芥中4个尚未研究功能的基因编码的氨基酸序列高度同源。实时定量RT-PCR结果显示，TaABC1L对渗透、高盐、低温等逆境胁迫和ABA处理均表现出应答反应，但是在不同胁迫条件下表达高峰出现的时间和表达强度上存在差异。其中受NaCl胁迫1 h，基因的表达量已达到对照的30倍，之后其表达量迅速回落，但仍高于对照；受ABA诱导时，其表达量略有增加，在12 h的最高表达量也仅为对照的2倍。