人血管内皮生长因子基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段。构建pcDNA3／VEGF165真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人肝癌细胞株SMMC-7721中扩增出血管内皮生长因子VEGF165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3真核表达载体上,构建成pcDNA3／VEGF165重组质粒,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果：经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验构建的重组质粒目的基因片段为人VEGF165cDNA。结论：本实验成功地克隆了VEGF165基因并构建了其真核表达质粒。为进一步研究用VEGF基因转染的方法来恢复或增强放疗后组织的血管生成能力奠定了基础。     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体构建

目的获得人血管内皮生长因子（hVEGF165）cDNA,构建其真核表达载体。方法采用PCR技术,从HL60细胞中扩增出hVEGF165 cDNA,将其克隆至pcDNA3真核表达载体上,构建成为pCD-hVGEF165重组质粒。结果经酶切鉴定,克隆的基因片段为人hVGEF165 cDNA;建立了pCD-hVGEF165重组质粒。结论成功地克隆和表达出了人VEGF165基因,为大量制备重组质粒的研究奠定了基础。     

VEGF165和VEGF165b真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)165和VEGF165b真核表达质粒,为VEGF165和VEGF165b功能研究奠定基础.方法:应用RT-PCR方法从人肺腺癌A549细胞中获得并扩增VEGF165 cDNA,双酶切后与真核表达载体pcDNA3.0连接,构建重组质粒pcDNA3.0-VEGF165,酶切、PCR及...     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

血管内皮生长因子基因重组腺病毒载体的构建

目的 :构建携带人血管内皮生长因子基因的重组腺病毒载体。方法 :将人源性的 VEGF1 6 5c DNA正向插入到穿梭质粒 p HCMVSP1A的 CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,通过脂质体与 p JM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人 VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 ,通过 PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒 ,扩增、纯化并测定滴度。结果 :人VEGF1 6 5c DNA成功地正向插入到 p HCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组 DNA为模板 ,同时扩增出 5 76 bp的VEGF1 6 5c DNA基因片段和 86 0 bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了所构建病毒的正确性 ,病毒滴度为 2 .5× 10 9pfu/ m l。结论 :成功构建了表达人 VEGF1 6 5基因重组腺病毒载体 ,使 VEGF基因的高效转染成为可能     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

加强型黄色荧光蛋白和VEGF双基因载体在肝细胞共转染表达

目的 构建带加强型黄色荧光素蛋白（VYFP）和人类血管内皮生长因子（VEGF）的双基因真核表达载体pIRES-EYFP/VEGF12,etEYFP作标记基因，研究外源性VEGF121基因在大鼠原代培养肝细胞转染表达，为实时监测VEGF121基因修饰肝组织移植后状态提供基础。方法 将pcDNA3VEGF121中VEGF121定向克隆到pIRES－EYFP，构建重组质粒pIRES－EYFP／VEGF121，经酶切、PCR扩增和部分DNA序列分析证实后，转染大鼠原代培养肝细胞，用荧光显微镜等观察转染表达。结果 酶切、PCR扩增和部分DNA序列分析等证明pIRES－EYFP／VEGF121质粒成功构建，转染大鼠原代培养肝细胞后，可以通过荧光显微镜观察到黄绿色荧光。结论 构建了pIRES－EYFP／VEGF121质粒，为实时监测外源性VEGF121基因转染和VEGF基因修饰肝细胞的基因治疗奠定基础。     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体的构建及其在大肠杆菌的表达

目的　获得人血管内皮生长因子 (hVEGF165)cDNA ,构建真核表达载体 ,并研究其在大肠杆菌中的表达情况。方法　采用PCR方法 ,从HL6 0细胞中扩增出hVEGF165cDNA ,将其克隆至 pcDNA3 真核表达载体上 ,构建成为 pCD hVEGF165重组质粒。将重组质粒转染感受态的大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 ,用Westernblot检测表达产物。结果　经酶切鉴定及基因测序证实hVEGF165cDNA基因克隆成功 ,并建立了高效表达的 pCD hVEGF165重组质粒。Westernblot检测表明 ,组建了具有高效表达hVEGF165的大肠杆菌菌株。结论　成功地克隆和表达出了hVEGF165基因 ,为进一步建立VEGF转基因动物模型 ,研究其在视网膜新生血管性疾病中的应用奠定了基础     

人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建

目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。     

加强型黄色荧光蛋白和VEGF双基因载体在肝细胞共转染表达

【目的】构建携带加强型黄色荧光素蛋白 (EYFP)和人类血管内皮生长因子 (VEGF)的双基因真核表达载体pIRES EYFP/VEGF12 1,用EYFP作标记基因 ,研究外源性VEGF12 1基因在大鼠原代培养肝细胞转染表达 ,为实时监测VEGF12 1基因修饰肝细胞移植后状态提供基础。【方法】将 pcDNA3VEGF12 1中VEGF12 1定向克隆到 pIRES EYFP ,构建重组质粒 pIRES EYFP/VEGF12 1,经酶切、PCR扩增和部分DNA序列分析证实后 ,转染大鼠原代培养肝细胞 ,用荧光显微镜等观察转染表达。【结果】酶切、PCR扩增和部分DNA序列分析等证明pIRES EYFP/VEGF12 1质粒成功构建 ,转染大鼠原代培养肝细胞后 ,可以通过荧光显微镜观察到黄绿色荧光。【结论】构建了 pIRES EYFP/VEGF12 1质粒 ,为实时监测外源性VEGF12 1基因转染表达和VEGF基因修饰肝细胞的基因治疗奠定基础。     

VEGF逆转录病毒载体构建及在小鼠骨髓中的表达(英文)

Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｐｌａｙｓａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｉｎｂｏｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ,ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇａｎｄｈｅａｌｉｎｇ Ａｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃａｕｓｅｏｆｂｏｎｅｎｅｃｒｏｓｉｓ,ｉｓｃｈｅｍｉｃｂｏｎｅｄｉｓｅａｓｅｈａｓａｐｏｏｒｐｒｏｇｎｏｓｉｓｗｉｔｈｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｃｕｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｉｎａｖａｓｃｕｌａｒｂｏｎｅｄｉｓｅａｓｅ ,ｎｏｖｅｌｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓａｒｅｄｅｓｐｅｒａｔｅｌｙｎ…     

Expression of human VEGF121 cDNA in mouse bone marrow stromal cells

目的构建人VEGF121逆转录病毒表达载体,探讨应用血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因治疗骨科缺血性疾患的可行性.方法采用分子克隆技术从pCDⅠ/VEGF121质粒获得hVEGF121cDNA, 并克隆到pLXSN逆转录病毒质粒.经酶切及测序鉴定正确后,包装成为pLXSN/VEGF121重组逆转录病毒, 并进行滴度测定.培养小鼠骨髓基质细胞,用重组病毒感染小鼠骨髓基质细胞.经筛选后,用PCR及RT-PCR方法测hVEGF121cDNA在基质细胞中的整合及转录;用免疫印迹及免疫组化检测VEGF121蛋白的表达;用MTT检测转基因细胞培养上清中VEGF的促人内皮细胞增殖活性.结果经酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒正确,包装的病毒滴度为6×105.PCR证实基因组DNA有hVEGF121cDNA的整合;RT-PCR证实有hVEGF121mRNA的转录;Western blot及免疫组化检测有VEGF121蛋白的表达;MTT试验显示转基因细胞培养上清中VEGF121能促进人内皮细胞增殖.结论我们成功地构建了pLXSN/VEGF121重组逆转录病毒载体,该载体不仅能够有效地表达VEGF121蛋白,且表达的蛋白具有促进人内皮细胞增殖的生物学活性,这些均为进一步应用该载体研究VEGF基因治疗骨科缺血性疾患打下了基础.     

人血管内皮细胞生长因子165重组腺病毒的构建及其在真核细胞中的表达

目的:体外构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的腺病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:从重组质粒pcDNA3/hVEGF165中获得hVEGF165,经酶切及测序鉴定,将hVEGF165基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,重组穿梭质粒经酶切线性化后,与pAEdasyl质粒在大肠杆菌BSJ183中进行同源重组,线性化后转染HEK293细胞进行包装扩增获取重组病毒上清,同时应用RT-PCR及ELISA法检测hVEGF165的表达。结果:目的基因的测序结果与人VEGF165序列(Genbank)相符。转染后经RT-PCR和ELISA检测证实转染重组质粒组hVEGF165 mRNA及蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到hVEGF165的表达。结论:本研究构建了人VEGF165重组腺病毒表达载体pAd-hVEGF165,并能成功地在HEK293细胞中表达。     

hSALL4基因逆转录病毒载体的构建及在小鼠髓系祖细胞中的表达

目的：构建含人SALL4B基因的逆转录病毒载体并证明其在小鼠髓系祖细胞中的表达。方法：①用PCR方法从质粒pcDNA3-hSALL4B扩增包括有全部编码序列的人SALIABcDNA,将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成含hSALL4的重组逆转录病毒载体;②将重组质粒在包装细胞系PT67中进行包装,用病毒上清感染32D细胞;③RT—PCR分析其mRNA表达;④Westernblotting分析其蛋白质的表达。结果：①限制型内切酶酶切,PCR及DNA测序均证实hSALIAB成功地克隆入pLXSN;②转染的32D细胞在mRNA水平及蛋白水平均有SALIAB表达。结论：成功地构建了含人SALIAB的逆转录病毒表达载体;且表达于32D细胞中,为研究SALIA基因过表达对造血功能的作用及其机制奠定了基础。     

BDNF基因逆转录表达载体的构建和在淋巴细胞中的表达

【目的】构建含脑源性神经营养因子基因(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNFgene)逆转录表达载体并了解其在淋巴细胞中的表达,探讨治疗基因的非损伤性脑内转移的新途径。【方法】用RT-PCR方法从大鼠海马组织总RNA中扩增(cDNA)BDNF片段,应用基因重组技术将大鼠(cDNA)BDNF克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒进行鉴定,采用LipofectAMINE将重组大鼠(cDNA)BDNF导入PA317细胞,获取高滴度的病毒上清转染大鼠淋巴细胞,应用流式细胞仪(FCM)检测大鼠淋巴细胞BDNF的表达,噻唑蓝(MTT)法检测淋巴细胞培养上清对PC12细胞增殖的影响。【结果】扩增出大鼠(cDNA)BDNF片段,限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒pLXSN-BDNF,BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达BDNF蛋白,其培养上清能促进PC12细胞增殖。【结论】成功构建了BDNF基因逆转录表达载体,BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达和分泌具有生物活性的BDNF蛋白,为治疗基因的非损伤性脑内转移奠定了一定基础。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.     

人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）双基因共表达逆转录病毒载体。方法 利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中，脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig-IRES2-EGFP转染PA317细胞，在G418选择压力下，通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA317细胞克隆，MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果 成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体，生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。结论 IRES序列调控CTLA4Ig与EGFP双基因在细胞中同时独立表达。     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。