一株防治香蕉枯萎病的短密木霉筛选及代谢物木霉素作用评价

由尖孢镰刀菌古巴专化型热带四号小种(Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race4, FocTR4)引起的香蕉枯萎病(banana Fusarium wilt, BFW)是全世界范围内难以防治的真菌病害,给香蕉产业造成巨大的经济损失。本研究旨在筛选高效拮抗FocTR4的木霉生防菌株,并对其发酵代谢产物进行分离、提纯和鉴定,为香蕉枯萎病的高效生物防治提供重要生防菌株和活性化合物资源。从作物根际土壤中分离出木霉菌株,通过平板对峙培养、发酵液对病原菌孢子萌发及菌丝生长抑制,测试筛选出高效抑制FocTR4的生防木霉菌株;通过构建系统发育树明确生防菌株的分类地位;通过柱色谱法分离纯化菌株发酵液中活性成分,通过核磁共振波谱法(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)解析活性成分的结构;通过香蕉苗感病盆栽实验检测生防木霉菌株对香蕉枯萎病的防治效果。结果表明,本研究筛选到了1株拮抗FocTR4的菌株JSHA-CD-1003,平板对峙抑制率为60.6%;发酵液在24 h内能完全抑制FocTR4孢子萌发,7 d内对FocTR4菌丝生长的抑制率为52.6%;基于内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)和tef1-α基因串联序列构建系统发育树,该菌株鉴定为短密木霉(Trichoderma brevicompactum),通过柱色谱法分离提纯和NMR鉴定单一活性化合物为木霉素(trichodermin),最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)为25 μg/mL;盆栽生防实验表明,菌株JSHA-CD-1003发酵液对香蕉枯萎病的叶片黄化防治率为47.4%,球茎褐化防治率为52.0%。因此,JSHA-CD-1003通过产生木霉素有效抑制FocTR4孢子萌发和菌丝生长,对FocTR4引起的香蕉枯萎病具有良好的生物防治效果,是一株具有生防潜力的菌株。     

三个木霉菌株防病促生效应

【背景】木霉(Trichoderma sp.)是重要的生防微生物资源,对不同的木霉菌株进行生物学特性比较,可为获得功能较广的复配型生防菌剂提供参考信息。【目的】通过对绿木霉(Trichoderma virens) T23、哈茨木霉(Trichoderma harzianum) T22、G30的防病效果及对作物的促生潜力等生物学特性进行比较分析,明确不同菌株的生物功能差异。【方法】用平板拮抗法比较分析菌株T23、T22、G30对植物病原真菌的拮抗效果;用乙酸乙酯萃取法对菌株T23、T22、G30培养液中的胶毒素进行提取并通过高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography, HPLC)检测胶毒素;用打孔法比较分析培养液萃取物对植物病原真菌的拮抗效果;通过温室接种验证菌株T23、T22、G30的防病效果;分别以磷酸钙、卵磷脂为唯一磷源检测菌株T23、T22、G30对难溶性磷的转化利用潜力,用电感耦合等离子发射光谱法(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry, ICP-AES)检...     

耐药性木霉菌株的筛选及其对灰霉病的防治

兽籁当莨8咖耋楹∞102025323840455055培养时间（h）Time（h）图1ELll2单细胞生长曲线Fig．13heC（Kllx3eofthecells’samountsofELll2510152530354050培养时间Time（h）图2不同发酵时间的酶活Fig．23hed~stolyticactivityoffem~ent’8processing异。许多研冗表明,微生物营乔和代掰荚型与共生长蚧境碉着很大的关系。所以在采样时选择肉类加为了提高生物菌剂对植物病害的防治效果和稳定性,达到生物农药和化学农药综合防治的目的,采用了紫外诱变处理与药物培养基驯化培养相结合的方法,分离筛选出对化学杀菌剂速克灵有显著抗性的突变型木霉菌株T-4。该菌株与亲本菌株相比其抑菌能力及耐受性均优于亲本木霉菌株。经菌和药的协同作用研究发现,木霉菌剂与速克灵配比为8：2条件下,协同抑菌率达84．3％;活体拮抗性测定防治效果达到81％。这表明综合利用生物与化学防治,不仅可以降低农药使用量,减轻对环境的污染。而且,对植物病害的防效均高于单独使用木霉菌剂和速克灵的防治效果。     

产脂肪酶木霉菌株的筛选鉴定及酶学性质研究

筛选到4株可产生脂肪酶的真菌菌株,分别是153—1、13—2、30425和西1-1,经形态观察、ITS序列测方法鉴定,30425、153—1鉴定为Trichoderma harzianum,西1-1、13—2鉴定T.longibrachiatum。研究了脂肪酶的基本酶学性质,153—1、13-2、30425和西1-1酶的最适作用温度为45℃、40℃、20℃、20℃,最适pH为9．5、10．0、7.5、9．5,金属离子对153—1、13—2、30425和西1-1酶活的影响存在差异,其中Mn^2＋、Cu^2、Pb^2＋对4株菌株的酶活均为抑制作用,而Ba^2＋对4株菌株的酶活均为不同程度的激活作用。     

抗油桐枯萎病木霉菌的分离鉴定及抑菌作用研究

油桐是我国重要的木本油料植物,其生产的桐油作为天然的优良干性油在工业上具有广泛用途。但由油桐专化型尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum f. sp. fordiis（Fof-1）侵染引起的枯萎病给油桐产业造成了毁灭性灾害,目前尚无有效防治手段。众多实践证明,利用生防菌可以有效防治土传枯萎病。本研究发现,在抗病油桐根围土壤中木霉菌的相对丰度较高,并从中分离获得了16株木霉菌;通过形态学鉴定和ITS-TEF1双基因联合构建系统进化树,鉴定出4种木霉菌：拟康宁木霉Trichoderma koningiopsis（TkonT1）、螺旋木霉T. spirale（TspiT2）、深绿木霉T. atroviride（TatrT3）和哈茨木霉T. harzianum（TharT4）;通过对峙培养试验,发现木霉菌株TkonT1、TharT4和TspiT2具有较好的抑菌效果;进一步显微观察发现菌株TkonT1和TatrT3可缠绕在尖孢镰孢菌菌丝体上或穿入菌丝体内营寄生生长,吸收病菌菌丝体养分进而导致病菌菌丝体破裂和细胞原生质消解。结果表明,从抗病油桐根围土壤中获得的拮抗木霉菌株可用于油桐枯萎病的生物防治。     

市售洗衣粉提高木霉菌株产生纤维素酶量的研究

加入不同浓度的双猫牌洗衣粉(主要成份为烷基苯磺酸钠)对木霉菌产纤维素酶的能力发生不同的作用。在浓度为0.1%到0.7%时,酶产量逐步提高。然献当加人量为0.8%时,提高作用下降,0.9%与1%时,反而起抑制作用。这可能与适量表面活性剂提高了木霉菌的细胞膜透性,克服其胞内产酶的反馈现象有关;而过高浓度,却使细胞膜破坏。     

高产纤维素酶的木霉菌株筛选及发酵条件优化

纤维素是由β-1,4糖苷键链接而成的葡萄糖单体聚合物,广泛分布于自然界,是一类易获取且廉价的可再生资源。自然界含纤维素材料的利用和处理是目前亟待解决的问题,筛选产纤维素酶的优良菌株并实现纤维素的有效利用具有重要意义。利用纤维素酶降解纤维素是绿色、高效和可持续的利用方式,广泛应用于工业和农业领域(养殖、能源、纺织等)。因此,实现高效低成本的纤维素酶生产成为研究和发展的目标。木霉属真菌是重要的纤维素酶产生菌,具有产酶量大、酶系全和酶活性高等优点,分泌的胞外酶易于工业生产中的分离提纯。本研究以课题组前期积累和保存的25种木霉150个菌株为材料,通过刚果红平板法筛选、滤纸酶活测定和天然纤维素降解等测试,筛选出14株产纤维素酶能力较强的菌株(优于对照菌株里氏木霉QM9414),从中选取3株进行最佳产酶条件探索,如接种量、吐温80添加量、发酵培养基pH值等。初步测试结果表明,贵州木霉菌株8705在20℃条件下、摇瓶发酵9 d、在优化后的发酵培养基中产酶效果最佳,其上清液酶活可达到6.63 IU/mL。通过优化发酵温度、发酵时间和培养基成分配比等发酵条件,为资源利用打下物质基础并提供理论依据。     

木霉对植物的促生作用及其机制

简要回顾了木霉促进植物生长作用及其机制的研究进展,探讨了木霉促生作用的存在问题及对策,并对木霉促生作用的应用前景进行了展望。     

一株抗香蕉枯萎病内生细菌的分离鉴定及其抗病促生作用

从巴西蕉中分离到一株能够明显抑制尖孢镰刀菌古巴专化型4 号生理小种(FOC4)的内生细菌DB09208, 通过生理生化、形态特征及16S rDNA 序列同源性比较, 初步认为它和类芽孢杆菌(Paenibacillus)比较接近。该菌株能够显著抑制FOC4 菌丝生长, 抑菌率为74.09%。盆栽试验表明,该菌株能够抑制香蕉枯萎病的发生, 防治效果达为65.2%, 该菌同时能显著促进香蕉苗生根, 促生效果与植物生长素IAA 相似, 显示出良好的开发前景。     

两株香蕉枯萎病拮抗细菌的筛选及抑菌机理

【目的】从发病蕉园中的健康香蕉根际筛选能有效抑制香蕉枯萎病病原菌生长的拮抗菌,进一步研究其抑菌机理。【方法】应用双层平板初筛和平板对峙实验复筛具有抑菌效果的拮抗菌;经生理生化试验、16S rRNA基因测序和特异引物扩增对拮抗菌进行鉴定;酸沉淀方法提取拮抗菌发酵液抑菌物质粗提液,基于比色法和HPLC测定粗提液对菌丝蛋白质含量、脂质过氧化、麦角甾醇和果胶酶活性的影响。【结果】筛选获得两株拮抗细菌H-2和H-7,初步鉴定为枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌,Gen Bank登录号分别为KX791428和KX791430;温室盆栽试验显示,两株拮抗菌对香蕉枯萎病的生防效率分别为59.1%和53.0%;H-2和H-7粗提液处理病原菌菌丝后,因脂质过氧化产生的丙二醛含量显著增加,分别达0.55μmol/L和0.48μmol/L;而蛋白含量、麦角甾醇含量和果胶酶活性均显著下降,其中H-2处理的抑制幅度更大,三项指标分别为0.15 mg/g、1.31 mg/g和0.008 7 U/m L,显著低于对照的0.25 mg/g、1.96 mg/g和0.035 U/m L。【结论】从健康香蕉根际筛选到两株拮抗细菌,两者可能通过增强病原菌菌丝的脂质过氧化和降低细胞代谢产物合成的方式抑制病原菌生长,可为两株拮抗菌的生防应用提供理论依据。     

氨水熏蒸对高发枯萎病蕉园土壤微生物区系及发病率的影响

采用涂布计数及荧光定量PCR和PCR-DGGE技术,研究了氨水熏蒸对土壤微生物区系的影响,并研究氨水熏蒸对高发枯萎病香蕉园枯萎病的防控效果和对香蕉产量的影响。结果表明:与熏蒸前相比,高发枯萎病香蕉园土壤施用130 L/667 m²的氨水熏蒸后,尖孢镰刀菌的数量下降了1个log单位;与对照处理相比,下降了0.5个log单位。氨水熏蒸后土壤可培养细菌数量与对照相比没有显著差异,但显著低于熏蒸前,可培养真菌的数量显著低于熏蒸前和对照;可培养细菌真菌的比值与熏蒸前相比没有显著差异,但显著高于对照。与对照及熏蒸前相比,氨水熏蒸后土壤中总细菌及总真菌的数量显著下降;熏蒸前后及对照处理总细菌真菌的比值没有明显差异。各土壤样品总细菌及真菌群落结构的PCR-DGGE分析结果表明,氨水熏蒸后土壤微生物在聚类上和条带组成上均与熏蒸前及对照有显著性差异。与对照相比,氨水熏蒸处理使香蕉枯萎病的发病率降低了20%,每666.7m²增产1.25t。以上结果表明,利用合适浓度的氨水对高发枯萎病香蕉园的土壤熏蒸,能够有效改良土壤微生物区系和降低枯萎病的发生。     

香蕉园施用白花鬼针草的控草增效作用

[目的] 探索香蕉园施用白花鬼针草的可行性。[方法] 采用培养皿萌发试验生物测定法,以发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数等化感效应指标评价白花鬼针草对蕉园4种优势杂草的化感作用,同时通过盆栽模拟试验探讨香蕉园施用白花鬼针草后杂草、香蕉和土壤三者的关系。[结果] 当白花鬼针草浸提液浓度为0.0125 g·mL^-1时,对马唐综合化感效应为促进作用,对短叶水蜈蚣、牛筋草、柔弱斑种草综合化感效应为抑制作用,白花鬼针草浸提液浓度为0.025~0.1 g·mL^-1,对4种受体杂草综合化感效应均为抑制作用;白花鬼针草处理具有降低种子发芽率,延缓种子发芽时间的作用,同时对杂草萌发后的鲜重有微弱促进作用,但这种促进作用较弱,综合化感效应表现为抑制作用。随着白花鬼针草茎、叶施用量的增加,控草增效作用不断提升,当施用量为400 g·株^-1时,控草增效作用最佳,对杂草综合株防效为78.99%,综合鲜重防效为70.60%,香蕉苗生物量增加19.79%,土壤有机碳、碱解氮、速效钾依次增加8.72%、10.36%、16.30%。[结论] 本研究初步探明了在香蕉园施用白花鬼针草具有防控蕉园优势杂草、提高土壤肥力和促进香蕉生长的效应。     

Trichoderma species form endophytic associations within Theobroma cacao trichomes

Trichoderma species are usually considered soil organisms that colonize plant roots, sometimes forming a symbiotic relationship. Recent studies demonstrate that Trichoderma species are also capable of colonizing the above ground tissues of Theobroma cacao (cacao) in what has been characterized as an endophytic relationship. Trichoderma species can be re-isolated from surface sterilized cacao stem tissue, including the bark and xylem, the apical meristem, and to a lesser degree from leaves. SEM analysis of cacao stems colonized by strains of four Trichoderma species (Trichoderma ovalisporum-DIS 70a, Trichoderma hamatum-DIS 219b, Trichoderma koningiopsis-DIS 172ai, or Trichoderma harzianum-DIS 219f) showed a preference for surface colonization of glandular trichomes versus non-glandular trichomes. The Trichoderma strains colonized the glandular trichome tips and formed swellings resembling appresoria. Hyphae were observed emerging from the glandular trichomes on surface sterilized stems from cacao seedlings that had been inoculated with each of the four Trichoderma strains. Fungal hyphae were observed under the microscope emerging from the trichomes as soon as 6 h after their isolation from surface sterilized cacao seedling stems. Hyphae were also observed, in some cases, emerging from stalk cells opposite the trichome head. Repeated single trichome/hyphae isolations verified that the emerging hyphae were the Trichoderma strains with which the cacao seedlings had been inoculated. Strains of four Trichoderma species were able to enter glandular trichomes during the colonization of cacao stems where they survived surface sterilization and could be re-isolated. The penetration of cacao trichomes may provide the entry point for Trichoderma species into the cacao stem allowing systemic colonization of this tissue.     

7个香蕉品种对枯萎病的抗性评价及3种评价方法的对比

[目的] 评价香蕉自主选育品种对枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）热带4号小种（tropical race 4, Foc TR4）的抗性。[方法] 以浸根法和2种灌注法将Foc TR4接种于不同抗性的香蕉品种上,分析接种后香蕉的发病情况,比较筛选这3种评价方法,并评价7个香蕉品种的苗期和田间抗性水平。[结果] 采用浓度为2×10⁵ 个·mL^-1的PDB培养基Foc TR4孢子悬浮液灌注法进行香蕉苗期抗性评价更为高效可行;综合苗期和田间抗性评价结果,7个香蕉品种的抗性由高到低为：南天黄>红研3号>红研5号>红研2号>滇蕉1号>巴西蕉>红研1号。[结论] 以南天黄作为高抗品种对照,以巴西蕉作为高感品种对照条件下,红研3号和红研5号抗性为中等抗性偏强,红研2号达到中抗水平,滇蕉1号为感病,红研1号为高度感病。     

拮抗北细辛菌核病木霉菌的分离、鉴定及生防效果

【背景】菌核病是北细辛根部主要病害之一,木霉菌作为目前应用最广泛的生物防治真菌,利用木霉菌防治北细辛菌核病是目前研究的热点。【目的】通过稀释分离法对健康北细辛植株根际土壤进行菌株分离,以期筛选出有效拮抗北细辛菌核病的生防木霉菌。【方法】以北细辛菌核病菌为靶标菌,采用平板对峙培养、挥发性与非挥发性物质抑菌的方法对分离得到的木霉菌进行筛选,采用生长速率法对筛选出的木霉菌的发酵液进行抑菌效果测定,并采用硫代巴比妥酸法测定筛选出的木霉对北细辛菌核病菌的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、紫外吸收法测定过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性、氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性、愈创木酚法测定过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性的影响。【结果】从土壤中分离出木霉菌共14株,通过形态学和ITS-RPB2双基因联合构建系统发育树,鉴定其为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、钩状木霉(Trichoderma hamatum)、拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)、深绿木霉(Tr...     

香蕉林土壤可培养放线菌分离、鉴定及其抑菌活性

【背景】香蕉枯萎病是香蕉的顽固性疾病,制约着香蕉产业的发展,因此,筛选出对香蕉枯萎病菌(尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种,简称Foc4)具有抑制活性的生防菌株具有重要意义。【目的】分离香蕉林土壤样品中放线菌并进行物种的初步鉴定,测定其对包括香蕉枯萎病致病菌的7种病原菌的拮抗活性,获得高活性菌株,以获得解决香蕉枯萎病的生物防治策略。【方法】采集多份广西地区香蕉林土壤样品,采用超声波等手段对其预处理,设置多种特异性培养基从中分离放线菌资源,对获得的放线菌进行基于16SrRNA基因序列的物种鉴定,以7种病原菌为靶标,采用平板对峙法从中筛选抑菌活性菌株,最后采用菌丝生长速率法对Foc4的抑菌率进行测定。【结果】从香蕉林土壤中分离出138株放线菌均为链霉菌,其中5株为潜在新种,分别为X1085、X1052、X2052、X3059和X4046;筛选出具有抑菌活性的菌株77株,阳性率为55.8%。20株对Foc4具有抑制活性,其中4株拮抗效果明显,抑制率大于80%,菌株X4050的抑菌率高达93.76%。【结论】初步明确了香蕉林土壤中可培养放线菌的物种信息,其中部分放线菌为未知物种,活性分析显示一半...     

粮食上木霉菌的分离鉴定及其生防效果

【背景】粮食在生长和收储期极易受到病原真菌或产毒真菌的污染,造成严重的损失。众多实践证明木霉属(Trichoderma)可以有效防治植物病原真菌。【目的】鉴定和筛选能有效抑制粮食常见危害真菌的木霉生防菌株,开发生防菌剂,保障粮食生产安全。【方法】从粮食上分离筛选出35株木霉,通过多基因系统发育分析和形态学观察方法进行菌种鉴定,利用平板对峙试验筛选出对粮食常见危害真菌有抑制作用的菌株。【结果】35株木霉分属于8个种,分别为非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)、类棘孢木霉(Trichodermaasperelloides)、 Trichoderma amoenum、近深绿木霉(Trichoderma paratroviride)、Trichoderma obovatum、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、东方木霉(Trichodermaorientale)和深绿木霉(Trichodermaatroviride)。对峙试验结果表明,这8种木霉对于粮食上分离到的10种危害真菌均具有较好的抑制效果。非洲哈茨木霉(T.afroharzi...     

Growth stimulation in bean (Phaseolus vulgaris L.) by Trichoderma

Trichoderma species are commonly used as biological control agents against phytopathogenic fungi and some strains are able to produce metabolites that enhance plant growth. In the current study we evaluated the production of potential growth-promoting metabolites, rhizosphere competence and endophytism for 101 isolates of Trichoderma from Colombia, and assessed the relationship of these factors to the enhancement of early stages of growth on bean seedlings. Twenty percent of these Trichoderma strains were able to produce soluble forms of phosphate from phosphoric rock. Only 8% of the assessed strains showed consistent ability to produce siderophores to convert ferric iron to soluble forms by chelation. Sixty percent of isolates produced indole-3-acetic acid (IAA) or auxin analogues. The production of any of these metabolites was a characteristic of specific strains, as the ability to produce these metabolites varied greatly within species. Moreover, the production of these substances did not correlate with enhanced growth on bean seedlings, measured as the combined increase in length of roots and aerial parts in the V3 stage of growth. Seven Trichoderma isolates significantly improved the growth of bean seedlings. However, metabolite production varied widely in these seven strains, and some isolates did not produce any of the assessed growth-promoting metabolites. Results indicated that growth was enhanced in the presence of rhizosphere competent and endophytic strains of Trichoderma, and these characteristics were strain-specific and not characteristic for species.