盐穗木过氧化氢酶基因的克隆与功能分析

利用同源基因克隆法,从新疆荒漠盐碱地多年生灌木盐穗木(Halostachys caspica)中克隆获得盐穗木过氧化氢酶基因(HcCAT1)。序列分析表明,HcCAT1基因开放阅读框为1 479 bp,编码492个氨基酸,推测编码蛋白质的分子量为56.7 kD,等电点为6.84。基因序列比对发现,HcCAT1与多种植物过氧化氢酶基因具有较高的同源性。半定量RT-PCR结果表明,HcCAT1基因受盐胁迫而上调表达。将构建的重组质粒pET32a-HcCAT1转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导重组蛋白His-HcCAT1的表达;SDS-PAGE和Western印迹检测显示,重组蛋白的分子量大小为77.7 kD,其大小与推测的大小一致;在低温诱导下以可溶性形式表达,且表现出一定的过氧化氢酶活性。盐胁迫实验结果显示,在添加400 mmol/L NaCl、400 mmol/L KCl以及300 mmol/L甘露醇的LB培养基中,重组质粒转化菌的生长情况和生长速率明显优于对照,表明HcCAT1可明显提高大肠杆菌的耐盐性。该研究结果将有助于从抗氧化角度认识盐生植物盐穗木的耐盐分子机理。     

盐穗木HcDMC1的原核表达和抗血清的制备

DMC1是减数分裂过程中同源染色体配对和重组修复所必需的减数分裂特异蛋白。根据盐胁迫下盐穗木转录组数据库,克隆获得的盐穗木DNA损伤修复基因命名为HcDMC1。为深入分析盐穗木HcDMC1基因的耐盐功能,通过原核表达获得盐穗木HcDMC1的融合蛋白,用于免疫小鼠制备特异性的HcDMC1抗血清。结果表明,利用pET30a-HcDMC1能够在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达融合蛋白His-HcDMC1,纯化融合蛋白His-HcDMC1的含量为1.0 mg·mL^-1。每次每只小鼠免疫接种50 μg融合蛋白,三次免疫接种后进行抗体效价及特异性检测。ELISA检测抗血清滴度约为1：400 000,Western Blot检测证明了抗血清的特异性。本研究制备的小鼠抗血清能够为盐穗木HcDMC1蛋白的功能鉴定和免疫检测提供实验材料。     

叶施NO对NaCl胁迫下红砂幼苗叶片和根系中氮代谢酶及营养物质的影响

以当年生红砂(Reaumuria soongorica)幼苗为材料,采用盆栽实验,考察叶面喷施不同浓度(0、0.01、0.10、0.25、0.50、1.00 mmol·L^-1)NO供体硝普钠 (SNP) 对NaCl(300 mmol·L^-1)胁迫下红砂根、叶中可溶性蛋白、游离氨基酸和硝态氮含量,以及谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)、硝酸还原酶(NR)活性的影响,并采用主成分分析和隶属函数法筛选NO对NaCl胁迫缓解效应的氮代谢指标和最佳NO浓度,以探讨外源NO对NaCl 胁迫下红砂缓解效应的氮代谢响应机制。结果表明：(1)在300 mmol·L^-1 NaCl胁迫处理下,红砂幼苗根、叶中可溶性蛋白、硝态氮含量以及GS、GOGAT、NR活性均比对照显著下降。(2)外源NO能显著提高盐胁迫下红砂叶、根中GS、GOGAT、NR活性和硝态氮含量,增加根中可溶性蛋白和游离氨基酸含量。(3)NR和GOGAT活性可用于评价NO对NaCl胁迫下红砂幼苗的缓解作用,外源NO(SNP)对红砂幼苗在NaCl胁迫下的缓解效果强弱表现为0.25 mmol·L^-1> 0.50 mmol·L^-1> 0.10 mmol·L^-1> 1.00 mmol·L^-1> 0.01 mmol·L^-1。研究发现,300 mmol·L^-1 NaCl胁迫显著抑制了红砂幼苗氮代谢,外源NO(SNP)有助于提高盐胁迫下红砂NR活性,加快硝态氮转化为铵态氮,促进红砂叶片和根中GS/GOGAT对转化物的同化,从而增强红砂幼苗的耐盐性,并以0.25 mmol·L^-1SNP处理时缓解作用最佳;NR和GOGAT活性可作为NO缓解盐胁迫的评价指标。     

一株MAs (III)脱甲基菌株的分离及功能基因的研究

[目的] 分离并鉴定三价单甲基砷（MAs （III））脱甲基菌株,对MAs （III）脱甲基菌FJ-6中arsI基因进行克隆表达,并对arsI基因表达蛋白进行功能鉴定。[方法] 利用富集培养的方法分离MAs （III）脱甲基菌株,并通过形态学、生理生化特征和16S rDNA基因进化分析进行鉴定;HPLC-ICP-MS鉴定菌株转化MAs （III）的产物为三价砷（As （III））,对菌株FJ-6的基因组进行生物信息学分析,寻找潜在的MAs （III）脱甲基酶编码基因,通过PCR扩增获得arsI全长基因,构建重组质粒pET29a-arsI,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株进行异源表达,通过Ni²⁺-NTA亲和层析柱纯化异源表达的蛋白,以MAs （III）为反应底物,检测MAs （III）脱甲基酶ArsI的酶学特性。通过实时定量PCR观察arsI的表达类型。[结果] Bacillus aryabhattai FJ-6在12 h内能将1 μmol/L MAs （III）完全转化为As （III）。克隆得到MAs （III）脱甲基酶表达基因arsI,构建了pET29a-arsI重组质粒并进行了表达,ArsI蛋白分子量为17.4 kDa。ArsI纯化蛋白具有较高的MAs （III）脱甲基酶的活性;荧光定量PCR实验结果表明arsI受砷诱导表达。[结论] 明确了ArsI蛋白具有MAs （III）脱甲基酶活性。     

大鼠Shh-N融合蛋白的表达、纯化及功能研究

为了获得重组Sonic hedgehog N端蛋白（Shh-N）并研究其功能,应用PCR技术扩增Shh-N cDNA,然后克隆至原核表达质粒中,转化E.coli后获得表达菌株, 经1 mmol/L IPTG诱导高效表达出带有His-tag的融合蛋白,其中大部分为可溶性蛋白,少量为包涵体.用His-tag特异性结合树脂纯化可溶性融合蛋白,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一区带,凝胶自动扫描分析表明,Shh-N的纯度达85%以上.纯化后的Shh-N在成纤维生长因子8(FGF₈)的协同作用下,能诱导神经前体细胞（NPC）向酪氨酸羟化酶阳性神经元（TH⁺）发育.在此基础上可以诱导不同类型的人类干细胞定向分化为多巴胺(DA)神经元,从而为临床治疗帕金森病（PD）提供充足的供体细胞.     

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a的制备及其在tPA突变体纯化中的应用

将基因工程菌株E.coliBL21(DE3) pET22b-mETIa高密度发酵,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a(rETIa)蛋白在E.coli中得到较高水平表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上.经菌体破碎、包涵体变性、复性,二步柱层析纯化得到电泳纯的rETIa蛋白.测得rETIa对t-PA突变体(NTA)的抑制平衡常数K_i为8.72×10^－8 mol/L.据此利用纯化的rETIa蛋白制备rETIa-Sepharose 4B亲和层析柱.直接一步纯化NTA复性液,纯化的NTA纯度达90 %以上,收率为96.2 %,纯化倍数为13.2,比活为(565.7±71.3) U/μg.     

粗枝云杉病程相关蛋白基因PaPR10的克隆及表达分析

为了探究粗枝云杉(Picea asperata)病程相关蛋白PR10的核糖核酸酶活性,该研究以粗枝云杉一年生针叶为材料,以响应云杉落针病菌(Lophodermium piceae)侵染而显著上调的一个PR10基因(PaPR10)序列为研究对象,设计特异性引物,采用RT PCR技术克隆获得PaPR10基因的cDNA序列全长,使用生物信息学软件预测该基因编码蛋白的序列特征,将该基因进行原核表达和纯化,利用底物法检测纯化蛋白的核糖核酸酶活性,为解析PR10基因的抗菌活性机理奠定基础。结果表明：(1)成功克隆到PaPR10基因(GenBank登录号为OM743228)的ORF长456 bp,编码151个氨基酸序列,相对分子量为16.52 kD,理论等电点为5.73。(2)PaPR10蛋白无信号肽、不含跨膜区、定位在细胞质中,具有典型的病程相关蛋白Bet_v_1家族保守结构域和一个富含甘氨酸环(P Loop)的保守结构域,但PaPR10蛋白的P Loop结构域存在一个碱基突变;PaPR10蛋白与北美云杉等多种裸子植物和部分苔藓植物的PR10蛋白相似性较高。(3)IPTG诱导下,PaPR10蛋白以可溶性蛋白和包涵体的形式并存,且以终浓度为0.8 mmol/L的IPTG在30 ℃下诱导10 h时表达量最佳,但纯化后的PaPR10可溶性蛋白没有核糖核酸酶活性。研究发现,PaPR10蛋白不具备核糖核酸酶活性。     

人心肌肌钙蛋白I-C融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

提取人心肌组织总RNA,RT-PCR扩增出人心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）和肌钙蛋白C（TnC）基因,利用人工合成的可编码19个中性氨基酸残基为主的DNA序列（Linker）,将cTnI和TnC基因连接,插入到质粒pET15b中,将鉴定正确的重组pET15b质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,用异丙基-β-D–硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达.结果在大肠杆菌中成功实现了全长cTnI-C融合蛋白（cTnI-linker-TnC）的稳定可溶性高表达,在摇瓶中表达量可达21 mg/L.利用目的蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）,经一步Ni²⁺-Sepharose柱亲和层析纯化,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯蛋白质.经初步研究,cTnI-C具有较好的免疫原性和稳定性,有望成为cTnI测定系统可溯源的候选参考物质,推进cTnI检测的标准化进程.     

中华大蟾蜍重组Gal-3C的原核表达、纯化及抗血清制备

半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)与肿瘤的发生发展密切相关,已有文献表明其羧基端galectin-3C(Gal-3C)具有一定的肿瘤抑制作用。为了获得Gal-3C的抗血清,实验以已有的重组质粒pGM-Gal-3为模板,利用PCR方法扩增中华大蟾蜍Gal-3C基因片段,并将其插入到表达载体pET28b上,构建中华大蟾蜍Gal-3C的原核表达载体pET28b-Gal-3C;将构建好的重组质粒pET28b-Gal-3C转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导蛋白质表达,并通过SDS-PAGE和Western-blot检测目的蛋白Gal-3C的表达;以纯化的重组蛋白Gal-3C免疫小白鼠,制备鼠抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清,用Western-blot检测抗血清的特异性及其效价。结果显示成功构建了中华大蟾蜍pET28b-Gal-3C重组质粒,并诱导得到了目的蛋白的表达,而且将表达产物免疫小鼠后获得了特异性良好的抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清。以上结果为抗肿瘤药物的研究和发展奠定了基础。     

不结球白菜金属硫蛋白基因的克隆及表达分析

通过RACE技术,从不结球白菜抗病品种‘苏州青’叶片克隆到金属硫蛋白(metallothionein)基因的全长cDNA序列(BcMT2)。序列分析结果表明,BcMT2基因的cDNA全长为528 bp,其中开放阅读框长度为243 bp,共编码80个氨基酸,相对分子质量为8.02×10³ Da,理论等电点是4.61。氨基酸同源系统进化分析表明,不结球白菜BcMT2基因属于Ⅱ类植物MT2基因家族,且与同科植物的进化关系相近,其中与大白菜第5号染色体的基因(Bra029765)相似性最高(100%)。qRT PCR分析表明,BcMT2基因在不结球白菜叶中表达最强;霜霉病菌诱导后,BcMT2基因在抗病品种‘苏州青’中的表达量于48 h达到峰值,而在感病品种‘矮脚黄’中的表达量于72 h达到峰值;盐处理条件下,BcMT2基因在抗病品种‘苏州青’中的表达量于12 h达到峰值,而在感病品种‘矮脚黄’中的表达量于24 h达到峰值;ABA处理下,‘苏州青’中其表达量于24 h达到峰值,且在‘矮脚黄’中BcMT2基因的表达趋势与‘苏州青’类似;干旱处理条件下BcMT2基因的表达在两材料中均受到抑制。BcMT2原核表达分析发现,在37 ℃、1.0 mmol·L^-1IPTG诱导2、4 、6 h后,均检测到了一条蛋白分子质量约为8×10³ Da的表达特异条带,这与预期融合蛋白的相对分子质量的理论值8.02×10³ Da相符。研究表明,不结球白菜BcMT2基因在受到生物胁迫和非生物胁迫等逆境条件下均发挥着重要作用,且BcMT2在大肠杆菌中成功实现融合表达,为进一步进行蛋白水平和转基因功能研究奠定了基础,也为选育高产、优质的不结球白菜新品种提供重要的理论依据。     

Kinetic folding and assembly mechanisms differ for two homologous heptamers

Here we investigate the time-resolved folding and assembly mechanism of the heptameric co-chaperonin protein 10 (cpn10) in vitro. The structure of cpn10 is conserved throughout nature: seven beta-barrel subunits are non-covalently assembled through beta-strand pairings in an overall doughnut-like shape. Kinetic folding/assembly experiments of chemically denatured cpn10 from Homo sapiens (hmcpn10) and Aquifex aeolicus (Aacpn10) were monitored by far-UV circular dichroism and fluorescence. We find the processes to be complex, involving several kinetic steps, and to differ between the mesophilic and hyper-thermophilic proteins. The hmcpn10 molecules partition into two parallel pathways, one involving polypeptide folding before protein-protein assembly and another in which inter-protein interactions take place prior to folding. In contrast, the Aacpn10 molecules follow a single sequential path that includes initial monomer misfolding, relaxation to productive intermediates and, subsequently, final folding and heptamer assembly. An A. aeolicus variant lacking the unique C-terminal extension of Aacpn10 displays the same kinetic mechanism as Aacpn10, signifying that the tail is not responsible for the rapid misfolding step. This study demonstrates that molecular details can overrule similarity of native-state topology in defining apparent protein-biophysical properties.     

乙酰转移酶基因NAA10的生物学功能及其在肿瘤中的作用

N端乙酰转移酶A（N-acetyltransferase A, NatA）复合体是真核生物最主要的N端氨基酸α位乙酰转移酶,N端α位乙酰转移酶10基因（N-α-acetyltransferase 10, NAA10）编码的N端α位乙酰转移酶10蛋白（N-α-acetyltransferase 10 protein, Naa10p）是NatA的催化亚基. Naa10p具备新生蛋白质N端氨基酸α位乙酰化活性、成熟蛋白质Lys残基ε位乙酰化活性以及对部分转录因子的协同调节作用. Naa10p能够通过调节细胞周期促进细胞增殖,通过调节雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin, mTOR）通路促进细胞自噬,并通过多种不同的分子信号通路抑制细胞运动能力.根据乙酰化底物的不同,Naa10p还在细胞凋亡的调控中起双重作用. Naa10p参与的生物学过程还涉及血管生成和神经发育等. Naa10p在多种癌症组织中呈过表达,但其预后意义随肿瘤不同而有较大差别.对Naa10p的生理生化研究必将使我们对细胞的生理病理学过程及其机制的了解更加深入全面.本文将从蛋白质结构、机制功能及临床意义等不同角度系统地阐述NAA10的研究现状与进展.     

水稻内生成团泛菌YS19共质体形成差异表达蛋白MalE及其兼职功能

成团泛菌YS19是从水稻“越富”品种中分离的一种优势内生细菌,与宿主水稻互作时具有多种促生作用,其形成的共质体(symplasmata)结构与菌体抗逆及与宿主互作有重要意义．研究发现了一种在YS19共质体形成阶段高表达的差异蛋白,对其用肽指纹图谱进行鉴定,发现其属于周质空间麦芽糖结合蛋白家族．克隆了该蛋白质的基因,重组表达并分离纯化了该蛋白质,发现它是一种兼职功能蛋白,其不仅参与麦芽糖的ABC运输系统,而且在强酸环境下不易发生变性沉淀,并可通过疏水面的显著暴露结合底物蛋白来发挥分子伴侣活性,这些兼职功能构成了菌体抗逆生存适应性的重要分子基础．     

无细胞系统原位制备蛋白质芯片及其应用

主要介绍了目前在生物芯片表面进行蛋白质无细胞表达与定向制备蛋白质芯片的研究进展,包括各种基因植入芯片的方法、蛋白质体外不同表达的途径、蛋白质固定的策略以及可能的应用发展前景等．蛋白质芯片以其高通量、高灵敏和检测迅速等优点正成为蛋白质组学研究中的重要工具之一．蛋白质的高效表达与纯化、蛋白质在芯片表面的有效固定与蛋白质活性的保持等内容是蛋白质芯片技术发展的关键．采用纳米生物技术与无细胞表达系统,已经可以在生物芯片表面通过植入基因的方式制备相关的蛋白质芯片,从而为蛋白质芯片的原位制备开辟了新的方向．     

大肠杆菌的蛋白分泌机制

大肠杆菌的分泌蛋白定位于内膜、外膜、周质空间和胞外环境,它们在N端或C端带有一定的结构包含着分泌信号,这两类分泌蛋白在各自特定的一组蛋白因子的协助下跨越内膜,再通过目前尚不清楚的方式实现其最终定位.N端带有信号肽的分子在跨越内膜时得到Sec家族蛋白因子协助,信号肽在跨膜过程中可能被切除,该过程由ATP和电化学势提供能量.C端带分泌信号的分子主要受到Hly家族分子协助,一次穿过内膜和外膜而不经过周质空间.     

Sec-10 影响神经肌肉接头突触后敏感性的研究

exocyst复合物在分泌过程中起重要作用．可是分子机理尚未研究透彻．通过TMP/UV的基因敲除方法,得到了exocyst复合物中一种组分sec-10的缺陷型线虫．药学结果显示这种线虫神经信号传递存在缺陷,可是电生理的方法证明在神经肌肉接头处的已报道离子型受体和野生型相比并未发生改变．因此猜测,sec-10并未直接影响神经肌肉接头处的离子型受体,而是通过其他途径来行使功能．     

结核分枝杆菌RD-1区编码蛋白的结构和功能

RD-1(region of difference-1)被认为在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的致病机理中起着关键的作用．RD-1基因全长9.5 kb,开放读码框从Rv3871～Rv3879c,分别编码9种不同的蛋白质．RD-1区在卡介苗(bacillus Calmette-Guerin,BCG)中是缺失的．研究结果显示,RD-1区是结核分枝杆菌的主要毒力因素之一,同时RD-1区参与了一种新的分泌系统ESX-1,这种分泌系统能够促进某些特定蛋白的分泌．ESX-1分泌的两种主要蛋白质CFP-10 (culture filtrate protein of 10 ku)和ESAT-6 (early secreted antigenic target of 6 ku)能够形成牢固的1∶1的复合体,这两种蛋白质能够协同分泌而且能够引起T细胞反应,并可能作为理想的靶抗原在结核的预防和诊断中发挥作用．     

鹅掌楸DHHC型锌指蛋白家族基因的克隆及表达分析

棕榈酰化修饰是一种最普遍且唯一可逆的翻译后脂质修饰方式,赋予蛋白质多样化的生理功能。DHHC( Asp-His-His-Cys)蛋白家族是一类与棕榈酰化修饰相关的蛋白,多数DHHC蛋白家族成员具有蛋白质酰基转移酶( protein S-acyltransferase,PAT)活性。该研究以鹅掌楸叶芽为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆获得了3个鹅掌楸DHHC蛋白家族基因cDNA全长,命名为LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23。序列分析结果表明：LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23基因全长分别为1933、2592、2217 bp,各包含1332、1839、1662 bp的开放阅读框( Open Reading Frame,ORF),编码433、612、533个氨基酸,预测蛋白分子量分别为40.04、67.3、60.57 kDa,理论等电点为9.15、9.03、7.29。3个基因编码的蛋白均有4个跨膜区,并且都在跨膜域( transmembrane domain, TM) TM2和 TM3之间存在一个 DHHC 蛋白家族典型的 DHHC-CRD 结构域。同源性分析表明：鹅掌楸LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23编码的氨基酸序列与其他植物中预测的PAT具有较高的相似性。利用荧光定量PCR技术检测3个基因在鹅掌楸不同组织中的表达特性,发现3个基因在不同组织中均有表达,但表达量具有明显区别。同一家族基因表达模式的变化表明其功能非冗余。该研究结果将为鹅掌楸生长发育与形态建成,以及逆境响应信号传导等相关基因的调控研究提供了参考。     

Activation of the SARS-CoV-2 NSP14 3′–5′ exoribonuclease by NSP10 and response to antiviral inhibitors

Understanding the core replication complex of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is essential to the development of novel coronavirus-specific antiviral therapeutics. Among the proteins required for faithful replication of the SARS-CoV-2 genome are nonstructural protein 14 (NSP14), a bifunctional enzyme with an N-terminal 3′-to-5′ exoribonuclease (ExoN) and a C-terminal N7-methyltransferase, and its accessory protein, NSP10. The difficulty in producing pure and high quantities of the NSP10/14 complex has hampered the biochemical and structural study of these important proteins. We developed a straightforward protocol for the expression and purification of both NSP10 and NSP14 from Escherichia coli and for the in vitro assembly and purification of a stoichiometric NSP10/14 complex with high yields. Using these methods, we observe that NSP10 provides a 260-fold increase in k_cat/K_m in the exoribonucleolytic activity of NSP14 and enhances protein stability. We also probed the effect of two small molecules on NSP10/14 activity, remdesivir monophosphate and the methyltransferase inhibitor S-adenosylhomocysteine. Our analysis highlights two important factors for drug development: first, unlike other exonucleases, the monophosphate nucleoside analog intermediate of remdesivir does not inhibit NSP14 activity; and second, S-adenosylhomocysteine modestly activates NSP14 exonuclease activity. In total, our analysis provides insights for future structure–function studies of SARS-CoV-2 replication fidelity for the treatment of coronavirus disease 2019.     

缺氮介导的莱茵衣藻油脂合成过程的内参及标志物蛋白质的筛选鉴定

微藻被认为是最有潜力的生物能源原料之一,了解油脂合成机理、提升油脂合成的效率是重要的生物学问题.莱茵衣藻缺氮胁迫是油脂合成机理研究的模式系统,组学研究已经积累了大量的数据,但针对莱茵衣藻缺氮介导的油脂合成过程的内参及标志物蛋白质还鲜有报道.本研究对莱茵衣藻进行了对照和缺氮胁迫培养,比较了多个时间点(0、1、2、4和6d)在2种处理条件下的培养物表型、细胞密度、油脂含量以及总蛋白质含量的变化等特征.结果显示:莱茵衣藻细胞在受到缺氮胁迫后表现为培养物颜色由绿变黄;A750和细胞计数结果显示细胞生长趋于停滞;尼罗红染色定量实验鉴定到油脂含量的显著升高;考马斯亮蓝染色实验检测到总蛋白质含量降低.以20个莱茵衣藻蛋白质为候选,利用蛋白质印迹技术(Western blot,WB)检测了其在不同处理和不同时间点的表达特征变化,通过计算总蛋白质和候选蛋白质含量的皮尔森相关系数(Pearson’s correlation coefficient, PCC)筛选了莱茵衣藻缺氮胁迫的内参蛋白质,发现Histone H3、 RBCL(ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)和BCR1(biotin carboxylase,ACCase complex 1)在对照和缺氮胁迫条件下均与总蛋白质含量变化呈现极显著或显著正相关,所以被选作内参蛋白质.进而通过比较候选蛋白质的平均相对倍率变化(average relative fold change, ARF),鉴定了莱茵衣藻缺氮胁迫的标志物蛋白质,发现ATPs-β(ATP synthase CF1beta subunit)、 GAP2(glyceraldehyde 3-phosphate dehydratase 2)和RMT1(rubisco large subunit N-methyltransferase 1)蛋白质的ARF值分别为180.59、52.90和12.48,明显高出其他蛋白质,由此把它们选做缺氮胁迫的标志物蛋白质.接下来,对缺氮胁迫早期(0、2、4、8、12、18、24和48 h)的样品进行蛋白质印迹法分析,发现可检测的ATPs-β、GAP2和RMT1的缺氮诱导条带出现的时间分别是8、18和12 h.综上可以认为,在所有候选蛋白质中,ATPs-β是出现最早且变化幅度最大的缺氮处理标志物蛋白质.本研究鉴定的内参和标志物蛋白质对了解缺氮应答及油脂合成机理会有所帮助,所积累的蛋白质表达信息可供研究同行参考.