苏云金杆菌δ—内毒素基因在大肠杆菌中的克隆及表达

分离了苏云金杆菌肯尼亚亚种7404(Bacillus huringiensis subsp．Kenyae 7404)和库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp．Kwrstaki HD-1)的质粒。经凝胶原位杂交证明苏云金杆菌肯尼亚亚种7404的δ—内毒素基因位于约47Md大小的一个质粒上。用蔗糖密度梯度离心法从sau 3 A1部分酶解的上述两种苏云金杆菌质粒DNA酶解片段中分离出大于 4kb的DNA片段,将这些片段克隆到pBR332的Barn HI位点上并转化大肠杆菌HB101。通过菌落原位杂交、菌落原位放射免疫试验及Western blct分析等方法,选到了带有δ—内毒素基因并能在大肠杆菌中表达此毒蛋白的转化体。初步的生物学试验表明,在四个试验过的转化体中带有肯尼亚亚种δ—内毒素基因的转化体TK89及带有库斯塔克亚种δ—内毒素基因的转化体THl2和TH48对烟青虫(Heliothis assulta)有毒杀活性。     

苏云金芽孢杆菌CrylAb13基因的克隆及表达研究

BtC005是我国自行分离的对多种害虫具有毒杀作用的苏云金芽孢杆菌。经PCR-RFLP系统鉴定,它含有crylAb基因。Southern blot结果显示;PstI酶切C005质粒所得的8.5kb长的DNA片段为crylAb基因的阳性杂交带。以pUCP19为载体,克隆了该片段并证明其含有crylAb基因,对其进行亚克隆和测序,结果表明该基因编码区为3468bp,其编码的蛋白含1155个氨基酸,分子量为130.6kD,等电点为pH4.845。该基因已在GenBank基因库中注册,Accession number为AF254640,并为国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为crylAb13。将crylAb13基因在Bt无晶体突变株cryB^-中表达,蛋白质电泳结果表明在130kD处有表达带,并证明GryAb对小菜蛾有较高的杀虫活性。     

苏云金芽孢杆菌酪氨酸酶基因的克隆表达及应用初探

酪氨酸酶基因编码的酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶。采用比较酪氨酸酶的同源保守结构域氨基酸序列的方法设计引物 ,从苏云金芽胞杆菌 (Bacillusthuringiensis) 4D11中通过PCR扩增得到了包含酪氨酸酶基因的DNA片段。将该片段亚克隆到载体pGEM_7zf上并转入大肠杆菌DH5α ,所得到的转化子在添加了L_酪氨酸的LB培养基中能合成可溶性的黑色素。测定该菌株黑色素的产量和在紫外光照射后的菌体活力 ,结果表明该基因产生的黑色素能在一定程度上保护菌体免受紫外辐射     

苏云金杆菌以色列亚种几丁质酶基因的克隆及序列分析

从苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis subsp israelensis)中提取基因组DNA,通过合成1对特异性引物,用touchdown PCR的方法扩增几丁质酶ichi基因序列（GenBank登录号：AF526379）。ichi序列全长为2570bp,含有1个2067bp的开放阅读框（ORF）,编码688个氨基酸,推测分子量为75.79kDa,等电点pI=5.90的几丁质酶前体。序列和结构比较分析表明：Ichi氨基酸序列与蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus)28-9几丁质酶CW、蜡状芽孢杆菌CH几丁质酶B及苏云金芽孢杆菌墨西哥亚种几丁质酶的同源性分别为97.24%、97.18%、97.63%,而与苏云金芽孢杆菌巴基斯坦亚种的同源性只有63.07%。Ichi编码区由分泌信号肽（46AA）、催化区（105AA)、粘蛋白Ⅲ型同源区（74AA）及几丁质结合区（40AA）组成。     

杀鞘翅目幼虫Bt菌株YM—03的δ—内毒素基因定位

苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）的morrisoni亚种YM－03（8a8b）是本实验室分离的对鞘翅目幼虫有高毒力的菌株。经PCR产物分析它含有cry3A基因,产生68ku的毒素蛋白。经质粒图谱分析,该菌株含有3个质粒,其大小分别为83,72,9Mu。以cry3A基因的PCR产物片段为模板标记探针,与YM－03总DNA杂交,结果显示该菌的δ－内毒素基因定位于染色体上,有望构建出稳定遗传的广谱工程菌。     

嗜碱细菌NTT36嗜碱基因的亚克隆及其在大肠杆菌和农杆菌中的表达

将大肠杆菌ＨＢ１０１嗜碱转化子中质粒ｐＧＣＡ所携带的嗜碱基因亚克隆至双元载体ｐＢＩ１２１质粒中,构建了植物表达载体ｐＬＧＣ重组质粒。用其转化大肠杆菌ＨＢ１０１获得了能在碱性和卡那霉素抗性平板上生长的转化子,再通过三亲交配法将亚克隆质粒ｐＬＧＣ转化进农杆菌ＬＢＡ４４０４,又获得能在碱性平板和卡那霉素及利福平双抗平板上生长的转化子,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明ＨＢ１０１转化子亚克隆质粒ｐＬＧＣ是由来自于嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６染色体ＤＮＡ和双元载体ｐＢＩ１２１组成,且农杆菌ＬＢＡ４４０４转化子含有来自大肠杆菌亚克隆转化子的ｐＬＧＣ质粒。     

嗜碱细菌NTT36嗜碱基因的亚克隆及其在大肠杆菌和农杆菌中的 …

将大肠杆菌ＨＢ１０１嗜碱转化子中质粒ｐＧＣＡ所携带的嗜碱基因亚克隆至双元载体ｐＢＩ１２１质粒中,构建了植物表达载体ｐＬＧＣ重组质粒。用其转化大肠杆菌ＨＢ１０１获得了能在碱性和卡那霉素抗性平板上生长的转化子,再通过三亲交配法将亚克隆质粒ｐＬＧＣ转化进农杆菌ＬＢＡ４４０４,又获得能在碱性平板和卡那霉素及利福平双抗平板上生长的转化子,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明ＨＢ１０１转化子亚克隆质粒ｐＬＧＣ是由来自     

苏云金芽孢杆菌cry1Ab13基因的克隆及表达研究

BtC0 0 5是我国自行分离的对多种害虫具有毒杀作用的苏云金芽孢杆菌 ,经PCR RFLP系统鉴定 ,它含有cry1Ab基因。Southernblot结果显示 :PstI酶切C0 0 5质粒所得的 8 5kb长的DNA片段为cry1Ab基因的阳性杂交带。以pUCP1 9为载体 ,克隆了该片段并证明其含有cry1Ab基因。对其进行亚克隆和测序 ,结果表明该基因编码区为 3 4 6 8bp ,其编码的蛋白含1 1 5 5个氨基酸 ,分子量为 1 3 0 6kD ,等电点为pH4 845。该基因已在GenBank基因库中注册 ,Accessionnumber为AF2 5 4 6 4 0 ,并为国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ab1 3。将cry1Ab1 3基因在Bt无晶体突变株cryB- 中表达 ,蛋白质电泳结果表明在 1 3 0kD处有表达带 ,并证明CryAb对小菜蛾有较高的杀虫活性。     

电脉冲穿孔法将苏云金杆菌δ－内毒素基因导人野生型芽孢杆菌

利用电脉冲穿孔法将带有苏云金杆菌毒蛋白基因的穿梭质粒导人几株野生型芽孢杆菌中。它们是野生型的蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。通过观察在新霉素和氨苄青霉素平板上长出的抗性菌落数t计算出转化效率为10¹一10¹转化子/μgDNA。从转化子中分离到的质粒DNA大小及其用HindⅢ酶切的片段与原始质粒DNA相同,毒性测试表明重组转化子对烟青虫六天的致死率达90—100％。     

mel基因在苏云金芽孢杆菌中的转移和表达

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringhensis)是研究较深入、使用较广泛的杀虫细菌,野外使用易受阳光中紫外线的影响而失活。黑色素具有很强的抗辐射作用。将构建的含有嗜麦芽假单胞菌mel基因的质粒pWSY通过原生质体转化导入苏云金芽孢杆菌体内,使后获得了稳定产生黑色素的能力。并在转化子细胞内检测到与供体菌相同的质粒。SDS-PAGE显示该转化子体内额外表达了一分子量约为18kD的蛋白,该蛋白很可能就是转化子表达的酪氨酸酶。经测定,转化子抗辐射作用明显增强,有效杀虫时间显延长。     

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的检测及保守性分析

Vip3A蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养期分泌的一类新型杀虫蛋白。用PCR方法从114个Bl菌株和41个Bl标准菌株中筛选到39株即约25％的菌株含有vip3A基因。利用所制备的Vip3A蛋白的多克隆抗体对以上含有vip3A基因的Bt菌株进行Western印迹分析,发现多数PCR反应为阳性的菌株都产生89kD大小的蛋白,其中有4株没有Vip3A蛋白的表达。从以上菌株中挑选2个对夜蛾科害虫具有较高和较低毒力的菌株,即S101和6ll,并分别进行vip3A基因的克隆和测序,再与GenBank上所登录的其它6个全长vip3A基因和2个已报道的但未登录GenBank的vip3A基因进行核苷酸和氨基酸序列比较,结果表明,vip3A是一个极其保守的基因。将以上所克隆的2个却3A基因即vip3A—S101和vip3A-611分别插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP-S101和pOTP-6ll,转化到大肠杆菌M15,经lmmol／L IPTG诱导后均表达89kD大小的Vip3A蛋白。蛋白可溶性试验表明,Vip3A-S101和Vip3A-611分别有48％和35％的蛋白是可溶的。将Vip3A-S101和Vip3A-6ll蛋白和已报道的Vip3A—S184蛋白对初孵斜纹夜蛾(Spodoptera litura)幼虫进行生物测定,结果表明,3个Vip3A蛋白对斜纹夜蛾幼虫毒力没有显著性差异,这说明了Vip3A个别氨基酸的变化对蛋白的杀虫活性没有影响。     

球形芽孢杆菌C3-41二元毒素基因在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中的克隆和表达

球形芽孢杆菌C3-41是我国分离的一株对蚊幼虫有毒杀作用的高毒力菌株,对库蚊、按蚊幼虫的毒性高于2362菌株,Southern杂交证明C\-3\|41总DNA中35Kb HindIII片段上带有419和514kD二元毒素基因,该片段由3479个核苷酸组成,核苷酸序列同2362菌株的二元毒素基因序列完全相同。含二元毒素基因的重组质粒pCW\|1和pCW\|2能在大肠杆菌中表达产生二元毒蛋白,但表达量低,重组子杀蚊毒性低。无晶体型苏云金芽孢杆菌以色列亚种重组子在其芽孢形成中能产生以晶体形式存在的二元毒素蛋白,其全发酵液和纯化晶体蛋白的杀蚊活性与C\-3\|41相近。     

苏云金芽胞杆菌cryⅡ基因的克隆和表达

分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillus-thuringiensis)YBT-791对鳞翅目小菜蛾(Plutellaxylostella)有毒力,将其质粒DNA提纯,经HindⅢ酶切后与杀虫晶体蛋白cryⅡ基因探针杂交,显示出分子量分别为5kb和9．4kb两条DNA阳性片段。把5kb的DNA阳性片段克隆到pUCl8的HindⅢ位点上并转化大肠杆菌TGl,经酶切和杂交检测,证明斑点杂交阳性克隆子中含有5kb的cryI片段。把这个含cryⅡ基因的5kbHindⅢ片段进行亚克隆,将4kb的BamHI－Pstl酶切片段插入穿梭载体pXl61中,并用电脉冲法克隆于苏云金杆菌不产伴胞晶体的突变株中,得到产生单一cry Ⅱ基因编码的杀虫晶体蛋白的克隆菌株M一5。经电镜观察,该克隆菌株能形成出发菌YBT－791多种形态伴胞晶体中的一种方形伴胞晶体;经免疫双扩试验,它只能与Cry Ⅱ晶体蛋白抗血清形成沉淀线;经SDS—PAGE电泳,克隆菌的伴胞晶体只含有一种65kDa的晶体蛋白。生物测定结果表明它既对鳞翅目小菜蛾(Piutella xylostella)有毒性,又对双翅目致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)有毒性。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种cyt1 Aa基因在球形芽孢杆菌中表达

将编码cyt1Aa基因和 p2 0蛋白基因的DNA片段分别克隆连接于两个不同的穿梭载体 pBU 4和pMK 3上 ,构建了重组质粒 pBA 30和 pMA 6,通过电击法 ,将重组质粒分别转化 B .s野生株2 2 97,获得了转化菌株Bs 97 30和Bs 97 6。SDS PAGE和Westernblot分析证实了cyt1Aa基因在转化菌株Bs 97 30中获得了表达 ,而在转化菌株Bs 97 6中未检测到cyt1Aa基因表达的蛋白。转化菌株Bs 97 30中 ,cyt1Aa基因与B .s二元毒素基因同步于菌体生长的对数期起始表达 ,并持续至芽孢形成。生测结果表明 ,转化菌株Bs 97 30中cyt1Aa基因的表达并未明显增强其对敏感和抗性致倦库蚊幼虫的毒力。其原因可能是弱毒性的 cyt1Aa蛋白在转化菌株中的表达量不高。     

苏云金芽孢杆菌Rpp02菌株cry1Ac20基因的克隆及表达

Rpp02菌株是本实验室分离的一株对鳞翅目等多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种 (Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni), 经PCR检测,它含有cry1Ac基因。对其基因组DNA进行PCR扩增,得到大约4 kb的产物。测序结果表明,该片段含有一个较大的ORF框,基因编码区为3 534 bp,编码1 177个氨基酸,分子量为133.144 kD,pI 4.952, 为弱酸性蛋白质,亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）3种氨基酸含量最高,分别为8.0%、7.8%、7.7%。该基因序列与cry1Ac序列同源性达到99%,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ac20。生物测定表明,该基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物具有较强的杀虫效果,试喂菜青虫48 h后,校正死亡率为88.78%。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种130kDa杀蚊蛋白基因在枯草芽孢杆菌中的表达

本文将苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis)130kDa杀蚊蛋白基因亚克隆到pNQ1 22载体上,通过枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)原生质体转化,得到Kmt Cm2的正反向克隆子(pFZl和pFZ2)。 Western—blotting免疫杂交证明130kDa杀蚊蛋白基因在枯草芽孢杆菌中表达了具有免疫活性的130kDa杀蚊蛋白。 所表达的杀蚊蛋白在实验中具有杀蚊活性。     

球形芽孢杆菌C3—41二元毒素基因在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中的？…

球形芽孢杆菌Ｃ３－４１是我国分离的一株对蚊幼虫有毒杀作用的高毒力菌株,对库蚊、按蚊幼虫的毒性高于２３６２菌株,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明Ｃ３－４１总ＤＮＡ中３．５ＫｂＨｉｎｄＩＩＩ片段上带有４１．９和５１．４ｋＤ二元毒素基因。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种130kd杀蚊蛋白基因的克隆与鉴定

以人工合成的130kd杀虫蛋白基因的18—base序列为探针,通过SoutherD分子杂交,验证了在Bacillus thuringiensis var.israelensis 4Q5菌株75Md质粒上含有130kd杀蚊蛋白基因,并且证明了提纯的晶体蛋白具有杀蚊幼虫活性。对该质粒进行HindIII完全酶切,以pUCl8为载体,以E．Coli TG1为受体,得到四个与探针有强杂交信号的阳性克隆,其中两个(pFH2,PFH4)含有5．2kb HindIII插入片段,包含第一类130kd杀蚊蛋白基因;另两个(pFHI,pFH3)含有2．3kb HindIII插入片段,包含第二类13 0kd杀蚊蛋白基因的3'部分。pFH2和pFH4中,第一类130kd杀蚊基因的插入方位不同。     

苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞及转基因…

以葡萄的胚性愈伤组织作为农杆菌介导,Ｔｉ质粒转化材料,利用共培养法将苏云杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞,通过胚状体发生途径再生转基因植株。实验发现：８００μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮诱导处理农杆菌和葡萄愈伤组织后可转将化效率提高５０倍。