人IL-3基因cDNA的克隆及其在造血干细胞的表达

目的 克隆人IL-3基因cDNA并转导人脐带血造血干细胞，然后研究这一细胞因子的表达情况，从而为脐血扩增及移植打下理论基础。方法 从人外周血单个核细胞中提取IL-3mRNA，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增IL-3 cDNA，通过T／A克隆法，构建真核表达型载体pcDNA3／IL-3。将pcDNA3／IL-3质粒转导脐血造血干细胞，并于1—7d检测IL-3表达情况。结果 pcDNA3／IL-3重组质粒的目的基因与ID3基因序列相同；pcDNA3／IL-3转导脐血造血干细胞后，经检测能够有效表达。结论 成功克隆了hIL-3并构建重组质粒pcDNA3／IL-3，该质粒转导脐血造血干细胞后，能在短期内有效表达。     

野生型和突变型人白介素13哺乳细胞表达质粒的构建

目的:构建野生型及突变型人IL-13(hIL-13)哺乳细胞表达质粒。方法:采用融合PCR扩增人生长激素(hGH)-hIL13融合蛋白编码序列。PCR产物和pcDNA3.1表达载体经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切处理后,将PCR产物定向插入pcDNA3.1真核表达载体中,构建质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g。将其转化到DH5α感受态细胞内进行扩增,阳性克隆鉴定,质粒抽提,进行测序验证。结果:重组质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g经测序验证,hGH-hIL13融合蛋白编码序列与实验设计一致,且已与pcDNA3.1(+)真核表达载体正确重组。结论:成功构建了哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g,为后续野生型及突变型hIL-13哺乳细胞的重组表达奠定了基础。     

谷氨酸脱羧酶65片段与IL－10双基因真核表达载体的构建与鉴定

 目的 优化以往构建的以预防 1 型糖尿病为目的的全长谷氨酸脱羧酶（GAD）65 DNA疫苗，尝试构建GAD 65片段与IL-10双基因真核表达载体。方法 从GAD65质粒中扩增出GAD190-315片段和GAD490-570片段的cDNA，以overlap PCR法将之分别与hIL-2信号肽cDNA拼接，得到SGAD190-315、SGAD490-570融合基因。以p43.2-mIL-10质粒为模板，用PCR方法扩增出IL-10基因。将SGAD190-315、SGAD490-570融合基因分别与IL-10基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCE4.1中，构建出2种双基因重组真核表达载体pBud-SGAD190-315/IL-10和pBud-SGAD490-570/IL-10。2种重组真核表达载体经测序鉴定正确后，用脂质体介导的方法转染COS-7细胞，转染后48和72 h以蛋白质印迹法检测细胞裂解产物及上清液中SGAD190-315和SGAD490-570融合基因的表达，ELISA方法检测细胞上清液中IL-10的表达。结果　核酸序列测定表明克隆的SGAD190-315、SGAD490-570融合基因和IL-10基因序列与报告序列一致。蛋白质印迹法和ELISA方法均检测到SGAD190-315/IL-10和SGAD490-570/IL-10重组真核表达载体在COS-7细胞中的表达。结论　成功构建了2种GAD65片段与IL-10双基因真核表达载体，为1型糖尿病的基因疫苗预防研究提供了实验基础。     

SARS冠状病毒spike基因DNA疫苗的初步研究

目的　构建SARS病毒spike基因片段真核表达质粒DNA疫苗;检测spike基因片段的免疫原性;筛选SARS病毒疫苗构建的理想靶抗原。方法　采用RT PCR从SARS冠状病毒北京0 1(BJ0 1)株cDNA获取了spike基因cDNA的全长D12、编码N末端氨基酸的cDNA片段D14和编码C末端氨基酸的cDNA片段D2 3;构建重组真核表达质粒pcDNA3 /D12、pcDNA3 D14、pcDNA3 D2 /3;用3种重组质粒和pcDNA3空质粒载体(对照)DNA皮下注射免疫Wistar大鼠;ELISA检测免疫后大鼠血清S蛋白特异性抗体IgG的产生;同位素51 Cr实验检测特异性CTL应答;ELISPOT检测单细胞水平IFN -γ分泌。结果　pcDNA3 /D2 3疫苗免疫组大鼠血清有S蛋白阳性抗体IgG产生、抗体滴度>10 0 0 ;脾淋巴细胞可诱导特异的CTL应答和IFN γ分泌,pcDNA3 /D2 3疫苗组与其它组之间统计分析P <0 .0 5。结论SARS冠状病毒S蛋白的C末端具有较强的免疫原性,是疫苗构建的理想候选靶抗原,本研究结果为SARS病毒的疫苗研究提供了资料。     

小鼠白细胞介素21 cDNA的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆小鼠自细胞介素2l(IL-21)基因，构建真核表达质粒，用以进行肿瘤的基因治疗。方法：用RT-PCR法。从ConA活化的小鼠T细胞中扩增IL-21 cDNA。克隆人哺乳动物细胞高效表达质粒pcDNA3．1中，构建重组mIL-21真核表达质粒。重组体用载体上的通用引物和PCR下游引物为测序引物，鉴定克隆的正确性。将已鉴定的重组质粒用脂质体法转染Sp2／0细胞，用RT-PCR法鉴定转染细胞中IL-21基因的表达，用MTT比色法检测表达的mIL-21诱导的NK细胞杀伤活性的增强。结果：正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，并在转染的细胞中检测出IL-2l的表达，表达的mIL-21可在体外增强NK细胞的杀伤活性：结论：成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，为进一步在肿瘤动物模型中进行IL-21基因治疗及疗效观察奠定了基础.     

人IL-8正义和反义真核表达载体的构建与表达

目的:构建人IL- 8正义和反义真核表达载体.方法:RT-PCR扩增正义和反义IL- 8基因片段后, 将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+), 通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定后, 采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞中, 并用RT-PCR和ELISA法检测细胞转染后IL- 8的表达水平.结果:经验证, 重组人IL- 8正义/反义真核表达载体构建正确.pcDNA3.1(+)-ssIL- 8转染A2780细胞后, 其IL- 8 mRNA及蛋白表达水平均显著增加;而pcDNA3.1(+)-asIL- 8转染SKOV3细胞后, 其IL- 8分泌水平降低.结论:成功构建了人IL- 8正义/反义真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ssIL- 8/pcDNA3.1(+)-asIL- 8, 为后续研究IL- 8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础.     

人IL-18结合蛋白A在CHO细胞中表达的研究

目的 克隆人IL－18结合蛋白A（hIL-18BPa)的cDNA，构建真核表达载体及其在CHO细胞中的表达。方法 采用RT－PCR，自人白血病血细胞株Jurkat中获得hIL-18BPa的cDNA。将其克隆至T-vector中，经测序确证后，将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3．1中。以脂质体介导法，将其转染CHO细胞，用G418筛选抗性克隆，ELISA法测定其生物学活性。结果 获得的IL-18BPa的cDNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hIL-18BPa插入载体pcDNA3．1后，成功地构建稳定表达的载体。转染CHO细胞2后，获得可稳定表达hIL-18BPa的基因工程细胞株。经纯化后，证明具有良好的生物学活性。结论 成功地克隆hIL-18BPa基因，并实现了在CHO细胞中的稳定表达，为研究其生物学活性奠定了基础。     

IL-12双亚基共表达载体的构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达

 目的 构建人 IL-12（hIL-12）p40 和 p35 双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）。方法 根据 hIL-12 p40 和 p35 亚基全长 cDNA 序列分别设计合成引物行 PCR 扩增，将扩增所得 p40 和 p35 片段采用 overlap PCR 法拼接，获得的 rhIL-12 融合基因与 pGEM-T Easy 质粒连接，将鉴定正确的 pGEM-T/rhIL-12 重组质粒克隆至 pcDNA3.1（+）真核表达质粒中，构建 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 真核表达载体，并进行测序鉴定。将鉴定正确的 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 经脂质体介导转染 hMSC，同时以转染 pcDNA3.1（+）空质粒作为对照组，在倒置显微镜下观察细胞生长形态；在转染后第 4 天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中 rhIL-12 融合基因的表达；另分别在转染后第 2、4、6、8、10、12、14 天，采用 ELISA 方法检测细胞培养上清液中 rhIL-12 融合基因的表达水平。 结果 PCR 扩增结果显示特异性扩增出 p40（1000 bp）、p35（600 bp）、rhIL-12（1600 bp）片段，均与预期 DNA 表达片段大小一致。pcDNA3.1（+）/rhIL-12 测序显示克隆的 rhIL-12 基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察，可见转染 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 的 hMSC 生长形态和生长速度与对照组 hMSC 相比均无明显差异。蛋白质印迹和 ELISA 检测显示，转染 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 的 hMSC 培养上清液中可见 rhIL-12 融合蛋白的持续表达；而对照组中均未检测到 rhIL-12 融合蛋白表达。 结论 成功构建了 hIL-12 p40 和 p35 双亚基真核共表达载体 pcDNA3.1（+）/rhIL-12，为利用 hIL-12 进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。     

GRIM-19基因的克隆及其对小鼠前列腺癌细胞株的促凋亡作用

目的构建GRIM-19基因真核表达质粒,探讨GRIM-19基因转染对小鼠前列腺癌rm-1细胞的促凋亡作用。方法采用RT-PCR及重组DNA技术构建pcDNA-GRIM-19真核表达质粒,体外进行基因转染。形态学观察,DNAladder检测转染后rm-1细胞凋亡,RT-PCR方法检测rm-1细胞caspase-3活性。结果扩增出GRIM-19cDNA全长,测序结果与GenBank记载基本一致。转染rm-1细胞48h后证明其能在真核细胞表达,形态学及共聚焦显微镜观察到pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒组出现明显的细胞凋亡,并出现典型的DNAladder。转染pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒组caspase-3表达强度较对照组及空质粒组明显上调(P<0.05)。结论成功克隆并构建鼠GRIM-19基因真核表达载体pcDNA3.1-GRIM-19,该载体可诱导鼠rm-1细胞凋亡。其凋亡机制与caspase-3酶活性有关。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。 目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。 方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA 进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。 结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

HBsAg真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建HBsAg真核表达质粒。方法 用PCR的方法从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因，并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3．1( )，构建成重组质粒pcDNA3.1—S；然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定结果经酶切和DNA序列测定鉴定，证实重组质粒构建正确。结论 真核表达质粒pcDNA3．1—S构建成功。     

IL-12双亚基共表达载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人IL-12（hIL-12）p40和p35双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）。方法根据hIL-12p40和p35亚基全长cDNA序列分别设计合成引物行PCR扩增，将扩增所得p40和p35片段采用overlap PCR法拼接，获得的rhIL-12融合基因与pGEM—TEasy质粒连接，将鉴定正确的pGEM—T／rhIL-12重组质粒克隆至pcDNA3．1（＋）真核表达质粒中，构建pcDNA3．1（＋）／rhIL-12真核表达载体，并进行测序鉴定。将鉴定正确的pcDNA3．1（＋）／rhIL-12经脂质体介导转染hMSC，同时以转染pcDNA3．1（＋）空质粒作为对照组，在倒置显微镜下观察细胞生长形态；在转染后第4天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达；另分别在转染后第2、4、6、8、10、12、14天，采用ELISA方法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达水平。结果PCR扩增结果显示特异性扩增出p40（1000bp）、p35（600bp）、rhIL-12（1600bp）片段，均与预期DNA表达片段大小一致。pcDNA3．1（＋）／rhIL-12测序显示克隆的rhlL-12基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察，可见转染pcDNA3．1（＋）／rhIL-12的hMSC生长形态和生长速度与对照组hMSC相比均无明显差异。蛋白质印迹和ELISA检测显示，转染pcDNA3．1（＋）／rhIL-12的hMSC培养上清液中可见rhIL-12融合蛋白的持续表达；而对照组中均未检测到rhIL-12融合蛋白表达。结论成功构建了hIL-12p40和p35双亚基真核共表达载体pcDNA3．1（＋）／rhIL-12，为利用hIL-12进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。     

pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础     

HCV非结构蛋白3真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3的构建

目的：构建HCV NS3基因真核表达载体，为进一步研究和解析HCV NS3基因诱发不死化人肝细胞癌化的机制准备了条件。方法：将含HCV全长基因的pBRTM/HCV1-3011质粒转化感受态菌JM109并扩增；提取pBRTM/HCV1-3011质粒；从pBRTM/HCV1-3011质粒中PCR扩增出HCV NS3片段；并将其插入到克隆载体pMD18-T中，再与表达载体pcDNA3.1(-)重组，以得到重组的真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3；最后限制性酶切鉴定HCV NS3表达载体。结果：从pBRTM/HCV1-3011质粒中扩增出的HCV NS3片段大小正确，经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列；凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pcDNA3.1/NS3内。结论：成功地构建了HCV NS3基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3。     

鸡白细胞介素-2基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建鸡白细胞介素2(IL-2)真核重组表达质粒,体外鉴定其能否表达。方法:将鸡IL-2cDNA(RT-PCR法获得),克隆入真核高效表达质粒pcDNA3.1( )中,构建pcDNA-IL-2重组表达质粒。PCR和双酶切的方法鉴定克隆的正确性。然后构建pcDNA IL GFP重组表达质粒(即GFP基因与IL2的一段上游基因融合表达),PCR方法鉴定克隆的正确性。脂质体法转染COS1细胞,荧光显微镜下观察荧光。结果:正确构建了真核重组表达质粒pcDNA-IL2和pcDNA-IL-GFP。荧光显微镜下可观察到很强的绿色荧光。结论:鸡IL-2克隆和表达成功。为下一步用重组质粒pcDNA-IL2免疫BALB/c小鼠,研制鸡IL-2单克隆抗体奠定了基础。     

人白细胞介素32基因的克隆表达及其生物学活性的研究

目的:克隆人白细胞介素32(hIL-32)基因,构建高效稳定的hIL-32大肠杆菌表达菌株,并对纯化的目的蛋白进行生物学活性的初步测定.方法:将人外周血单个核细胞( PBMC)经刀豆素A( Con A)刺激60 h后提取细胞的总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应( RT-PCR)从刺激的PBMC中扩增出hIL-32的基因,通过基因克隆技术,构建hIL-32在pET-30 a(+)中的重组质粒pET30a-hIL32,用IPTG进行诱导,得到hIL-32的原核表达蛋白;采用Ni2+ -NTA亲和层析方法纯化目的蛋白;应用ELISA方法检测纯化蛋白诱导人PBMC产生IL-6的情况.结果:序列测定表明,hIL-32基因核苷酸长度为567 bp,编码189个氨基酸.重组质粒pET30 -hIL32转化至大肠杆菌BL21( DE3),重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量(Mr)为28 000的重组蛋白,表达的重组蛋白IL-32可促进人PBMC产生IL-6,浓度达到(127±4.8)ng/L,而对照组IL-6的浓度仅为(25±2.3)ng/L.结论:成功克隆了hIL-32基因并构建了高效且稳定表达hIL-32基因的大肠杆菌菌株,且表达的目的蛋白能诱导IL-6细胞因子的产生.     

抗菌肽Defensin真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的 构建家蝇幼虫抗菌肽的真核表达载体,并检测它在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达情况.方法 以pUCm-T/Defensin为模板,设计带His标签特异引物,扩增C-末端融合6×His标签的Defensin基因的cDNA全长编码区序列,将其克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体.经酶切及测序鉴定后,以阳离子脂质体...     

人神经营养素-3基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建含有人NT-3基因真核表达载体pcDNA3．1-NT-3。方法：采用PCR技术，扩增编码神经营养素-3基因，克隆到PMD18-T载体上，再亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1的Hind Ⅲ和BamHI位点。结果：重组真核表达载体pcDNA3．1-NT-3经酶切鉴定证明NT-3基因正向插入真核表达载体中，碱基序列的测定证明重组质粒中含有人的NT-3基因序列。结论：构建的真核表达载体携有人NT-3cDNA序列，并且含有巨细胞病毒强启动子、ploy(A)加尾信号和neo标志基因，可能具有转染多种哺乳类细胞通用性，可用于NT-3基因的真核表达及基因治疗的研究。     

过表达HSPC238对Bel7402细胞周期的影响

目的:构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,研究过表达HSPC238基因对人肝癌细胞株Bel7402细胞周期的影响。方法:采用PCR法从pET28b/HSPC238重组质粒中克隆得到HSPC238 cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染Bel7402细胞,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株。用RT-PCR和Western blot技术分别检测HSPC238基因在Bel7402中的mRNA和蛋白水平的表达。随后用饥饿法使各组细胞周期同步化,再用流式细胞仪分析HSPC238过表达对细胞周期的影响。结果:pcDNA3.1(-)/HSPC238经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因HSPC238的序列完全正确;RT-PCR和Western blot检测显示,与转染pcDNA3.1(-)组和未转染组相比较,转染pcDNA3.1(-)/HSPC238组的mRNA和蛋白表达水平均明显增高,但前两者间没有差异。用饥饿法同步化后,流式细胞仪检测显示过表达HSPC238可延缓Bel7402细胞株从G1期进入S期。结论:成功构建了pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,并在Bel7402中表达。初步发现过表达HSPC238可延缓肝癌细胞的细胞周期,为更进一步研究HSPC238蛋白的功能奠定了基础。     

小鼠γ-干扰素真核表达质粒的构建和鉴定

目的克隆小鼠γ-干扰素(γ-IFN)基因,构建并鉴定小鼠γ-干扰素真核表达质粒.方法从BALB/c小鼠脾脏提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出小鼠γ-干扰素基因, 分别用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切扩增片段和pcDNA3.1(-),定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建成真核表达质粒pcDNA3.1(-)γ-IFN.转化产物通过PCR扩增筛选,双酶切鉴定;阳性克隆进行序列分析.结果 RT-PCR产物电泳可见一约500bp大小目的片段.PCR和双酶切电泳结果均证实已插入约500bp的γ-IFN基因片段;阳性克隆测序结果表明克隆的小鼠γ-干扰素基因完全正确.结论成功构建了小鼠γ-干扰素真核表达质粒,为进一步气道内实施哮喘小鼠基因治疗打下了坚实基础.