地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及原核表达

地衣芽孢杆菌(Bacillus Lichenifarmis)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α-淀粉酶(α-amylase)的优良菌株．本实验在提取地衣芽孢杆菌完整的基因组DNA序列的基础上，通过PCR方法克隆了耐高温淀粉酶的结构基因全长1449bp，与pUCm-T载体连接转化入宿主菌DH5α中，经过酶切鉴定筛选出阳性的克隆菌，再提取质粒与表达载体pET-28a( )酶切后连接转化入宿主菌DE3中，其阳性克隆在37℃1．0mmol/L IPTG诱导下，α-淀粉酶的基因得到了较好的表达．表达产物经SDS—PAGE鉴定，确定表达的蛋白大小为58000 Dal左右，与理论推导的分子量相一致；并初步对酶及活性及酶活最适温度和pH进行了研究。     

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。     

解淀粉芽孢杆菌中性植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用PCR法从解淀粉芽孢杆菌BA11中克隆到一个中性植酸酶phyc基因,将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上并电转化至宿主细胞GS115后进行诱导表达。SDS-PAGE试验表明:该重组中性植酸酶在毕赤酵母宿主细胞中实现了高效分泌性表达。植酸酶活性测定结果显示阳性克隆子在诱导72h酶活性达到最高值,活性为2330U/L。     

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

根据已知的枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得了长约1.1kb不含有信号肽序列的植酸酶phyC基因表达片段.经T载体克隆及序列测定后,构建毕赤巴斯德表达载体pPIC3.5K-phyC,并电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子,并进行了诱导表达.SDS-PAGE分析表明:表达产物分子量为42.01KD,表达量占细胞可溶性总蛋白的24%,并具有植酸酶的生物学活性.酶学性质分析结果显示:胞内表达的植酸酶酶促反应最适pH值为7.5;最适反应温度为70℃;经90℃处理10min,残留酶活性42% 均优于出发菌株天然植酸酶的相应性质.     

地衣芽孢杆菌营养要求的研究

本文报道了地衣芽孢杆菌的营养要求,结果表明,以葡萄糖为碳源,多种氨基酸为氮源,地衣芽孢杆菌的最佳C/N为4～4．51。满足该菌对维生素H和必须氨基酸的需要以及主要无机盐的需要时,其菌数最高为(3．55～6．7)×107/ml,可使菌数是对照的2．1～3．5倍。     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.     

地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的热稳定性研究

本文研究了环境因子对液体碱性蛋白酶２７０９＾＃热稳定性的影响，多种氨基酸、低浓度的各种离子以及羟基化合物等均能提高２７０９＾＃的热稳定性，氨基酸中以丝氨酸效果最好，Ｃａ＾２＋能极大的提高酶热稳定性，多糖类对酶的热稳定性效果不明显，但与适量合用，可显著提高酶的热稳定性。     

不同基质对地衣芽孢杆菌生长曲线的影响

采用不同培养基研究了地衣芽孢杆菌的生长曲线。在０．３％￣０．５％ＶＨ培养基中,延迟期最短,对数期提前２￣４ｈ。为缩短生产周期、提高产量、提供了科学依据。     

基于gyrB基因的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立

根据6株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的gyrB基因序列设计了1对特异性引物F1和R1,扩增产物大小为303 bp,以此引物对为基础,成功建立了灵敏度为1×10-3mg·L-1(约为200个细菌/反应)的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法 .该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,它为今后从微生物群落结构复杂的环境中分离地衣芽孢杆菌奠定了良好的基础.     

枯草芽孢杆菌ATCC21216腺苷磷酸化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增枯草芽孢杆菌ATCC21216(His-)编码腺苷磷酸化酶的基因deoD(0.7 kb),测序表明与枯草芽孢杆菌168的deoD同源性为98.7%。将此基因插入质粒pET28a( )(5.3 kb)中,重组质粒pETdeoD在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达,表达量占总蛋白的27%。以HPLC方法测定腺苷磷酸化酶的比酶活为每毫克蛋白0.151 U。     

土曲霉CCTCCAF93044植酸酶基因的克隆及序列分析

参考Hartingsvedt已发表的NRRL3135植酸酶（phyA）基因序列,设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以土曲霉CCTCCAF93044总DNA为模板,扩增出了不包括假定的信号肽序列的phyA基因,并将其克隆到PMD18－T载体上,测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序列,该基因全长为1433bp,与已发表的NRRL3135的phyA基因的同源性为97％,编码一个含458个氨基物的蛋白质。     

黑曲霉F246的phyA基因克隆及其新型表达载体构建

利用PCR法直接从自行筛选、鉴定的黑曲霉F246中扩增出phyA基因,再将PCR产物重组于乳酸菌表达载体pMG36e,构建phyA基因的新型表达载体pMG36e-phyA.以黑曲霉F246基因组为模板,对phyA基因的成熟肽(1 347 bp)进行PCR扩增.再将PCR产物克隆入pMD18T质粒,经DNA测序和氨基酸分析、鉴定正确后,亚克隆入乳酸菌表达质粒pMG36e,构建工程菌Lactobacillus MG1363-pMG36e-phyA.重组乳酸菌表达载体pMG36e-phyA的构建,可望获得大量、高活性植酸酶,为研制多功能微生态制剂奠定基础.     

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。     

纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究

以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增了纳豆激酶基因（natto kinase gene）中编码前肽、成熟肽的核苷酸序列（pro-NK），构建大肠杆菌表达质粒pTYB102，转化大肠杆菌ER2566。在IPTG诱导下，分别在15℃（14h）、30℃（3h）、37℃（2h）条件下培养，pTYB102均能表达出有活性的纳豆激酶。实验证实纳豆激酶基因得到活性表达需要Pro序列。SDS－PAGE表明，15℃和30℃和37℃培养表达的杂蛋白更少。薄层扫描测定表达的纳豆激酶占菌体总蛋白30％以上。     

粟酒裂殖酵母麦芽糖酶基因的克隆及在大肠杆菌内的表达

利用PCR的方法,以粟酒裂殖酵母菌的染色体DNA为模板,扩增得到粟酒裂殖酵母的结构基因,其开放阅读框1740 bp的序列,可以编码579氨基酸,分子量为67.7 kD.利用NCBI对它的蛋白序列进行比对,发现这个蛋白序列与Aspergillus oryza、Candida albicans、Hansenula polymorpha、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces pastorianus的麦芽糖酶相比分别具有40.6%、41.6%、37.9%、34.7%、34.5%的相似性.而与粟酒裂殖酵母的α-葡萄糖苷酶具有99.8%的相似性,由此可以得出克隆得到的结构基因应该是粟酒裂殖酵母的麦芽糖酶结构基因.将克隆的粟酒裂殖酵母的麦芽糖酶基因克隆到pQE30表达载体中在大肠杆菌中进行诱导表达,然后测定其麦芽糖酶的活力,其酶的比活力是野生菌株的21倍,诱导条件下麦芽糖酶的比活力是非诱导条件下的10倍.     

葛仙米中SOD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术从葛仙米（Nostoc sphaeroides）总DNA中克隆了一段基因序列,该序列与基因库中已公布的编码普通念珠藻（Nostoc commnue）超氧化物歧化酶的氨基酸序列同源性为98％,将该基因插入含T7启动子的质粒pET-32a（＋）中构建表达质粒pET-sod,然后将该表达质粒转入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,表达菌株用lmmol／L1PTG诱导表达数小时后,产生较多重组的蛋白,且该蛋白以可溶性蛋白形式存在,SDS-PAGE分析表明：在相对分子量约为22kd的位置有一条明显蛋白质带,将诱导表达后的蛋白通过亲和层析的方法进行蛋白纯化;NBT光还原法测定表达产物的比活力,每毫克纯化蛋白约为2550U。     

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆、表达及杀虫活性分析

选择本实验室分离的野生型苏云金芽孢杆菌菌株WY-197为出发菌株，用全长PCR方法从此菌株中克隆了2．3kb大小的vip3A基因,DNA序列比较发现所克隆的基因vip3A-197与已知的营养期杀虫蛋白基因存在很高的同源性．将基因vip3A-197亚克隆至原核表达载体pET33b构建了原核表达质粒pEVip，转化大肠杆菌BL21，转化子经IPTG诱导后可表达88kD大小的蛋白．该蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)棉铃虫(Helicoverpa armigera)的初孵幼虫进行生物测定，结果表明，营养期杀虫蛋白vip3A-197对夜蛾科害虫具有一定的杀虫活性。     

Cloning and Characterization of Gene Promoters from Bacillus pumilus

DNA fragments obtained from Sau3AI partially digested total DNA of Bacillus pumilus UN31-C-42 are first inserted into BamHI site of pSUPV4, a promoter-probe vector. The recombinant DNA molecules are transformed into Escherichia coli cells and eight-three Kanr clones (named pSUBp1-pSUBp83) are obtained. The inserted fragments in pSUBp53, pSUBp57, pSUBp21, which showed high level of kanamycin- resistance, are sequenced and analyzed, respectively. These fragments contain some con-served sequences of prokaryotic gene promoters, such as TATAAT and TIGACA box. The promoter frag-ment Bp53 could efficiently promote the alkaline protease gene of B. pumilus expression not only in E.coli but also in B. subtilis cells.     

Modification of the rib operon derived from Bacillus subtilis and its expression in Escherichia coli

A riboflavin operon （rib operon） derived from Bacillus subtilis 368 was modified on structure and the resulting operons were expressed in various strains of Escherichia coli. The results showed that the optimization of the rib operon and the host strain used for expression are two main factors affecting the riboflavin production. Replacing the promoterl and rfn box of the rib operon with a strong constructive promoter spol drastically increased the expression of the rib genes. When E. coli JM109 was used as the host strain, the highest riboflavin production reached 95.3μg/mL （about eight times higher than that of the unmodified r/b operon）. In addition, when tetracycline （20 μg/mL） was used as the selective pressure, compared with the ampicillin resistant transformants, a higher riboflavin yield was obtained in tetracycline resistant host strain.