羊软骨细胞在生物反应器中的培养和扩增

[目的]探索在旋转生物反应器内，应用微载体技术快速扩增分化良好的羊软骨细胞的方法。[方法]将培养的羊软骨细胞应用Cytodex-3微载体在旋转生物反应器（RCSS）内，进行动态培养，应用倒置显微镜对微载体表面的软骨细胞进行动态观察，并对收获的软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原的细胞免疫化学染色分析。[结果]关节软骨细胞于1d内贴附于Cytodex-3微载体表面，细胞初期为圆球形、半球形凸起，逐渐向周围伸展，随时间的延长，贴附于微载体的细胞逐渐增多，到培养后期，细胞密度可达最初接种的15～17倍，在微载体上收获的软骨细胞经Ⅰ型胶原的免疫细胞化学染色呈阴性，Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。[结论]利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增羊软骨细胞，可为构建组织工程化人工软骨提供大量活性、分化良好的软骨细胞。     

血清浓度对脂肪成体干细胞向软骨细胞分化的影响

[目的]比较不同浓度的血清,在转化生长因子-β1(TGF-β1)存在的条件下,对脂肪成体干细胞(ad-ipose-derived adult stem cells,ADASCs)向软骨细胞分化的影响,探讨较为合适的血清浓度。[方法]取成年新西兰兔颈部脂肪组织,剪碎后通过Ⅰ型胶原酶消化,得到脂肪成体干细胞;稳定传代后,分别用含1?S和10?S的软骨诱导液干预ADASCs 2周,采用MTT检测方法对细胞增殖活性进行比较,应用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色进行软骨细胞鉴定,利用Leica病理图像软件分析两组间Ⅱ型胶原免疫组化染色后的灰度,比较两组细胞分化的效果。[结果]MTT检测显示10?S组细胞增殖活性高于1?S组(P<0.05),两组细胞的甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性,并以10?S组更为显著;灰度分析提示10?S组Ⅱ型胶原表达量高于1?S组(P<0.05)。[结论]体外研究表明,含10?S的软骨诱导液更有利于脂肪成体干细胞向软骨细胞方向增殖和分化,这将为作者采用这种新型的干细胞修复软骨缺损做好前期的准备。     

应用旋转生物反应器和微载体技术体外大规模扩增人骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞 (ＭＳＣｓ)因其自身所具有的特殊性而日益受到关注[1,2 ] 。我们采用微载体技术在旋转生物反应器内扩增人骨髓间充质干细胞。一、材料与方法1.试剂 :细胞培养基ＤＭＥＭ购自美国Ｇｉｂｃｏ公司 ;旋转生物反应器购自美国Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ公司。2 .ＭＳＣｓ的分离与培养 :骨髓来源于正常献髓者 ,将人骨髓经ＤＭＥＭ稀释后用一种细胞分离液Ｐｅｒｃｏｌｌ分离 ,Ｐｅｒｃｏｌｌ分离液的比重为 10 73 ｇ/Ｌ。分离后收获单个核细胞 ,ＤＭＥＭ洗 2次 ,接种于 2 4孔板内 ,浓度为 2 .0× 10 5个 /ｃｍ2 ,各孔内加入 10 %胎牛血清 …     

滚压载荷生物反应器促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究

[目的]观察滚压载荷生物反应器对BMSCs-琼脂糖复合体中BMSCs向软骨细胞诱导分化的作用。[方法]分离新西兰兔BMSCs,培养至第3代后与低熔点琼脂糖复合成凝胶块并在自制的模具中形成直径为4 mm、高4 mm的圆柱形胶块。将样本分为TGF-β1+力学组、TGF-β1组、力学组和对照组。在第7、14、21 d时去各组标本进行实时定量PCR、GAG含量检测以及组织学染色。[结果]TGF-β1+力学组II型胶原基因表达在第7、14、21 d 3个时间点随时间的推移逐渐增强,并在第21 d时显著增强。TGF-β1+力学组蛋白聚糖基因在第21 d时也较对照组显著增强并且高于其他两组。对照组的II型胶原和蛋白聚糖基因在3个时间点均见明显增强。TGF-β1+力学组GAG含量在3个时间点均明显升高(P<0.05)并且均高于其余三组。TGF-β1+力学组标本甲苯胺蓝染色较其余各组明显蓝染,并有软骨陷窝样结构。[结论]滚压载荷生物反应器可以有效促进BMSCs-琼脂糖复合体中BMSCs向软骨细胞诱导分化。在结合TGF-β1后这种促进作用更加明显。     

去分化关节软骨细胞生物反应器培养反分化的实验研究

目的 观察体外经传代培养去分化的成人关节软骨细胞，在生物反应器培养后生物学性状的变化，探索去分化软骨细胞反分化的手段，为软骨细胞移植修复关节软骨缺损建立合适的体外培养方法。方法 无菌条件下取成人关节软骨组织，Ⅱ型胶原酶消化法（0．2％，37C，3h）分离软骨细胞，分成两组：一组常规单层传代培养，另一组添加重组人的生长因子（1ng／ml转化生长因子β1＋5ng／ml成纤维细胞生长因子2）体外培养传代大量扩增后，无微载体生物反应器内培养3周。血小板计数器行细胞计数，计算各代细胞倍增时间；细胞爬片和石蜡、冰冻切片进行HE、蕃红O、阿利新蓝染色，Ⅰ、Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组织化学检测，观察细胞表型变化。结果 成人关节软骨细胞体外培养3代后迅速去分化，增殖缓慢。添加生长因子培养细胞去分化速度减缓；传10代，细胞扩增2000倍以上，部分去分化，但细胞扩增增殖能力仍很强；传20代软骨细胞表型基本丢失，但仍有增殖能力；置于生物反应器继续培养3周，细胞番红O染色强阳性、aggrecan和Ⅱ型胶原阳性，Ⅰ型胶原阴性，表型恢复良好。结论 软骨细胞在体外大量扩增后，在生物反应器培养，可恢复其表型，可望用于在体外培养时去分化软骨细胞的再分化。     

微载体技术体外扩增人骨髓间充质干细胞

目的 :建立一种快速、大量扩增人骨髓间充质干细胞 (hMSCs)的方法 ,以满足组织工程技术治疗大段骨缺损对细胞数量的需要。方法 :普通培养的第 3代人MSCs1× 10 7个及 0 5gCytodex3微载体 ,加入有 10 0ml培养基的搅拌生物反应器中培养 ,在前 6h ,每隔半小时以 40r/min的速度搅拌 2min ,以后连续搅拌。于培养的第 1、 3、 5、7、 9、 11d取样在相差显微镜下动态观察细胞生长情况 ,最后进行细胞表面生长因子的检测。结果 :接种 2 4h后 87%的MSCs细胞贴附于微载体并铺展 ,3d后生长加速 ,约 8～ 9d后细胞生长达最大值。最终细胞收获密度为接种时的约 15～ 2 0倍。流式细胞仪检测显示 ,所培养的MSCs均一的表达CD2 9和CD44 ,而CD3 4、CD45和HLA DR阴性。结论 :应用微载体技术可以大量、快速的培养扩增人骨髓间充质干细胞 ,细胞表面抗原特性不变 ,能够满足组织工程技术治疗大段骨缺损的需要     

旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞组织工程法修复兔下颌骨缺损

目的 探索旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞(BMSCs)组织工程法及BMSCs与PHB的复合支架修复兔下颌骨缺损的可行性.方法 体外分离纯化BMSCs,在旋转生物反应器内,利用微载体将其在短时间内快速扩增后接种于聚羟基丁酸酯(PHB)支架上,以修复兔的下颌骨缺损区,此为实验A组;以未对缺损区进行修复为对照B组;以单纯PHB修复缺损区为对照C组.分别于修复术后第3、8、14、42、84天处死每组兔2只,对缺损区行组织学检查、骨形态发生蛋白(BMP)免疫组织化学检查、X线摄片.结果 第84天,A组的大部分修复材料被骨性组织取代;B组的缺损区未修复;A组修复骨缺损的效率较C组高.结论 在旋转生物反应器内,应用微载体技术可以成功地进行BMSCs的培养和快速扩增,能满足骨组织工程的需要;PHB可以作为一种组织工程材料修复骨缺损.     

旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞组织工程法修复兔下颌骨缺损

目的探索旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞(BMSCs)组织工程法及BM-SCs与PHB的复合支架修复兔下颌骨缺损的可行性。方法体外分离纯化BMSCs,在旋转生物反应器内,利用微载体将其在短时间内快速扩增后接种于聚羟基丁酸酯(PHB)支架上,以修复兔的下颌骨缺损区,此为实验A组;以未对缺损区进行修复为对照B组;以单纯PHB修复缺损区为对照C组。分别于修复术后第3、8、14、42、84天处死每组兔2只,对缺损区行组织学检查、骨形态发生蛋白(BMP)免疫组织化学检查、X线摄片。结果第84天,A组的大部分修复材料被骨性组织取代;B组的缺损区未修复;A组修复骨缺损的效率较C组高。结论在旋转生物反应器内,应用微载体技术可以成功地进行BMSCs的培养和快速扩增,能满足骨组织工程的需要;PHB可以作为一种组织工程材料修复骨缺损。     

细胞共培养法诱导兔脂肪来源干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的利用软骨细胞与脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)共培养,观察ADSCs是否能向软骨细胞定向分化。方法 4月龄健康新西兰大白兔8只,雌雄不限,体重2.2～2.7 kg,分离、培养兔软骨细胞和ADSCs,取第2代细胞用于实验。将实验分为两组,实验组各取将1 mL细胞密度为2×104个/mL的软骨细胞和ADSCs分别接种至Transwell小室6孔板上、下层共同培养,对照组单独培养ADSCs。倒置相差显微镜观察两组ADSCs形态变化;培养14 d后行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,实时荧光定量PCR检测两组ADSCsⅡ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA表达。结果倒置相差显微镜观察示,随培养时间延长,实验组ADSCs逐渐变为软骨样细胞形态,呈圆形;对照组ADSCs仍以梭形为主,呈束状或漩涡状生长。培养14 d,实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均为阳性;对照组均为阴性;实时荧光定量PCR检测示,实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA相对表达量分别为1.43±0.07、2.13±0.08、1.08±0.08,显著高于对照组(0.04±0.03、0.13±0.04、0.10±0.02),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过与软骨细胞共同培养,ADSCs可定向分化为软骨细胞。     

生长分化因子5诱导兔脂肪干细胞成软骨细胞分化的实验研究

目的 探讨应用生长分化因子5(growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导脂肪干细胞(adipose-deftved stern cells,ADSCs)成软骨细胞分化的可能性及效果. 方法 3月龄清洁级健康日本大耳白兔6只,雌雄不限,体重2～3 kg.取兔皮下脂肪4～6 Ml,采用胶原酶消化离心贴壁培养法培养ADSCs,取第3代细胞进行实验.波形蛋白免疫组织化学和CD44、CD49d、CDl06免疫荧光染色鉴定ADSCs.调整细胞密度为1×106个/Ml,分别用普通细胞培养液以及含0、10、100 ng/Ml GDF.5的软骨细胞诱导液诱导培养.倒置相差显微镜观察细胞形态变化;MTT法检测细胞增殖情况;RT-PCR检测诱导细胞Col Ⅱ和蛋白多糖Mrna的表达;免疫组织化学、阿利新蓝染色、甲苯胺蓝染色和Western blot法检测诱导细胞Col Ⅱ和蛋白多糖表达. 结果 ADSCs呈小圆形、梭形、多角形分布,表面抗原标志CD44、CD49d呈阳性表达,CD106和波形蛋白呈阴性表达.100 ng/Ml GDF-5诱导的ADSCs呈圆形或类圆形,且细胞增殖旺盛.普通培养液和0、10、100 ng/Ml GDF.5成软骨细胞诱导培养后7 d,Col Ⅱ、蛋白多糖Mrna表达均呈浓度依赖性增加,除0、10 ng/Ml GDF-5两组间差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组差异均有统计学意义(P<0.05):100 ng/Ml GDF.5诱导培养14 d,Col Ⅱ、蛋白多糖Mrna以及蛋白表达达高峰,阿利新蓝、甲苯胺蓝染色以及Col Ⅱ免疫组织化学染色均呈阳性. 结论 经一定浓度的GDF-5诱导的ADSCs,Col Ⅱ和蛋白多糖表达明显增加,具有软骨细胞的部分生物学功能.     

人脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的：探索高效分离和扩增人脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs）的方法,观察其生物学特性,并通过形态学、免疫表型及多向分化能力进行鉴定。方法：以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,体外扩增后传代,倒置显微镜观察,MTT比色法测定细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD31、CD34、CD45、CD90、CD105的表达。在DMEM及胎牛血清培养基、地塞米松、IBMX、吲哚美辛的诱导下向脂肪细胞定向分化;在DMEM及胎牛血清培养基、地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油、胰岛素的诱导下向成骨细胞定向分化。结果：原代和传代细胞呈梭形外观,生长增殖能力良好。细胞传代后2天内处于潜伏期,第3天进入生长期,5天后进入平台期。流式细胞仪检测CD29、CD31、CD34、CD45、CD90、CD105阳性率分别为73.4%、3.6%、4.5%、2.0%、97.3%、80.4%。经定向诱导分化后,细胞分别呈现脂肪细胞、骨细胞的表型特征。结论：酶消化法能有效分离纯化人ADSCs,细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有ADSCs的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究

目的:探索人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)向表皮细胞表型转化的方法。方法:以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD105的表达,成脂诱导后油红O染色鉴定。实验组利用第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科实验室已成功构建的pc DNA3.1(+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的Ha Cat细胞,与ADSCs在Transwell小室中共培养,对照组为ADSCs加入10%FBS培养基,14天后Realtime-PCR检测两组ADSCs中CK19、integrin-β的m RNA表达量。结果:实验组ADSCs中CK19、integrin-β的m RNA表达量较对照组明显升高,且差别有统计学意义。结论:转染EGF的Ha Cat细胞可诱导ADSCs向表皮细胞表型分化,从而为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

阿司匹林对Ⅰ型成骨不全小鼠脂肪来源间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的探讨阿司匹林对Ⅰ型成骨不全小鼠脂肪来源间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响。方法从Ⅰ型成骨不全小鼠的脂肪组织中分离培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs~(col1a1+/-)),经流式细胞仪检测其表面间充质干细胞相关Marker CD 29、CD 45等的表达情况,并在成骨诱导7 d后进行ALP染色、成脂诱导14 d后进行油红O染色,验证ADSCs~(col1a1+/-)的成骨和成脂分化潜能;分别配制含0、0.5、1、1.5、2、5、10 mmol/L阿司匹林的培养基,MTS检测不同浓度阿司匹林对ADSCs~(col1a1+/-)增殖的影响;将ADSCs~(col1a1+/-)分为对照组、单纯成骨诱导组和加入1.5 mmol/L阿司匹林的成骨诱导+阿司匹林组进行成骨诱导,比较ALP染色结果及ALP活性,qPCR检测成骨相关基因及相关信号通路因子转录水平的变化。结果分离培养的ADSCs~(col1a1+/-)高表达间充质干细胞相关Marker CD 29及CD 45,低表达CD 44,并具有成骨、成脂分化潜能;低、中浓度(0～2 mmol/L)的阿司匹林可促进ADSCs~(col1a1+/-)增殖,高浓度(5～10 mmol/L)时则抑制,浓度为1.5 mmol/L时促增殖效果最明显;与对照组和单纯成骨诱导组相比,成骨诱导+阿司匹林组的ALP表达明显增强,成骨相关基因col1a1、bglap、runx2、osterix和Wnt信号通路中β-catenin以及TGF-β通路中bmp2的转录水平有显著上调。结论阿司匹林能够促进ADSCs~(col1a1+/-)的增殖和成骨分化,可能是通过Wnt及TGF-β信号通路来促进成骨分化的。     

Human adipose‐derived stem cells: isolation,characterization and applications in surgery

The ideal stem cell for use in functional tissue engineering needs to be abundantly available, harvested with minimal morbidity, differentiated reliably down various pathways and able to be transplanted safely and efficaciously. Adult human adipose tissue contains a population of mesenchymal stem cells, termed ‘adipose‐derived stem cells’ (ASC), which seem to fulfil most, if not all, of these criteria. ASC can be harvested readily, safely, and in relative abundance by modern liposuction techniques. They are capable of differentiating into other mesenchymal tissue types, including adipocytes, chondrocytes, myocytes and osteoblasts. They also show angiogenic properties, with recent evidence of a potential role in healing radiotherapy‐damaged tissue, possibly due to their secretion of vascular endothelial growth factor. Similarly, they may have a role in healing chronic wounds, and as such are being investigated in phase 1 trials for their ability to aid healing of recurrent Crohn’s fistulae. Subsequently they have a wide range of potential clinical uses in all fields of surgery. This article reviews the current and potential clinical applications of ASC in relation to surgery, as well as methods for their isolation, differentiation and molecular characterization.     

人脂肪源细胞外囊泡联合脱细胞脂肪组织支架构建组织工程脂肪

目的探讨人脂肪源细胞外囊泡(human adipose tissue derived extracellular vesicle,hAT-EV)联合脱细胞脂肪组织支架(decellularized adipose tissues,DAT)构建组织工程脂肪的可能性,为临床上软组织缺损修复提供新方案。方法将吸脂手术患者自愿捐赠的脂肪组织分为2份,1份脂肪组织进行脱细胞处理,并采用组织学(HE、Masson染色)、扫描电镜观察,Ⅰ、Ⅳ型胶原及层粘连蛋白免疫组织化学染色和Western blot检测进行表征。另1份脂肪组织使用去外泌体的完全培养基孵化48 h,离心收集培养基上清并使用超高速离心法获取hATEV。使用透射电镜观察其形态,纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight分析hAT-EV粒径分布范围,Western blot检测分析hAT-EV膜表面蛋白。将PKH26荧光标记的hAT-EV与脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)共培养后,共聚焦荧光显微镜观察hAT-EV能否进入ADSCs;将hAT-EV与ADSCs共培养15 d,油红O染色评估其成脂效果。将DAT组织剪碎并注射至8只6周龄雌性C57小鼠背部两侧,左侧每周注射0.2 mL hAT-EV作为实验组,右侧每周注射0.2 mL PBS作为对照组。12周后处死小鼠,取两侧DAT新生物进行湿重称量,并通过HE染色和围脂滴蛋白免疫荧光染色评估hAT-EV在体内诱导脂肪新生的能力。结果脂肪组织经脱细胞后,HE、Masson染色示DAT主要由排列松散的胶原构成,未见细胞核;扫描电镜示DAT中未发现细胞和细胞碎片,同时可见到粗大的胶原纤维束;免疫组织化学染色及Western blot检测示,DAT中保留了Ⅰ、Ⅳ型胶原和层粘连蛋白。经鉴定,hAT-EV呈双层包膜的球形,高表达CD63、凋亡诱导因子6相互作用蛋白抗体、肿瘤易感基因101,97.9%粒径分布范围为32.67~220.20 nm,峰值为91.28 nm。共聚焦荧光显微镜和油红O染色示,hAT-EV被ADSCs摄取并诱导其成脂分化。大鼠体内实验显示,实验组新生脂肪组织湿重显著高于对照组(t=2.278,P=0.048);HE染色示,实验组脂滴结构较对照组多,对照组胶原含量高于实验组;围脂滴蛋白免疫荧光染色示,实验组DAT新生物中脂肪组织比例高于对照组(t=4.648,P=0.017)。结论DAT搭载hAT-EV可作为一种诱导脂肪组织新生的新方法,在软组织缺损修复中具有潜在应用前景。     

吸脂组织中脂肪干细胞分离和定向分化的研究

目的探讨吸脂组织中的干细胞分离和体外诱导分化为表皮样细胞、成骨细胞及脂肪细胞的可能性。方法通过电动负压吸引获取1例行吸脂手术的30岁女性腹部脂肪组织,酶消化法获取脂肪来源干细胞,体外培养扩增,通过流式细胞仪检测表面抗原的表达。取生长良好的第3代人脂肪来源干细胞,分别应用成表皮诱导培养液（70％培养液A＋30％成纤维细胞培养基上清液＋10ng／L表皮生长因子）,成骨诱导培养基（DMEM／10％FBS,0．1μmol／L地塞米松,50μmol／L维生素C,10mmol／Lβ-甘油磷酸钠,100U／ml青霉素,100U／ml链霉素）和成脂肪细胞诱导培养基（DMEM＋10％FBS＋500μmol／L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤＋1μmol／L吲哚美辛）诱导20d后,分别对成表皮诱导组进行免疫组化检测CK19表达,成骨诱导组进行碱性磷酸酶检测,成脂诱导组进行油红O检测。结果流式细胞仪鉴定结果示,人脂肪来源干细胞CD44和CD49d为阳性,CD34为阴性。诱导20d后,成表皮诱导组示免疫组织化学鉴定结构显示有CK19的表达;成骨诱导组示细胞碱性磷酸酶染色阳性;成脂肪细胞诱导组示油红O染色,胞质内脂滴均被染成红色,证实为脂性液体。结论从吸出的脂肪组织中分离出脂肪来源干细胞,在体外进行了脂肪干细胞的扩增和传代,所分离的脂肪来源干细胞具备多向分化能力。     

体内外人脂肪间充质干细胞向肝样细胞分化的实验研究

目的 分离、培养人脂肪间充质干细胞(hADSCs),研究其在体内外向类肝样细胞转化的能力.方法 采用Ⅰ型胶原酶消化皮下脂肪,贴壁分选去除造血细胞的方法获得较纯的干细胞.通过对形态观察、表面分子鉴定、透射电镜内部结构扫描以及成脂、成骨定向诱导对脂肪间充质干细胞进行鉴定.用EGF、FGF、OSM、HGF、TSA细胞因子体外诱导hADSCs向肝样细胞分化.尾静脉输注hADSCs至急性肝损伤裸鼠,观察hADSCs在裸鼠肝脏内定植、向肝样细胞分化情况,以及hADSCs对裸鼠肝损伤的保护作用.结果 分离获得的细胞呈长梭形贴壁生长,低表达CD34、CD45,高表达CD73、CD90、CD105,具有多向分化潜能.诱导细胞表现出肝样细胞形态,表达AFP、alb,并且和肝细胞一样具有吸脂性.体内诱导:移植细胞在裸鼠体内生存、分布,并且细胞表达人alb,细胞体积较裸鼠肝脏细胞大,形态不均一,与人肝脏细胞形态有差异.同时研究发现hADSCs可改善急性肝损伤裸鼠肝功能,降低转氨酶.结论 人脂肪间充质干细胞可在体内外向肝样细胞分化,分化的细胞具有肝细胞样生物学性状.hADSCs对裸鼠急性肝损伤具有一定的治疗作用.

Abstract：

Objective To isolate and culture human adipose derived mesenchynal stem cells (hADSCs) and study the potential of hADSCs to differentiate into hepatocyte-like cells. Methods To ensure the removal of contaminating hematopoietic cells, hADSCs were selected based on plastic adherence. Cell surface antigen was confirmed by flow cytometry; ultramicrostructure was detected by transmission electron microscopy; adipogenic and osteogenic differentiation of hADSCs was analyzed by oil Red O staining and yon Kossa staining. hADSCs were exposed to differentiation medium containing EGF,FGF,OSM, HGF,TSA in vitro. 10% CCl4 (100 μ1/20 g body weight )was injected into immune-deficient BALB/c-nu mice and hADSCs (5 × 105 cells) were simultaneously administrated from the tail vein. Blood samples were collected and concentration of aminotransferase and direct bilirubin were detected. Administration without hADSCs was used as a control. One month later, we sacrificed the mice and liver sections were examined by histochemical immunofluorescence with human ALB specific antibodies. Results hADSCs exhibited fibroblast-like morphology, and expressed CD73, CD90,CD105, and were lacking of CD34 and CD45. Adipogenic and osteogenic differentiation showed that hADSCs have the capacity of multidifferentiation. The differentiated cells showed hepatocyte-like cell morphologies and hepatocyte-specific markers including albumin (alb) and α-fetoprotein (AFP). The bioactivity assays revealed that these hepatocyte-like cells could uptake low-density lipoprotein (LDL).Histochemical immunofluorescence showed that hADSCs were incorporated into injured livers. Some human alb-positive cells were found in liver sections after implantation of undifferentiated hADSCs. Transaminase activity in the experimental group was lower than in the control group. Conclution hADSCs can differentiated into functional hepatocyte-like cells and can relieve CCl4 induced BALB/c-nu acute liver injury.     

人脂肪组织来源干细胞体外增殖分化中端粒酶的表达

目的 探讨体外培养条件下人脂肪干细胞增殖和分化过程中端粒酶的表达水平,为其作为种子细胞的应用研究提供理论基础.方法 体外分离、培养人脂肪干细胞并传代,行流式细胞表面抗原分析,并用油红O染色及茜素红染色行成骨和成脂诱导分化的鉴定;采用TRAP法分别检测新鲜的不同时间培养的人脂肪干细胞和诱导分化为脂肪细胞的人脂肪干细胞的端粒酶活性.结果 脂肪干细胞具有向脂肪细胞、成骨细胞多向分化的能力,且表达干细胞相关表面标志物.新鲜分离和传代的脂肪干细胞,在体外培养12代内端粒酶活性呈阴性或低水平表达;一旦经过成脂诱导分化,细胞端粒酶活性表达上调,培养3～6 d后端粒酶活性开始出现逐渐降低.结论 用胶原酶消化法从脂肪抽吸术中得到的细胞主要是人脂肪干细胞;在体外培养增殖的过程中,人脂肪干细胞的端粒酶活性未见异常表达;成脂诱导分化早期人脂肪干细胞端粒酶活性增高,其后开始出现下降趋势.