Rh血型D抗原弱表现型基因分型和序列分析

目的 探讨Ｒｈ血型Ｄ抗原弱表现型Ｄ抗原数目和（或）Ｄ抗原表位数减少形成的分子基础。方法 常规ＰＣＲ技术检测３名Ｄ抗原弱表现型非血缘关系个体Ｄ基因的第４内含子,多重ＰＣＲ技术分析第３、第６和第９外显子,并分别对３名个体的Ｄ基因部分序列进行分析。结果 ３名Ｄ抗原弱表现型个体Ｄ基因第４内含子,第３、第６和第９外显子检测结果与正常Ｄ基因完全一致,部分序列分析未发现基因突变和Ｄ／ＣＥ基因交换。结论 Ｄ抗原数     

黔东南苗族侗族自治州无偿献血者Rh(D)阴性的调查分析

黔东南州是以苗族侗族为主的少数民族地区,人口构成十分复杂.为掌握凯里地区无偿献血者Rh(D)阴性分布状况,笔者对2004～2006年本地区无偿献血者进行了Rh(D)阴性分布调查,同时建立了本市Rh(D)阴性血型库.     

Rh(D)阴性孕妇抗D抗体调查分析

Ｒｈ血型是继ＡＢＯ血型之外又一个重要的血型系统 ,其重要性是妇女可产生抗Ｒｈ -抗体 ,具有十分严重的潜在危险性而引起临床的关注 ,因为 ,这意味着该妇女所生育的Ｒｈ阳性婴儿 ,可能患致命的新生儿溶血病[1] 。在我国 ,引起中等和严重程度的新生儿溶血病的最常见的原因是Ｒｈ血型的Ｄ抗原[2 ] 及其相应抗Ｄ抗体。本文对我科 1999— 2 0 0 0年发现的9例Ｒｈ(Ｄ)阴性孕妇产前、产后进行的血型抗体检测 ,结果报告如下。1　资料与方法1.1对象　我科检查发现的 9例Ｒｈ(Ｄ)阴性孕妇 ,年龄 2 5～ 31岁。其中 5例为初孕妇 ,2例孕 2次 ,2例孕 3次…     

微柱凝胶技术在Rh(D)阴性孕妇抗D检查中的应用

目的探讨微柱凝胶技术(MGCT)在Rh(D)阴性孕妇抗D检查中的价值。方法采用MGCT对42例Rh(D)阴性孕妇进行血清IgG抗D检测,对阳性标本进行效价测定,同时用传统的试管法抗球蛋白试验(传统试管法)作对比;对抗D阳性孕妇的新生儿跟踪进行IgG抗D的检测。结果采用柱凝集技术,42例Rh(D)阴性孕妇中13例(31.0%)抗D呈阳性,其中10例(23.8%)效价大于或等于64;传统试管法12例(28.6%)呈阳性,其中3例(7.1%)效价大于或等于64。11例新生儿抗D检测阳性,其中10例均为孕妇抗D效价大于或等于64,全部出现新生儿溶血病的临床表现。结论微柱凝胶技术应用于Rh(D)阴性孕妇抗D检查有实用价值,灵敏度和特异性优于传统试管法,对预测新生儿溶血病的发生有较大意义。     

45例有生育史Rh阴性妇女抗-D抗体和RHD基因分析

目的 研究45例多次妊娠Rh阴性妇女产后半年免疫状况和RHD基因背景.方法 常规血清学方法检测Rh(D)抗原, 抗人球蛋白试验(IAT)对Rh(D)抗原确认和IgG抗-D筛查,热吸收放散确认D放散型(DEL); 先后采用商品化试剂盒、序列特异性引物PCR(sequence-specific primer-polymerase chain reaction,SSP-PCR)技术以及DNA序列分析技术,分析样本的RHD基因.结果 45例样本抗人球蛋白试验检测出IgG抗-D阳性5例占总数的11.1%,占真实Rh(D)阴性的16.1%.DEL检出14例(31.1%),抗-D抗体全部为阴性.D基因分析结果显示以DEL(1227A)等位基因为主,同时呈现多态性.结论 真实Rh(D)阴性妇女多次生育存在较高的同种免疫风险易导致新生儿溶血病,必须做好围生期胎-母免疫预防保护,但DEL型妇女或可免除防护.     

银川地区93例Rh（D）变异型献血者Rh血型研究

目的研究银川地区Rh(D)阴性献血者中D变异型表型分布。方法经盐水法初筛Rh(D)阴性献血者标本利用抗人球蛋白试验确认弱D(部分D),用吸收放散试验确认RhDel型,再用Rh血型分型微柱凝胶卡确定Rh表型。结果509份初筛为Rh(D)阴性的献血者检出D变异型93份(18.27%),其中弱D(部分D)35例(6.88%),De L型58例(11.39%),真实的Rh(D)阴性416例(81.73%)。35例弱D(部分D)表型分布为cc Ee 19例(54.29%),Cc Ee 6例(17.14%),Ccee 5例(14.29%),ccee 3例(8.57%),CCee 2例(5.71%)。58例Del型表型分布为cc Ee 23例(39.66%),Cc Ee 11例(18.97%),ccee 11例(18.97%),CCee 8例(13.79%),CCEe 3例(5.17%),cc EE 2例(3.45%)。结论银川地区D变异型检出率较高,将这部分献血者按RhD阳性发往临床能够保证输血安全,同时也应该重视C、c、E、e抗原的鉴定。     

Rh(D)阴性献血者不规则抗体检测的结果分析

目的分析Rh(D)阴性献血者不规则抗体检测的结果,探讨在献血者血液Rh(D)阴性确认试验时,进行不规则抗体检测的必要性。方法用间接抗人球蛋白法进行Rh(D)阴性确认试验及抗体筛选试验、抗体鉴定试验,盐水法进行Rh表现型的检测。结果 1205份Rh(D)阴性献血员标本中,抗体筛选试验阳性的标本有20份,经过抗体鉴定,其中抗-D 10份,抗-M 6份,非特异性抗体2份,抗-Lea1份,冷自身抗体1份。结论 Rh(D)阴性献血者抗体筛选阳性率高达1.66%,较以往报道的正常人群抗体筛选阳性率高。在临床供血上,其高检出率对临床用血安全有较为重要的意义,对Rh(D)阴性献血者更应该进行不规则抗体检测。     

Rh(D)阴性患者的急性输血

Rh(D)阴性血型在我国属稀有血型,阴性率仅占0.4%[1].故Rh(D)阴性的人在临床输血中不多见,一些临床医生和输血专业工作者误以为"Rh阴性患者需输血时,无论在什么情况下都必须输Rh阴性的血液,否则就有生命危险",造成Rh阴性危重患者急症抢救需要紧急输血却找不到Rh阴血液,贻误抢救时机,导致生命危险.     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH-Linker-VL片段）,继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

一种大容量天然人源核糖体展示单链抗体文库的构建

目的 构建大容量天然人源核糖体展示单链抗体(single chain Fv,scFv)文库,为抗体研究提供方便有效的技术平台.方法 收集健康献血志愿者的白细胞悬液,离心分离单个核细胞,抽提其总RNA,逆转录成cDNA、PCR及重叠延伸PCR法构建scFv文库,并通过第2次重叠延伸PCR在scFv DNA序列5'端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,其3'端添加6×His标签、间隔序列(基因Ⅲ)、茎环结构等改造成核糖体展示天然人源scFv文库.结果 成功构建了可用于筛选抗体的核糖体展示文库容量达1013以上.结论 成功构建了大容量天然人源核糖体展示scFv文库,为筛选到高亲和力和特异性抗体提供了技术平台.     

卵巢癌人源性核糖体展示抗体库的构建

目的构建库容量大、多样性好的卵巢癌人源性核糖体展示抗体库。方法从10名卵巢癌患者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增人全套重链可变区基因（variable region of heavychain,V_H）和轻链可变区基因（variable region of light chain,V_L）,用重叠PCR技术对它们进行拼接,构建卵巢癌人源单链抗体库,并连接T载体转化大肠杆菌,经蓝白筛选,挑选阳性克隆,测序鉴定。结果成功构建卵巢癌人源单链抗体库,库容6.5×10~（13）,经测序验证多样性良好。结论成功构建的卵巢癌人源单链抗体库可用于进一步筛选目标抗原,为开发治疗性人源抗体奠定了实验基础。     

全自动微板法筛查献血者Rh血型D抗原的检测方法

目的建立全自动微板法快速检测献血者Rh(D)血型的方法。方法用试管法从已知阳性标本筛出±凝集效果标本8份、已知阴性标本4份作为试验标本,采用多因素水平正交试验确定凝集反应最佳条件组合,尽量使弱凝集和阴性凝集外观表现明显区分开,将D抗原性较弱的标本尽可能以较强的凝集表现出来。结果采用此法筛查无偿献血者标本80 394人份,所得阴性标245份均进行经典试管法确证试验,与微板法的符合率为98.8%。结论全自动微板法可用于献血者Rh血型D抗原的检测。     

Rh(D)阴性患者自体输血的临床分析(附29例报告)

目的探讨择期手术的Rh(D)阴性患者进行自体输血的临床意义.方法对确定为Rh(D)阴性血型的29例择期手术患者即与临床医生联系并决定行自体输血.患者口服多糖铁150mg,每日2次.按预计患者术中输血量,分次进行采血,每次采血400ml,间隔3d进行第二次采血.为了缩短手术等待的时间,最后一次采血在手术中进行.结果29例患者有7例术前采自体血400ml(24.1%);21例术前采自体血800ml,同时术中回收自体红细胞300ml(72.4%);1例术前采自体血800ml,术中回收自体红细胞300ml,另外输注异体悬浮红细胞260ml(3.5%).结论在Rh(D)阴性血液紧张的情况下应用术前自体储血的同时配合术中血液回收术,90%以上的患者均可避免输异体血.     

抗人肝细胞癌单链抗体基因的构建和表达

目的：构建抗人肝细胞癌单链抗体基因，并在大肠杆菌中表达．方法：采用RT-PCR法扩增抗体重链和轻链可变区基因，用(Gly4Ser)，肽段连接VH基因和VL基因，构建克隆载体，将测序完全正确的ScFv基因克隆到分泌性表达载体pCANTAB 5E中诱导表达转化的TG1和HB2151细胞．用SDS-PAGE和免疫组化方法分析检测表达产物．结果：DNA测序证实ScFv基因结构正确，可在大肠杆菌中成功表达，游离ScFv相对分子质量大约为30ku，与HC-108，HepG-2和SMMC-7721肝癌细胞有特异性的结合反应．结论：重组制备的抗人HCD78分子单链抗体在人肝癌的基础和临床研究中具有潜在的应用价值．     

阿尔茨海默病Aβ人抗体可变区片段基因的克隆和表达

目的 筛选出β淀粉样蛋白40 (Aβ40)的人源抗体单链可变区片段,克隆单链抗体的基因并在原核生物大肠杆菌表达,为阿尔茨海默病的诊断和治疗开辟新的途径。方法 先将Aβ40包被在免疫反应板上,后用来自正常人外周血淋巴细胞的单链抗体文库结合。经过5轮的生物淘金法筛选,从最后一轮噬菌体感染的大肠杆菌TGl中随机挑选55个克隆进行ELISA测试,筛选出Aβ40特异的单链抗体并对其进行基因测序。将人源抗体单链可变区片段基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,转化大肠杆菌BL21表达谷胱甘肽-s-转移酶(GST)融合的单链抗体。结果 ELISA测试表明,55个克隆中有33个克隆能结合Aβ40,Aβ40对10个克隆的竞争抑制率达到50％以上,而其中5个克隆的抗原结合表位在Aβ40的氨基端1-16个氨基酸之间。DNA测序结果发现,Aβ40单链抗体基因由768bp组成,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构。将单链抗体基因克隆到原核表达系统中诱导表达,得到相对分子质量为55000的GST融合抗体表达产物。结论利用非免疫途径筛选出阿尔茨海默病发病中起关键神经元毒性作用的Aβ40的人源抗体单链可变区片段,为该抗体的表达和临床应用打下了基础。     

抗骨形成蛋白单链抗体的构建与表达

目的:构建抗骨形成蛋白单链抗体并获得表达.方法:应用一段人工合成的含15个氨基酸的连接肽,采取亚克隆技术,将一株鼠抗BMP单克隆抗体的重链可变区(VH)的N端和轻链可变区(VL)的C端连接起来;将连接产物克隆入融合蛋白表达载体pEGX-4T-l,在大肠杆菌JM109中进行表达.结果:构建的单链抗体(ScFv)全长705 bp,并获得融合表达产物约52×103u.结论:亚克隆方法是一种构建单链抗体快速、简便、可靠的方法.     

全人源抗前列腺癌ScFv抗体的筛选及生物学特性研究

目的 从已成功建立的前列腺癌噬菌体抗体库中筛选抗人前列腺癌单链抗体(ScFv),并分析其生物学特性。方法 以良性前列腺增生(BPH)细胞与噬菌体抗体库共孵育,去除抗体库中能够与BPH细胞结合的噬菌体抗体,再以前列腺癌细胞系DU145与去除非特异性结合后的噬菌体抗体库共孵育,通过“吸附-洗脱-扩增”对前列腺癌的噬菌体抗体库进行3轮的富集。采用流式细胞术筛选出对人前列腺癌细胞系DU145高亲合力的阳性克隆。阳性噬菌体克隆经亚克隆并转染大肠杆菌TG1,表达出可溶性ScFv抗体。采用流式细胞术、免疫荧光法分析其生物学特性。结果 以前列腺癌细胞系DU145为抗原,筛选出19个噬菌体抗体,经测定C11与DU145细胞亲合力最高,亚克隆至原核表达载体表达纯化为C11 ScFv抗体。流式细胞术和免疫荧光法检测结果均显示,C11 ScFv抗体与前列腺癌细胞DU145和PC3结合,与BPH细胞不结合。结论 通过噬菌体展示技术筛选到前列腺癌细胞系高亲合力的可溶性ScFv抗体,为进一步研究抗体的靶向性治疗奠定了基础。