鼠尾胶原对过氧化氢所致体外心肌细胞氧化损伤的影响

目的:探讨鼠尾胶原对过氧化氢导致的离体心肌细胞氧化损伤的保护作用。方法:原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机接种到铺有鼠尾胶原的培养皿和普通培养皿中,均用0u M、100u M、200u M和300u M H2O2诱导。24h后,通过电子显微镜观察各组乳鼠心肌细胞的形态,应用MTT比色法检测心肌细胞存活率,TUNEL法检测心肌细胞凋亡形态,流式细胞技术检测心肌细胞凋亡率,Western-Blot检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达。结果:铺有鼠尾胶原的培养皿和普通培养皿中,随着H2O2浓度的增高,电子显微镜下可观察到细胞凋亡状态明显加重,细胞存活率明显下降,细胞凋亡率明显增高,Bcl-2/Bax比值显著降低。而在相同浓度H2O2诱导的鼠尾胶原组与普通组中,铺有鼠尾胶原培养皿培养的细胞凋亡状态较普通培养皿培养的细胞明显减弱,且细胞存活率及Bcl-2/Bax比值增高,细胞凋亡率减低。结论:鼠尾胶原对过氧化氢所致的心肌细胞氧化损伤具有保护作用。     

原代培养冷冻兔角膜缘上皮细胞的增殖活性研究

为探讨低温保存的兔角膜缘上皮细胞体外培养方法和增殖活性，采用不同的冷冻条件保存兔角膜缘上皮组织；通过若丹明B染色方法定量检查体外培养的原代细胞增殖活性，并对含血清培养和无血清培养、消化培养和组织块培养进行比较性研究。结果表明，二甲基亚砜浓度梯度和降温速率对冷冻角膜缘上皮原代细胞的增殖能力均无显著性影响(P&;gt;0．05)。在细胞增殖活性上，血清培养组优于无血清培养组(P&;lt;0．05)；组织块培养组优于消化培养组(P&;lt;0．05)；RPMI1640组优于MEM组和DMEM组(P&;lt;0．05)；3T3细胞滋养层组与巨噬细胞滋养层组结果相似(P&;gt;0．05)。结论：兔角膜缘上皮细胞具有血清依赖性和低温耐受性。     

兔口腔黏膜上皮干细胞分化为角膜上皮样细胞的体外研究

目的以羊膜做载体将兔口腔黏膜上皮干细胞诱导为角膜上皮样细胞,探讨口腔黏膜上皮细胞作为种子细胞体外培养构建组织工程角膜的技术方法,为眼表重建提供材料。方法用Ⅳ型胶原黏附法分离纯化口腔黏膜上皮干细胞,对体外培养的口腔黏膜干细胞进行免疫表型鉴定。将筛选后获得的口腔黏膜上皮干细胞种植在去上皮羊膜表面体外培养,待细胞融合成单层后置入插入式培养皿中进行气液界面培养,促进细胞分化形成复层。培养数日后进行苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学、光镜及透射电镜检测,观察羊膜-复层上皮组织结构,免疫荧光检测干细胞特异性标志物P63以及角膜上皮细胞标志物角蛋白3(K3)并与角膜上皮组织比较。结果体外诱导培养数天后,羊膜载体的口腔黏膜上皮细胞形成复层,在组织形态及生物学特性上与角膜上皮相似。并且组织细胞P63、K3表达明显,角膜特异性生物学标志物免疫组织化学染色呈阳性。结论在本实验的培养条件下,获得的口腔黏膜上皮干细胞可在体外培养扩增,呈克隆性生长,具有很强的增殖能力。口腔黏膜上皮干细胞体外培养可构建类角膜上皮。     

ERK1/2信号通路在角质细胞生长因子-2诱导角膜基质细胞增殖中的作用

目的观察角质细胞生长因子(keratinocyte growthfactor-2,KGF-2)对角膜基质细胞的增殖作用及ERK1/2信号在角膜基质细胞增殖中的调控作用,探讨KGF-2对角膜基质细胞增殖的可能机制。方法体外培养角膜基质细胞,MTT法检测细胞增殖,Western blot检测磷酸化ERK1/2表达水平。结果 KGF-2在1～100 mg·L-1对角膜基质细胞有明显的促进增殖作用且呈现剂量-效应关系;100 mg·L-1 KGF-2处理角膜基质细胞,5、15、30 min后ERK1/2磷酸化表达水平明显升高,60、90、120、180 min后ERK1/2磷酸化表达水平逐渐减弱;20μmol.L-1 ERK1/2抑制剂PD98059可抑制KGF-2对角膜基质细胞的促增殖作用。结论 KGF-2激活ERK1/2信号通路,提高细胞增殖率,可被抑制剂PD98059阻断;ERK1/2信号通路调控角膜基质细胞的增殖,在角膜基质细胞损伤中发挥作用。     

SD新生大鼠耳蜗螺旋神经元的原代培养

目的建立用自制的鼠尾胶原联合胰酶消化法原代培养SD新生大鼠耳蜗螺旋神经元。方法采用出生3 d内的SD大鼠,取螺旋神经节组织,通过胰酶消化后在自制鼠尾胶原包被的培养皿中进行原代培养,应用神经微丝蛋白进行免疫组化鉴定。结果获得的螺旋神经元细胞在体外能较快地贴壁,可以存活、生长,细胞形态良好。结论自制鼠尾胶原联合胰酶消化的培养方法可获得良好状态的螺旋神经元细胞,为原代培养螺旋神经元提供了新思路。     

bFGF促进角膜损伤修复作用及部分机制研究

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)促进兔角膜基质细胞的增殖、迁移作用,探讨bFGF促进兔角膜基质细胞增殖、迁移的分子机制。方法:使用兔角膜基质细胞作为细胞模型,分为对照组、bFGF组、bFGF+ERK1/2或者p38抑制剂组。用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞增殖,细胞划痕实验检测细胞迁移水平,Western blot检测ERK1/2及其磷酸化蛋白和p38及其磷酸化蛋白的表达。结果:MTT结果显示,bFGF对兔角膜基质细胞有明显的促进增殖的作用,当bFGF浓度在2mg·L-1时促增殖作用最为明显;细胞迁移实验结果显示,用2mg·L~(-1) bFGF处理兔角膜基质细胞48h,能够明显地促进该细胞迁移。Western blot实验结果表明,bFGF能够上调和细胞增殖相关的ERK1/2信号通路磷酸化水平以及和细胞迁移相关的p38 MAPK磷酸化水平。当分别加入信号通路抑制剂后,bFGF促兔角膜细胞增殖和迁移作用都受到一定程度的抑制,同时伴随着相关通路的关键蛋白的磷酸化水平降低。结论:bFGF能够激活ERK1/2和p38 MAPK信号通路,从而提高兔角膜基质细胞的增殖、迁移,促进角膜损伤修复。     

人参皂甙Rg1对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞增殖及细胞外基质的影响

目的:观察人参皂甙Rg1对转化生长因子-β1诱导的肾小管上皮细胞增殖及细胞外基质的影响.方法:MTT法测细胞增殖情况.ELISA法测定培养细胞上清液中Col-Ⅰ,Col-Ⅲ和FN的含量.结果:在10～40 ng/mL浓度范围内时间、剂量依赖性的促进肾小管上皮细胞增殖,减少转化生长因子-β1诱导的肾小管上皮细胞对Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN的分泌.结论:G-Rg1能够促进TGF-β1诱导下的肾小管上皮细胞的增殖,可能与抑制ECM的分泌有关.     

不同细胞外基质对神经干细胞分化影响的实验研究

目的:通过观察不同的细胞外基质对神经干细胞(NSCs)分化的影响,寻找促使NSCs向神经元分化的最佳细胞外基质,为NSCs定向分化培养及NSCs共移植体的构建提供实验依据。方法:利用无血清培养和细胞克隆培养技术,从新生大鼠海马分离NSCs,进行体外扩增、悬浮培养、传代;将层粘连蛋白(LN)、Matrigel、多聚赖氨酸与NSCs贴壁混合培养14d;采用免疫细胞化学和免疫荧光技术,观察NSCs的分化情况。结果:通过上述实验表明,在利用不同的细胞外基质混合培养时,LN组MAP2阳性细胞数明显高于其它两组;多聚赖氨酸组和Matrigel组GFAP阳性细胞数明显高于LN组。结论:LN有助于NSCs向神经元定向分化,是NSCs共移植体较理想的细胞外基质。     

人羊膜匀浆上清液治疗兔角膜碱烧伤的病理研究

目的：观察人羊膜匀浆上清液促进兔角膜碱烧伤后角膜上皮和基质修复的作用，为临床上应用人羊膜匀浆上清液点眼治疗眼碱烧伤提供理论依据。方法：将制备的羊膜匀浆上清液点眼治疗兔角膜碱烧伤。并对治疗后的角膜照相观察角膜上皮愈合和基质修复情况。结果：羊膜匀浆上清液治疗角膜碱烧伤后眼充血明显减轻，角膜上皮愈合较快，角膜上皮细胞排列整齐，基质中炎症细胞浸润减轻且胶原纤维排列整齐。结论：早期应用羊膜匀浆上清液能促进兔角膜碱烧伤后角膜的愈合及膜基质有序修复。     

IGF-Ⅰ与TGF-β2单独及联合应用对软骨细胞培养的影响

目的 探讨胰岛素样生长因子-1（IGF-Ⅰ）与转化生长因子-β2（TGF-β2）单独及联合应用对软骨细胞形态、增殖速度、黏多糖含量、Ⅱ型胶原含量及表型的影响.方法 采用酶消化法取兔软骨细胞并培养,于第2代时分别加IGF-Ⅰ及 TGF-β2.分为A（空白对照）、B（含IGF-Ⅰ）、C（含TGF-β2）、D（含IGF-Ⅰ及TGF-β2）组.用苏木精-伊红染色法、甲苯胺蓝染色观察软骨细胞形态,MTT法检测增殖速度,阿尔新蓝比色法检测黏多糖含量,免疫组化法检测Ⅱ型胶原含量及表型.结果 在维持细胞形态、细胞增殖速度、Ⅱ型胶原含量及表型方面,D组优于B组,C组次之,A组最差,差异均有统计学意义（P＜0.05）.在促进细胞外基质及黏多糖分泌方面,D组优于C组,B组次之,A组最差（P＜0.05）.结论 IGF-Ⅰ、TGF-β2能维持软骨细胞形态,促进其增殖及Ⅱ型胶原的分泌,并维持其表型,增加细胞外基质及黏多糖的分泌,联合应用有协同作用,可抑制软骨细胞在体外培养过程中的老化.     

气液界面培养小鼠气管上皮细胞模型构建

目的构建小鼠气管上皮细胞原代培养模型,应用于外源化合物等的吸入暴露毒性评价。方法通过优化培养基配比成份,分离小鼠气管,蛋白酶低温消化得到上皮细胞,接种到预先包被胶原的Transwell半透膜中,通过细胞跨上皮电阻值与紧密连接蛋白的检测,评估细胞间紧密连接与细胞极化的形式。转换气液界面培养,标记纤毛蛋白,拍摄纤毛形态特征。结果MTEC分离分化培养后,MUC5AC蛋白,乙酰化α-微管蛋白(α-tubulin),β-微管蛋白-Ⅳ(β-tubulin-Ⅳ),闭合小环蛋白(ZO-1)的表达及紧密连接的形成与假复层上皮的形成均与小鼠体内气管组织结构类似,扫描电镜观察小鼠气管上皮细胞表面纤毛形态。结论本研究构建的小鼠气管上皮细胞培养方案,体外培养成功获得具有类似组织结构和生理功能的假复层纤毛柱状上皮,为气道上皮细胞的分离、分化和检测提供了稳定、可靠地方法。     

rhIL-10对银屑病动物模型的治疗作用及免疫功能的影响

目的　研究重组人白细胞介素 10 (rhIL 10 )对银屑病动物模型的治疗作用以及免疫功能的影响。方法　用小鼠雌激素期阴道上皮模型、鼠尾鳞片表皮模型观察重组人白细胞介素 10的抗银屑病作用 ,并检测ConA诱导T淋巴细胞增殖、LPS诱导B淋巴细胞增殖、NK细胞活性及细胞因子(IFN γ、IL 2、IL 1、TNF α)水平。结果　rhIL 10 (5 ,2 0 ,80μg·kg-1·d-1,sc)对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂有抑制作用 ,促进小鼠尾鳞片颗粒层的形成。对ConA诱导T淋巴细胞增殖反应及IL 2、IFN γ产生有抑制作用 ;对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生IL 1、TNF α具有抑制作用 ;对NK细胞活性有抑制作用 ;对LPS诱导B淋巴细胞增殖有促进作用。结论　rhIL 10可能是通过抑制表皮细胞增殖与促进其分化 ,并参与抗炎与免疫调节过程而发挥治疗银屑病动物的作用     

复方煤焦油洗剂治疗银屑病的主要药效学研究

目的探讨复方煤焦油洗剂治疗银屑病的药效学机制。方法采用小鼠尾鳞片表皮、鼠阴道上皮实验模型,观察复方煤焦油洗剂对上皮细胞分裂及表皮细胞分化的影响;采用豚鼠磷酸组织胺致痒阈模型,观察其抑制瘙痒的作用;采用角叉菜致大鼠足跖肿胀模型,观察其抗炎作用。结果复方煤焦油洗剂有显著的抑制小鼠阴道上皮细胞有丝分裂及增殖细胞核抗原表达、促进小鼠尾鳞片表皮颗粒层形成的作用,能显著提高磷酸组织胺对豚鼠的致痒阈,可使角叉菜胶所致的大鼠足跖肿胀显著减轻。结论复方煤焦油洗剂可抑制角质形成细胞增殖、促进角质形成细胞正常分化,有明显抑制瘙痒和急性炎症的作用。     

培养胎兔角膜缘干细胞移植治疗兔眼碱烧伤的实验研究

目的 探讨羊膜为载体培养的胎兔角膜缘干细胞移植治疗兔角膜缘碱烧伤的效果。方法 将胎兔角膜缘干细胞原代培养于羊膜上7d后。移植于兔角膜缘碱烧伤动物模型眼，并对治疗后的角膜进行临床及病理学检查。结果 体外培养的胎兔角膜缘干细胞可在羊膜上保持高增殖力。并分化为密集的角膜上皮细胞层。角膜缘干细胞移植术后兔角膜上皮完整、基质细胞浸润减轻、新生血管减少，与对照组和单纯羊膜移植组相比其临床评分差异有显著意义。结论 胎兔角膜缘干细胞移植术治疗角膜碱烧伤可有效重建眼表，为临床应用胎儿角膜缘干细胞进行眼表重建奠定了实验基础。     

胶原三维培养下卵巢癌细胞生物学性状研究

目的 建立卵巢癌HO-8910PM细胞胶原Ⅰ三维培养模型,对胶原Ⅰ基质中卵巢癌HO-8910PM细胞的形态、活力及功能进行研究,为体外卵巢癌的研究提供参考。方法 透射电镜表征胶原Ⅰ结构特点,以胶原Ⅰ为支架材料,建立卵巢癌细胞体外三维培养模型;倒置显微镜观察卵巢癌细胞生长形态及增殖情况;钙黄绿素-AM染色观察胶原Ⅰ基质中卵巢癌细胞的活力;ELISA检测二维培养及三维培养中卵巢癌细胞血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的分泌。结果 透射电镜下可见胶原Ⅰ呈交联网络状结构,胶原Ⅰ基质中卵巢癌细胞集聚成不规则团状,细胞在胶原Ⅰ中的活力较好,细胞与基质具有良好的生物相容性;与二维培养细胞比较,三维培养体系中VEGF-A、EGF和IGF-1的分泌量均较高,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。结论 胶原Ⅰ具有良好的结构与性能,适宜于卵巢癌细胞体外三维培养,并能较好地维持卵巢癌细胞的形态和功能。     

利用PLA、PGA、PLGA三种支架再生兔关节软骨

目的观察兔关节软骨细胞在聚乳酸（PLA）,聚羟基乙酸（PGA）,以及两者的共聚物PL—GA三种三维支架上的贴附和生长情况,利用组织工程技术培养工程化关节软骨。方法多聚赖氨酸包埋PLA,PGA,PLGA三维细胞支架。分离培养兔关节软骨细胞,体外扩增后种植到三种支架中。在体外培养软骨细胞一支架复合物,4周终止培养,进行HE、Masson组织学染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。结果（1）体外培养发现,软骨细胞在PLGA支架材料内贴附生长良好,长期培养仍保持软骨细胞特性,其贴附生长能力,分泌Ⅱ型胶原能力较PGA,PLA支架组强。（2）支架经过多聚赖氨酸包埋后,软骨细胞的贴附生长及分泌Ⅱ型胶原能力均较对照组好。结论多聚赖氨酸处理的PLGA三维支架适合软骨细胞贴附生长和分泌Ⅱ型胶原,可作为软骨组织工程的细胞载体。     

六味地黄丸对兔退变椎间盘髓核及纤维环的保护作用

目的探讨六味地黄丸对兔退变椎间盘髓核及纤维环细胞的保护作用。方法选择8月龄成年新西兰兔6只利用异常应力负荷及椎间失稳法建立新西兰兔腰椎椎间盘退变模型,病理切片确认模型成功后,取椎间盘分离软骨终板,将髓核及纤维环组织进行细胞培养,将生长良好的细胞随机分为对照组、损伤组与含药组。对照组细胞培养用胎牛血清体积分数为0.01的DMEM培养基;损伤组给予体积分数为0.01的胎牛血清与浓度为5μg/L的TNF-a混合的DMEM培养基;含药组为体积分数为0.01的六味地黄丸含药血清加体积分数为0.01的胎牛血清与浓度为5μg/L的TNF-a混合的DMEM培养基。使用细胞增殖—毒性检测试剂盒(CCK-8)检测各组兔退变椎间盘细胞增殖的影响。实时荧光定量PCR检测聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶-13基因的表达差别。结果对照组椎间盘细胞初期正常生长,增殖良好,随着时间延长,细胞数量减少,凋亡细胞数量增多,细胞外基质胶原减少,细胞形态变化快。损伤组能够明显抑制椎间盘软细胞的增殖,细胞及细胞外基质胶原数量减少明显,同时间点比较,细胞凋亡数量增多,与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05),而含药组细胞增殖缓慢,细胞数量下降缓慢,细胞凋亡数量减少,细胞外基质胶原成分下降不明显,3组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,损伤组椎间盘细胞蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达下调增加,基质金属蛋白酶-13基因表达上调明显。与损伤组比较,而六味地黄丸含药血清组椎间盘细胞蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达上调,基质金属蛋白酶-13基因表达下调,3组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论六味地黄丸含药血清能够抑制TNF-a诱导的兔退变椎间盘细胞损伤,起到延缓椎间盘损伤的作用。其机制可能与上调蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达及下调基质金属蛋白酶表达有关。     

白细胞介素1对体外培养小鼠骨髓基质细胞增殖及细胞周期的影响

目的研究白细胞介素１对小鼠骨髓基质细胞增殖的影响。方法取出小鼠骨髓基质细胞作原代培养，用［３Ｈ］ＴｄＲ参入法及ＭＴＴ法观察其增殖情况，利用流式细胞仪观察其细胞周期的变化。结果白细胞介素１在２５０×１０３～１０００×１０３ＵＬ－１范围内可促进小鼠骨髓基质细胞的增殖，并引起Ｓ期细胞的增多。结论白细胞介素１可促进体外培养的小鼠骨髓基质细胞增殖。     

SD仔鼠雪旺细胞的体外培养及转染NT—3基因的实验研究

目的 体外培养雪旺细胞并转染NT-3基因，观察转染后细胞的生物学行为。方法 用预涂有10％多聚赖氨酸的培养瓶体外原代和传代培养SD仔鼠雪旺细胞并用抗S-100多抗鉴定细胞性质，原代培养12小时后加入10-5M阿糖胞苷，72小时后换成100μg/ml的G-418，连续作用5天后加入2μM氟丝扣林继续培养。用脂质体法转染入质粒pIRES2—EGFP—NT—3，免疫细胞化学检测NT—3的表达并用图象分析法定量，观察转染NT—3细胞的形态和细胞周期的变化。结果 体外成功培养了SD仔鼠雪旺细胞，免疫细胞化学证实成功转染了NT-3基因，转染NT-3组有丝分裂期细胞数量较未转染组增高，但是细胞形态未见明显变化。结论 细胞转染NT-3基因后，细胞的有丝分裂增快，细胞增殖增快。     

雷帕霉素对肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨雷帕霉素对肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响。方法 体外培养肾小管上皮细胞(HK-2细胞),选择100, 200, 400, 800 ng/ml雷帕霉素作用于HK-2细胞24、48、72h。利用 MTT实验分析雷帕霉素对HK-2细胞增殖的影响,并计算各浓度及不同时间的增殖抑制率优化雷帕霉素作用的浓度和时间;选择最佳的作用浓度和作用时间处理HK-2细胞,通过流式细胞分析技术,分析雷帕霉素对HK-2细胞的凋亡的影响。结果 MTT实验显示不同浓度的雷帕霉素,对增殖有抑制作用,且表现浓度依赖性和时间依赖性;RAPA可以促进HK-2细胞的凋亡。结论 通过HK-2细胞模型研究,发现雷帕霉素可抑制肾小管上皮细胞增殖、促进细胞凋亡。