计算机辅助木糖还原酶定点突变的生物信息学分析

木糖还原酶（xylose reductase,XR）是木糖代谢生成乙醇途径中一个重要的酶,目前利用纤维素生成酒精的关键问题之一：木糖代谢过程中XR和木糖醇脱氢酶（xylitol dehydrogenase,XDH）的氧化还原不平衡。本研究借助生物信息学手段（酶三维结构建模、酶和辅酶分子对接）,充分分析数据库资源,找到了一些可能影响XR酶活性或辅酶依赖性的关键氨基酸。毕赤氏酵母XR与NADP之间有Lys21（K）、Val222（V）、Glu223（E）、Phe236（F）和Thr273（T）;毕赤氏酵母XR与NAD之间有Val222（V）、Glu223（E）、Phe236（F）、Glu237（E）和Thr273（T）;热带假丝酵母XR与NADP之间有Asn278（N）和Arg282（R）。对比两种辅酶与毕赤氏酵母XR形成氢键的氨基酸,如果使毕赤氏酵母XR只与辅酶NAD结合,则可以将Lys21替换成其它的氨基酸,因Lys21在所有XR序列中完全保守,需要进行氨基酸替代模拟计算预实验,在确保酶三维结构不变及NAD可以结合XR的前提条件下替代Lys21;如果使毕赤氏酵母XR只与辅酶NADP结合,则可以将Glu237（不完全保守）替换成其它的氨基酸。另外,还可以根据需要将这些形成氢键的氨基酸进行组合替代。要改变热带假丝酵母XR的NADP依赖性,可以替代Asn278（N）和/或Arg282（R）（不完全保守）。本研究为进一步酶的理性设计（提高活性及改变辅酶依赖性）并在分子水平上对木糖还原酶进行改造打下了基础。     

树干毕赤酵母木糖还原酶Lysine270定点突变的理性设计

Lysine270是树干毕赤酵母木糖还原酶(PsXR)与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)形成结合口袋的关键氨基酸之一.为研究该位点对PsXR辅酶偏好性的影响,用其它19种氨基酸替代Lysine270,构建19种不同的木糖还原酶(XR)突变子,利用同源建模和分子对接的方法评价不同突变子与NAD+或NADP+之间的相互作用,并从中选择突变子K270R和K270N进行实验验证.突变基因及野生基因用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)在大肠杆菌内进行诱导表达,经纯化后进行酶学性质研究.结果发现:K270R突变使得XR与NADP+的结合能力降低,米氏常数Km由0.025mmol/L升高到0.050mmol/L;K270N突变使得XR与NADP+不能结合.实验结果亦证实,通过理性选择得到的K270N突变子的辅酶依赖性由NADPH完全逆转为NADH.     

树干毕赤氏酵母木糖还原酶Lysine270突变的理性设计

木糖代谢过程中木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）的氧化还原不平衡是利用纤维素生成酒精的关键问题之一.前期研究发现Lysine270是形成树干毕赤氏酵母木糖还原酶（P. stipitis XR）与NAD(P)结合口袋的关键氨基酸之一.为研究Lysine270对P. stipitis XR辅酶偏好性的影响,本研究将Lysine270用其它19种氨基酸替代,构建19种不同的XR突变子,利用同源建模和分子对接的方法评价不同突变子与NAD(P)之间的相互作用,并从中选择两个突变子K270R和K270N进行试验验证.树干毕赤氏酵母木糖还原酶K270R、K270N突变基因及野生基因WT-XYL1分别在大肠杆菌中进行了表达,表达后的蛋白经His-Tag纯化柱纯化后再进行辅酶偏好性及酶学性质研究.结果发现,Lysine270突变直接影响XR与NAD(P)的Km值,通过理性选择得到的K270N突变子的辅酶依赖性由NADPH完全逆转为NADH.     

细胞粗提液中木糖还原酶的催化特性考察

研究从Candida Mogii细胞中,提取木糖还原酶（XR）的实验条件及XR的催化动力学,（1）当破碎停留时间为3min,离心转速为1200r.min^-1时,提取液中XR的酶活保留较好,（2）适当的K＋能够提高酶活,而Mg2 对XR有抑制作用。（3）所得粗提液中的XR具备一定的催化能力,可满足实际应用的要求。（4）所得粗提液中的XR半衰期约为50h,其稳定性还不足以实现长期连续催化生产。     

生物信息学法筛选催化茶黄素合成的天然多酚氧化酶

利用生物信息学方法从天然植物中筛选天然PPO酶源. 用PPO保守序列从Uniport中检索到529条植物源PPO,除去重复的和不完整的序列后,得到178条PPO序列. 用同源建模法,以甘薯PPO晶体结构（1BUG）为模板,构建各PPO的三维结构模型,经Procheck和Verify3D评价后,获得163个优质的PPO三维结构. 用TM-score(空间拓扑)和RMSD（结构叠合）对163个PPO与茶PPO（A6N8J4）的三维结构进行了相似性比较. 用Autodock Vina将 163个PPO与茶中四种主要儿茶素进行分子对接,根据酶与底物结合的亲和力（binding affinity）预测各PPO的活性,发现酶与底物的亲和力与酶的一级结构序列同源性和酶的三维结构的重叠度之间无直接关系. 从潜在的10种高PPO活性的植物材料中提取PPO、测定其茶黄素转化活性. 10种植物材料中均有PPO活性,其中沙梨和甘薯的PPO活性最高,且高于茶叶PPO活性. 甘薯资源极其丰富,可用于茶黄素的工业合成. 本研究表明,利用生物信息学法可以从大量酶的序列信息中成功筛选出高活性的酶,与传统的酶活性筛选法比,可大大提高筛选范围和效率.     

基因多位点定点突变法机理的探讨

用多个化学合成的寡聚脱氧核苷酸作为诱变引物，对枯草杆菌蛋白酸疼Ｅ基因进行体外突变，借此系统地探讨了基因多位点定占突变中引物的类型和数量、引物的分布、引物间的相互位置、引物与模板ＤＮＡ间摩尔数比等因素对突变效果的影响。     

MEKK3蛋白K391位点突变对其影响的生物信息学分析及活性鉴定

MEKK3是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的重要成员,主要参与激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases, JNK)和细胞外调节(extracellular regulated protein kinases, ERK)两条通路。利用生物信息学分析野生型MEKK3(MEKK3WT)及突变型MEKK3(MEKK3K391M)蛋白的理化性质、亲/疏水性、跨膜区、二/三级结构、相互作用蛋白等。结果表明,MEKK3K391M蛋白的稳定性增强,亲/疏水性最强位点未改变,α-螺旋、β-折叠及蛋白结合位点与MEKK3WT不同。三级结构分析显示,MEKK3K391M空间位阻增大。据GenBank提供的人源MEKK3的cDNA序列(NM_203351),扩增出野生型MEKK3WT目的基因,用重叠延伸PCR定点突变技术扩增突变型MEKK3K391M目的基因,并将其克隆至带有FLAG标签的真核表达载体pCMV-tag-2c中。DNA序列分析结果表明,MEKK3K391M基因序列成功将编码赖氨酸(Lys, K)的密码子AAG突变为编码甲硫氨酸(Met, M)的密码子ATG;免疫印迹分析显示,MEKK3WT、MEKK3K391M重组体均在PC12细胞中高效表达;MEKK3WT可以激活JNK,使JNK发生磷酸化反应,其条带灰度值明显高于对照组和MEKK3K391M组。MEKK3K391M组的P-JNK与对照组相差不大。总之,MEKK3中K391的氨基酸突变引起了蛋白结构和功能的改变,特别是三级结构的空间位阻加大,使MEKK3K391M与ATP结合能力减弱,从而无法呈递磷酸基团催化相应的底物,失去生物学活性。本研究对寻找神经系统疾病JNK通路中与MEKK3相互作用的蛋白分子、探索蛋白相互作用机制提供实验基础。     

环糊精水解酶cds1-3底物通道氨基酸的定点突变研究

本研究对具有大分子水解能力的环糊精水解酶cds1-3的蛋白结构进行分析,选取底物通道相关氨基酸进行定点突变。通过比较突变酶和野生酶的功能差异,定位决定cds1-3特殊功能的氨基酸。采用sybyl 1.2进行蛋白质底物结合分析,选取和多聚体形成、底物结合以及底物通道相关的氨基酸Glu66、Pro48、Phe289为突变位点,反向PCR构建pSE380/E66G、pSE380/P48H、pSE380/F289A表达质粒并进行表达,获得酶活突变体并与原始酶进行底物特异性比较分析。其结果显示,突变酶E66G降解大分子底物木薯淀粉和支链淀粉的相对酶活力分别提高26.96%和23.15%,而对小分子底物普鲁兰糖的水解能力下降13.14%。因此,cds1-3是一个能水解大分子底物的特殊环糊精水解酶,氨基酸Glu66是cds1-3水解大分子支链淀粉的关键氨基酸之一。     

木糖还原酶基因在大肠杆菌中活性表达

利用聚合酶链式反应(PCR)方法,从休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)基因组 DNA 扩增得到了木糖还原酶(Xylose Reductase, XR)基因,并在大肠杆菌中活性表达.重组菌在诱导6 h 时的XR 表达量最大,约为总蛋白的20%.实验考察不同质量浓度的乳糖和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对酶活性的影响,结果表明,重组菌在以乳糖作为诱导剂时酶活最高为232.38 μkat·g-1,以 IPTG 作为诱导剂时酶活最高为206.04 μkat·g-1.     

蛋白质分子的定点突变和化学修饰

回顾蛋白质工程研究及应用技术、手段和方法,分析定点突变及化学修饰在改造蛋白质分子结构与功能方面的异同。定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法与使用化学因素导致突变的方法相比,具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。     

快速点突变的优化方法

DNA传统的快速点突变方法即"一步突变法"虽然可使DNA产生突变,但效率不高.市场上出售的快速点突变试剂盒,其突变效率可达80%以上,然而价钱昂贵.本文论述的快速点突变方法,在传统的"一步突变法"基础上做了改进,通过对引物突变点5′端序列Tm值的确定,使引物设计变得简单,初学者可轻松完成DNA的定点突变,而且大大降低了成本,适用于对大量DNA进行定点突变试验.试验结果表明:这种经过改良的方法突变率为96.22%,可为研究人员的试验带来便利,是一种值得推广的新方法.     

发酵木糖高产乙醇树干毕赤酵母菌株的Co60诱变选育

【目的】选育能够利用木糖高产乙醇的酵母菌株。【方法】采用Co60诱变树干毕赤酵母(Pichia stipitis),筛选乙醇产量高的突变菌株,并对原始菌株、突变菌株的生长发酵特性和两个菌株对高浓度木糖、乙醇的耐受性进行比较。【结果】在YPX培养基上筛选获得1株能够高效发酵木糖的突变菌株1K-9。该菌株在50mL 15%FM发酵84h,发酵液乙醇含量最高达(51.034±0.112)g/L,比原始菌株提高10.05%;在500mL 15%FM发酵96h,乙醇含量最高达(51.390±0.119)g/L;在500mL 20%FM发酵156h,乙醇含量最高达(52.496±0.513)g/L。菌株1K-9在HSM培养基或含4%~5%乙醇的YPX培养基中生长良好,在含6%~7%乙醇的YPX培养基中生长缓慢。【结论】Co60诱变对于树干毕赤酵母(Pichia stipitis)菌株是有效的,能选育出木糖高产乙醇酵母菌株1K-9。     

硫氧还蛋白还原酶结构分形研究

提出并应用改进的分形方法对硫氧还蛋白还原酶(TrxR)结构进行研究。建立了适用于TrxR的分形及数据处理方法。发现正常的TrxR的结构分维值约为1.33,氧化后结构分维值增大。提出了蛋白质结构分维值是表征蛋白质分子状态的重要特征之一的观点,并结合TrxR验证了该观点。提出了药物分子分维值应与靶酶的结构分维值相契合的观点,并结合以TrxR为靶点的药物研发实验验证了该观点。     

硫氧还蛋白还原酶结构分形研究

提出并应用改进的分形方法对硫氧还蛋白还原酶（TrxR）结构进行研究。建立了适用于TrxR的分形及数据处理方法。发现正常的TrxR的结构分维值约为1.33,氧化后结构分维值增大。提出了蛋白质结构分维值是表征蛋白质分子状态的重要特征之一的观点,并结合TrxR验证了该观点。提出了药物分子分维值应与靶酶的结构分维值相契合的观点,并结合以TrxR为靶点的药物研发实验验证了该观点。     

拟南芥AHA2基因的生物信息学分析

利用生物信息学方法对拟南芥AHA2(H+-ATPase 2)基因编码蛋白的理化性质、保守结构域、疏水性/亲水性、信号肽、跨膜结构域、磷酸化修饰、二级结构和系统进化等进行了预测和分析。结果表明:AHA2属于拟南芥H+-ATPase家族成员;拟南芥AHA2基因编码的蛋白与荠菜的亲缘关系最近,具有较高的相似性。本研究的结果将为进一步研究其生物学功能提供一定的参考依据。     

木糖发酵菌株的筛选

本实验利用传统的方法从森林土样中分离筛选出一株能有效发酵木糖生产乙醇的酵母菌株。首先通过富集培养、初筛、复筛等步骤筛选出一株（1#菌株）能够利用木糖的酵母菌株,对其进行了生理生化性能指标试验,初步鉴定为假丝酵母菌（Candida sp.）。并对其进行了利用木糖发酵乙醇试验,实验结果表明：在培养温度为30℃,pH5.0,接种量为10％左右,初始木糖浓度为40g/L时,该菌株可以利用木糖发酵生产乙醇,产乙醇量为1.06g/100mL,相当于理论转化率的56.9%。