长臂光敏生物素和光敏地高辛核酸探针检测医学真菌灵敏度的比较研究

建立应用长臂光敏生物素核酸探针和光敏地高辛核酸探针杂交。检测真菌的方法，并比较二者检测临床常见医学真菌的敏感性。设计并合成医学真菌通用引物，用PCR扩增白色念珠菌标准株的核糖体RNA基因，用长臂光敏生物素或光敏地高辛标记其纯化的扩增产物制备成相应的核酸探针，然后用上述两种探针对标本中的PCR扩增产物进行Southern杂交，检测医学真菌。通过用白色念珠菌感染大鼠，建立念珠菌病的实验动物模型，验证血培养法、PCR法和PCR扩增结合Southern杂交，检测真菌的敏感性。结果表明，这两种核酸探针可分别与白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌、黄曲霉菌、烟曲霉菌等9种真菌杂交呈阳性结果：与临床常见的细菌、病毒和哺乳动物组织细胞DNA杂交结果为阴性。利用实验动物模型比较了血培养法、PCR法和PCR扩增结合长臂光敏生物素核酸探针Southern杂交法检测真菌血症的灵敏度，实验证明后者的敏感性最高。总之，应用长臂光敏生物素核酸探针和光敏地高辛核酸探针与标本PCR扩增物杂交，检测上述真菌既特异和敏感，又不需放射性同位素。光敏地高辛核酸探针检测医学真菌的灵敏度略高于长臂光敏生物素核酸探针。     

PCR引物浓度对寡核苷酸液相杂交的影响

目的考察PCR引物浓度配比对液相微珠杂交效率的影响,寻求具有较强杂交信号和较好稳定性的PCR引物浓度配比。方法建立HLA-DRB1等位基因的相关数据库,选择在HLA-DRB1位点的第二外显子上设计探针,并且选择其保守序列作为阳性对照探针(DPC2),DPC2探针中间位点T突变成A作为阴性对照探针(DNC)。分别针对标本C2-008、C2-024、C2-025的等位基因序列设计出6条约21bp的寡核苷酸探针,各探针5’端用氨基(NH2)修饰。通过引物浓度梯度配比(1:100、1:50、1:20、1:8、1:4、1:2、1:1),对型别已知的细胞株DNA进行PCR扩增并得到目的片段(1:100配比除外),在相同条件下将PCR产物与寡核苷酸探针进行液相杂交检测。结果浓度配比为1:1的对称式扩增产物杂交结果不理想,而浓度配比分别为1:20、1:8、1:4、1:2的不对称扩增均得到了待检单链、双链DNA混合物,其中1:4浓度配比具有最好的扩增效率和稳定性。根据阳性信号与阳性标本是否相符表明:引物浓度配比为1:100的不对称PCR和1:1的对称PCR检测效果差,易出现假阴性;1:2、1:4、1:8、1:20配比检测效果较好,比较稳定。结论PCR引物浓度配比影响液相微珠杂交效率,不对称PCR产物有利于提高杂交效率,为快速成功配制PCR试剂奠定了基础,有利于寡核苷酸液相芯片的应用。     

鼠艾滋病病毒荧光定量PCR标准品RNA的构建

目的合成构建鼠艾滋病病毒（FLV）荧光定量检测标准品,明确核糖核酸（RNA）标准品体外合成的基本原则。方法通过序列对比,找到FLV最为保守的区段作为RNA标准品的合成目标,进行逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增,克隆于T载体,测序,设计带有T7启动子的引物,PCR扩增,将所得的PCR产物凝胶回收纯化,用T7RNA聚合酶进行体外合成RNA,最后用PCR和电泳检测验证。结果成功合成了FLV荧光定量PCR标准品。结论FLV荧光定量标准品的成功合成必须遵守以下4条基本原则：①选择保守序列;②设计引物时将潜在的终止密码或起始密码排除在PCR目标产物之外;③将启动子（如T7启动子）挂在适当的引物上,保证所合成的RNA模板与所要定量检测的RNA模板一致,而不是互补;④合成RNA后必须检测,以保证不含其他RNA或者未消化完的DNA。     

线粒体多态性检测寡核苷酸芯片的构建

目的构建用于线粒体DNA（mtDNA）D-环控制区（D—LOOP区）多态性多个位点集成检测的寡核苷酸芯片。方法根据GenBank中人mtDNA D—LOOP区序列设计2组引物[普通引物和N,N＇-对羧苄基吲哚三菁（Cy5）标记引物]和55种寡核苷酸探针。将探针固定于醛基修饰载玻片表面,制备mtDNA多态性检测芯片。提取40例健康人外周血标本mtDNA,应用Cy5标记引物不对称PCR扩增mtDNA D—LOOP区片段。取未变性和变性后扩增产物分别与芯片进行杂交,观察二者杂交信号强度差异,并将芯片检测结果与DNA测序结果进行比较。观察等倍稀释的不对称PCR扩增产物的杂交信号强度,检测芯片的灵敏度;将DNA测序结果与探针进行BLAST2比对,找出与PCR扩增产物完全匹配和仅1个碱基不匹配的探针,分析二者在芯片上相应位点杂交信号强度的差异,观察芯片的特异性;以放置6个月后的芯片检测外周血mtDNA,观察杂交信号强度的变化。结果不对称PCR扩增获得的mtDNA D—LOOP区片段（466bp）与预期表达片段大小一致。不对称PCR扩增产物直接杂交和变性后杂交的信号强度无明显差异,40例健康人外周血标本mtDNA的芯片杂交检测结果均与DNA测序结果完全吻合。灵敏度检测结果显示,杂交信号强度随扩增产物稀释程度的增加而减弱,芯片检测靶分子的灵敏度为0．1ng;与DNA测序结果完全匹配的探针174和仅相差1个碱基“C”的探针174c的杂交信号强度具有明显差异;而保存6个月后的芯片杂交信号强度基本保持不变。结论构建的寡核苷酸芯片可满足对mtDNA D—LOOP区多态性进行多个位点快速通量检测的需要,具有较高的灵敏度和特异性,适用于法医鉴定及线粒体疾病的检测。     

登革病毒悬液芯片分型检测方法的建立

目的 建立一种基于悬液芯片的登革病毒(dengue virus,DV)检测方法,可对四种血清型登革病毒进行快速检测和鉴定.方法 依据GenBank上4种病毒的基因序列信息,设计并合成相关引物及探针序列.抽提病毒RNA,经反转录后对目的基因进行PCR扩增,产物与核酸探针微球组杂交后于Bio-PlexTM 200系统检测荧光信号值.结果 DV1的悬液芯片检测敏感性约9 DNA拷贝,DV2、DV3、DV4的悬液芯片检测敏感性约90 DNA拷贝.进而将本方法用于检测15份临床标本,其检测结果与分型荧光RT-PCR一致.结论 建立了可同时检测四种血清型登革病毒的悬液芯片检测方法,为快速筛查和鉴定登革病毒提供了新的手段.     

Taq聚合酶逆转录并直接扩增细胞RNA

几年来的实践表明,PCR技术是基因分析中的一种十分有用的手段。近来结合mRNA逆转录为cDNA方法,应用PCR技术分析基因转录体(RT-PCR)。作者在用PCR技术分析基因组DNA过程中,注意到时常出现相应于cDNA片段大小的扩增产物,因而作者推测,Taq聚合酶直接合成并扩增了cDNA片段。为了证明Taq聚合酶能逆转录RNA模板,从末稍血分离4μg总RNA,用Taq聚合酶进行40轮的PCR扩增,所用引物为与人β血影蛋白cDNA 0.4kb两侧互补的寡核苷酸引物。在另一反应管中,同时用1μg基因组DNA用同一引物进行PCR扩增。PCR反应产物电泳分析表明,前者可是0.4kb扩增片     

脊髓灰质炎病毒单链RNA和双链RNA在去核细胞中的不同感染性

脊髓灰质炎病毒在细胞内复制过程中,产生一种复制中间体(replieative form RNA),简称RF。即可能是一个带有基因组的正链和一个互补的负链组成的一个完整的双链RNA分子,这种复制中间体的感染性问题,正在引起人们的注意。一般认为带有单链RNA的病毒粒子对细胞感染     

脊髓灰质炎病毒的多尿苷酸聚合酶和RNA复制酶具有同样的病毒多肽

脊髓灰质炎病毒的基因组是单链RNA,在感染的细胞质内借助于依赖RNA的RNA聚合酶(复制酶)进行复制。这种复制酶可能会有一种或多种病毒编码的蛋白质,但证据还不充分。作者曾分离到一种可溶性的脊髓灰质炎病毒特异的依赖RNA的RNA聚合酶,多尿苷酸聚合酶,     

分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：分化型胚胎软骨基因1可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子,与肿瘤的发生发展有着重要的联系。 目的：构建针对人分化型胚胎软骨基因1的小干扰RNA表达载体。 方法：从NCBI中查找人分化型胚胎软骨基因1基因全长mRNA序列,利用Katahdin提供的在线小干扰 RNA模板序列设计软件,设计针对分化型胚胎软骨基因1的2条shRNA 的 DNA 模板单链,合成靶向分化型胚胎软骨基因1基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒连接,在JM-109菌株中扩增,并进行质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR以及测序鉴定。 结果与结论：将含有分化型胚胎软骨基因1目标序列25 bp 的双链 DNA插入片段,连接到pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒形成重组质粒。质粒DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可用于后续实验。菌落PCR结果表明产物大小约为170 bp,与预期相符。测序结果表明pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1的干扰合成片段,无碱基突变。成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰 RNA表达载体。     

HCV RNA定量检测方法研究进展

本文介绍极限稀释法、b DNA技术、竞争性 PCR、Amplicor PCR.、Amplisensor PCR和荧光标记探针杂交 PCR等六种核酸定量方法的基本原理 ,对其定量检测 HCV RNA的敏感性、特异性、检测范围、重复性等进行比较 ,评价各方法的优缺点 ,并对 HCV RNA的定量检测方法作一展望。