海产品中副溶血弧菌检测方法研究进展

副溶血弧菌是主要的食源性致病菌之一,主要存在于鱼虾贝等海产品中。人们在食用被副溶血弧菌感染的海产品时,容易出现腹泻、呕吐、腹痛等急性肠胃炎症状。本文主要介绍了副溶血弧菌的分子生物学、免疫学等几种快速检测方法,并对未来的发展前景做了展望。      

海产品中副溶血弧菌的LAMP-HNB快速检测技术

采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)并结合指示剂-羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)的应用,即LAMP-HNB快速检测海产品中副溶血弧菌的新方法进行了研究。首先,针对副溶血弧菌tlh基因设计特异性引物,并在反应体系中加入1μL HNB(反应浓度150μmol/L)作为反应指示剂,根据反应体系颜色变化判断反应结果,并同时将产物进行凝胶电泳验证结果,通过PCR平行实验对比,实证LAMPHNB法的反应灵敏度和特异性。结果表明,LAMP-HNB新法与PCR方法的特异性没有差异,但是,LAMP-HNB新法的灵敏度是PCR的10~100倍。经海产品实际检测验证,LAMP-HNB新法与PCR法和国标法的检测结果一致。因此,LAMP-HNB新法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等特点,更适用于海产品处理现场的检测。     

双重DPO-PCR检测副溶血弧菌和霍乱弧菌

根据副溶血弧菌collagenase基因和霍乱弧菌omp W基因,分别设计特异性DPO（dual priming oligonucleotide）引物,建立一种快速检测这两种弧菌的多重DPO-PCR方法,并对其特异性和灵敏度进行了评价。结果显示,设计的DPO引物特异性较强,副溶血弧菌和霍乱弧菌DNA可分别扩增出307 bp与463 bp的特异性条带,检测灵敏度均达0.1 ng/μL。该检测方法对退火温度不敏感。利用该方法对69株疑似弧菌菌株进行鉴定,结果与生理生化鉴定结果一致。该方法特异性强、灵敏度高,适合于对食品、水产品等中副溶血弧菌和霍乱弧菌的进行快速筛检。      

烟台海域海产品中副溶血弧菌的膳食 暴露风险定量评价

目的获得烟台海域海产品中副溶血弧菌的(Vibrio parahemolyticus,VP)致病风险值,量化描述海产品中VP的膳食暴露风险。方法以贝塔-泊松模型(Beta-poison)作为剂量-反应模型,运用@Risk软件拟合海产品中VP的概率分布以及计算基于蒙特卡罗模拟的量化风险值。结果烟台15~64岁居民摄食单份(可食部,100 g/份)海产品的VP发病总体风险均值为3.824×10-5,年均发病率为0.00502次/人·年。贝类致病风险均值和年均发病率最高,分别为1.027×10-4、2.14×10-3。致病风险均值和年均发病率由大到小为:贝类其他类海藻类头足类甲壳类鱼类。7~9月份海产品中VP的致病风险均值和人均发病率分别为9.673±6.631×10-5和0.00633±0.00434次/人·季度,远高于4~6月份和10~11月份。结论烟台海域海产品中存在VP致病风险,贝类中VP致病风险值较高,7~9月份是高风险时间节点;海产品中VP污染是引起烟台常住居民食源性疾病的主要病原菌之一,尤其夏季控制海产品中VP的污染量,能够有效的降低VP致病风险。     

海产品中副溶血弧菌的分离和PCR检测

为了建立一种快速、特异的PCR方法检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp),根据Genebank库中收录的Vp的tlh基因序列进行引物设计,应用PCR技术扩增tlh基因。利用TCBS和TSI2种选择性培养基从海产品总分离出68株疑似副溶血弧菌,经生化鉴定68株均为副溶血弧菌。用Chelex100法提取基因组DNA,进行tlh基因的PCR检测,tlh基因在不同副溶血弧菌中都广泛存在,而大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等其他食源性致病菌均为阴性。tlh基因具有种属特异性,因此可以用来检测副溶血弧菌。     

LAMP技术快速检测海产品副溶血弧菌的条件优化

本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素tlh为目标基因设计特异性引物,优化反应条件,并对特异性、灵敏度进行了验证。LAMP最佳反应条件为,外内引物浓度比为1∶8,Mg2+反应浓度为4 mmol/L,d NTPs浓度为3.5 mmol/L,温度为65℃,反应时长为1 h,只对副溶血弧菌产生扩增反应,与其余细菌不产生扩增反应,细菌基因组DNA和纯培养物的灵敏度约为5.45×101 fg/μL和140 cfu/m L,对人工污染食品样品进行检测,检出限为2.8×102 cfu/m L。该方法反应时间短、特异性强、灵敏度高。      

巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,食用了该菌污染的海产品可导致胃肠炎等疾病。为了建立一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法,通过把副溶血弧菌基因组序列和其它不同种类弧菌的基因组序列进行比较分析,筛选出了一个副溶血弧菌特异性的标记基因-VP1331,根据该基因建立了副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,并评估了其特异性、敏感性和稳定性。实验结果表明,该方法只有在以副溶血弧菌基因组DNA为模板时才能扩增出目的片段,而其它11种弧菌和非弧菌均不能扩增出目的片段。该方法的最低检测限为副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。人工污染实验表明,初始菌液浓度为25.7 CFU/100 mL时只需经过2 h的增菌培养即可检出。上述结果表明,VP1331基因可以作为副溶血弧菌种特异性标记,本方法可以用于污染海产品中该菌的检测与鉴定。     

海产品中副溶血性弧菌检测能力验证分析报告

目的通过参加英国FAPAS分析实验室组织的海产品中副溶血性弧菌检测能力验证,对其实验结果出现的异常现象进行分析,找出导致本次能力验证组织失效的原因。方法按照GB 4789.7-2013、SN/T1870-2016及相关作业指导书等进行实验,通过采用本实验室经常采用的检测方法进行检验,对实验出现的异常结果进行分析。结果发现M224d21A和M224d21B这2个冷藏运输箱包装的冻干样品由于储藏和运输等问题,导致未检出副溶血性弧菌。结论此次能力验证分析对于我院在海产品中副溶血性弧菌检测方面技术水平的提高和品牌形象的确立起到了积极作用,同时也为检验工作者对于能力验证出现异常现象提供一种解决问题的新思路、新方法。     

锦州笔架山海域海产品中副溶血弧菌的分子流行病学调查

为了解锦州笔架山周边海域海产品中副溶血弧菌的污染状况,实验室随机采集了蓝圆鲹等共103份常见的海产品,按照GB/T 4789.7-2008及PCR方法对副溶血弧菌进行了分子流行病学调查。结果显示,随机抽检的103份样品中,检测出含副溶血弧菌的样品38份,检出率为37%。这表明,锦州笔架山周边海域常见海产品受副溶血弧菌污染十分严重,具有极大的食品安全隐患。     

双重LAMP技术快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法学研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)同时快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法。针对副溶血性弧菌tox R和霍乱弧菌omp W基因设计特异性引物,优化反应条件,建立水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的检测方法,并同时应用双重LAMP技术和PCR技术对实验菌株进行副溶血性弧菌和霍乱弧菌检测,比较两种方法的特异性和灵敏度。LAMP的最佳反应温度为61℃,在此条件下,双重LAMP检测技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌DNA的敏感度可达3.12 fg,且与其他常见的细菌株无交叉反应,特异性为100%;对模拟食品样品进行直接检测时检测限为50 cfu/m L;对60份水产样品进行检测时,6份样品出现LAMP及PCR阳性,而传统培养方法检测出4份阳性。实验结果表明所建立的双重LAMP技术在检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌时灵敏度、特异性高,时间成本低,适合于水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的快速检测。     

大连市不同海产品中副溶血性弧菌污染的健康风险分级研究

目的对大连市不同海产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VP)污染的健康风险进行分级和评价。方法 2017年1～10月,在大连市10个县市区分层随机采集4类944份常见海产品。依据GB 4789.7—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》进行海产品中VP定量检测,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法进行VP毒力基因检测;采用食物频率法获得各类海产品的消费量数据;利用专家咨询法获得海产品交叉污染和烹调习惯参数;采用快速微生物定量风险评估(sQMRA)方法,对4类海产品中致病性VP的健康风险进行分级。结果甲壳类导致人体感染致病性VP发病风险和年发病例数最高,分别为3.5×10~(-6)和2 799.3例。鱼类导致人体感染致病性VP发病风险和年发病例数居第二位,分别为1.1×10~(-6)和1 304.4例。海产品导致人群VP发病的主要途径为交叉污染。结论应关注大连市甲壳类中VP对人群的致病风险,重点控制海产品在加工处理过程中VP的交叉污染。     

Vibrio species involved in seafood-borne outbreaks (Vibrio cholerae,V. parahaemolyticus and V. vulnificus): Review of microbiological versus recent molecular detection methods in seafood products

Seafood products are widely consumed all around the world and play a significant role on the economic market. Bacteria of the Vibrio genus can contaminate seafood and thus pose a risk to human health. Three main Vibrio species, V. cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnificus, are potentially pathogenic to humans. These species are responsible for a dramatic increase of seafood-borne infections worldwide. Hence, early detection of total and pathogenic Vibrio is needed and should rely on quick and effective methods. This review aims to present the standard methods FDA-BAM, ISO/TS 21872–1:2007 and TS 21872–2:2007 and compare them to recent molecular biology methods including endpoint PCR, quantitative real-time PCR (qPCR) and PCR-derived methods with a focus on LAMP (loop-mediated isothermal amplification). The available methods presented here are dedicated to the detection and identification of the Vibrio species of interest in seafood.     

北京口岸进口鲜活海产品中副溶血性弧菌致病性分析

目的调查从北京口岸进口的鲜活海产品中是否存在致病性副溶血性弧菌。方法对2005年从北京口岸进口的鲜活海产品中分离的267株副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的尿素酶活性、神奈川现象和毒性基因（tdh和trh）进行了检测。结果267株副溶血性弧菌中27株尿素酶呈阳性，其中14株菌tdh基因和砌基因呈阳性。tdh基因和trh基因呈阳性的14株菌中有10株菌神奈川现象为阳性，并且全部分离自从加拿大进口的象拔蚌。结论北京口岸进口的鲜活海产品中存在致病性副溶血性弧菌，主要集中在象拔蚌中。应对从加拿大进口的象拔蚌加强监管，防止致病性副溶血性弧菌引起食物中毒发生。     

海产品副溶血性弧菌控制研究进展

副溶血性弧菌是引起海产品食物中毒的主要致病因子。文章拟从物理、化学和生物三个方面对海产品中的副溶血性弧菌现有的控制措施进行概述,并展望未来的发展方向,以期为相关技术的应用和后续研究提供借鉴。     

风险分级矩阵在贝类海产品中副溶血性弧菌风险评估的应用研究

目的 研究风险分级矩阵方法学应用以及我国沿海地区居民贝类海产品中副溶血性弧菌污染的健康风险等级.方法 利用贝类海产品消费量以及副溶血性弧菌污染等数据,计算危害严重性(5分制)和疾病发生可能性(5分制)参数,导入风险分级模型矩阵,对我国沿海地区不同人群副溶血性弧菌健康风险进行赋值和等级评价.结果 我国沿海地区全人群和贝类...     

Evaluation of a Double Layer Agar Plate For Direct Enumeration of Vibrio parahaemolyticus

A double layer agar plate (DLAP) was developed according to the thin agar layer (TAL) method as a 1‐step procedure for direct enumeration of injured Vibrio parahaemolyticus cells based on the formation of unique purple colonies by V. parahaemolyticus. The DLAP was prepared by overlaying an equal volume (10 mL) of a nonselective medium (tryptic soy agar supplemented with 1.5% NaCl) onto a selective medium (Bio‐Chrome Vibrio medium). The DLAP was capable of detecting V. parahaemolyticus in mixed cultures containing non‐Vibrio bacteria. Production of purple colonies by V. parahaemolyticus on DLAP was not affected by the growth of other bacteria, even when V. parahaemolyticus was only a small fraction (5%) of the entire bacterial population. Direct plating on DLAP was found as effective as the most probable number (MPN) method for recovering heat‐and cold‐injured V. parahaemolyticus cells, which could not be detected by direct plating on Bio‐Chrome Vibrio medium or thiosulfate‐citrate‐bile salts‐sucrose agar. The DLAP offers an alternative to the MPN method for detecting injured V. parahaemolyticus cells and can be used as a simple 1‐step procedure for quick screening of V. parahaemolyticus in foods.     

Occurrence of Vibrio parahaemolyticus in Two Oregon Oyster-growing Bays

ABSTRACT: Occurrence of Vibrio parahaemolyticus in 2 Oregon oyster-growing areas (Yaquina andTillamook Bays) was studied from November 2002 to October 2003. Vibrio parahaemolyticus was detected in 15.0% of oyster, 20.0% of seawater, and 47.5% of sediment samples with very low levels of pathogenic strains being detected in oysters (≤3.6 most probable number [MPN] /g). The densities of total and pathogenic V. parahaemolyticus were higher in sediment (≤1100 and ≤43 MPN/g) than in seawater (≤15 and ≤3.6 MPN/100 mL) or oyster (≤43 and ≤3.6 MPN/ g). Densities of V. parahaemolyticus in both bays were positively correlated to water temperatures ( P < 0.01), with higher densities in samples being detected in summer, especially July and August. There was no correlation between the densities of V. parahaemolyticus and water salinity or the densities of V. parahaemolyticus and bacterial populations in seawater. Freshly harvested oysters should be kept at refrigeration temperatures to prevent rapid growth of pathogenic V. parahaemolyticus in contaminated oysters.