GM-CSF和rhBMP-2m对小鼠急性放射损伤的治疗作用

0 引言 我们曾报道[1]重组人骨形成蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m)对小鼠急性放射损伤有治疗作用,其机理与它促进放射损伤后骨髓细胞造血功能的恢复有关. GM-CSF是公认的造血生长因子,它对放射损伤有较好的治疗作用[2]. 我们旨在比较GM-CSF和rhBMP-2m对小鼠急性放射损伤的治疗效果.     

人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达

目的 制备含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因的真核表达质粒，获得可稳定高效表达BMP-2的兔骨髓基质细胞，为进一步研究BMP-2在骨牵张区的成骨作用作准备。方法 制备携带有hBMP-2的全长真核表达质粒pcDNA3.1-BMP2。通过脂质体法将所得到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中，用G418进行梯度筛选，从而得到能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨髓基质细胞（MSCs）hBMP-2 mRNA的表达。结果 重组质粒通过EcoRI酶切后，电泳图示约1.5kb的hBMP-2的目的片段及5.5kb的载体片段，经测序显示核苷酸序列正确无误。经RT-PCR检测hBMP-2在转录水平mRNA的表达情况，提示转染组hBMP-2的mRNA量较空白对照组明显增加。结论 成功制备了含hBMP-2基因的真核表达质粒，转染后获得了高效表达hBMP-2的兔骨髓基质细胞。     

rhBMP-2 cDNA转染的NIH-3T3细胞和rhBMP-2m对小鼠急性放射损伤的治疗作用

0 引言我们曾报道[1,2]重组人骨形成蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m)和rhBMP-2 cDNA转染的NIH-3T3细胞对小鼠急性放射损伤有治疗作用,其机制与它促进放射损伤后骨髓细胞造血功能的恢复有关.     

BMPs Ⅱ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定

0　引言　骨形成蛋白 (BMPs)不仅在骨 ,软骨及与骨骼有关的结缔组织的形成上有重要作用 ,而且起着十分重要的调控作用 [1 ] .与其他 TGF- β超家族成员一样 ,BMPs在细胞表面与 BMP的 , 型受体相互作用 , 型受体可以和过量的配体结合 ,而 型受体与配体的结合则是特异性的 [2 ] .t BRK3k为 BMPs 型突变受体 ,其可以阻断 BMP的信号转导 ,这样 ,BMP就无法发挥其骨诱导及在胚胎发育 ,器官形成及细胞分化中的作用 .因此 ,为研究 BMPs信号转导在组织发育和细胞分化中的作用 ,我们构建了 BMPs 型突变受体的真核表达载体 ,为此方面研…     

人骨形态发生蛋白-2基因腺病毒载体异位成骨

目的：评价人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)基因腺病毒表达载体(recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene, AdBMP-2)成骨能力并探讨其成骨机制。方法：应用 AdBMP-2体外感染兔骨髓间质干细胞（BMSC），7 d后观察hBMP-2和碱性磷酸酶(ALP)的表达,21 d后观察感染细胞钙结节形成能力。同时将AdBMP-2行裸鼠腓 肠肌组织内注射，术后20 d取材，观察hBMP-2的表达及肌组织内异位成骨情况。结果：AdBMP-2可高效感 染BMSC并获得hBMP-2的有效表达，ALP表达增高并形成钙结节。AdBMP-2在体内同样表达hBMP-2， 并且以软骨化骨的方式启动成骨。结论：感染AdBMP-2的BMSC向成骨细胞分化，AdBMP-2在体内有着良好的成骨能力。     

hBMP7瞬时转染对兔骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

[目的]运用人骨形成蛋白hBMP7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因体外转染兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响.[方法]密度梯度离心法培养兔MSCs,在体外分别转染pcDNA1.1/AMP-hBMP7和pcDNA1.1/AMP并留置空白对照.检测转染基因的转录和表达,观察细胞形态和生长情况,检测碱性磷酸酶、钙结节和骨钙素等成骨细胞表型.[结果]hBMP-7基因存在于转染后的骨髓间充质干细胞中并表达相应的mRNA.目的基因表达后细胞形态略有变化,生长曲线与未诱导组无明显变化,钙结节形成,碱性磷酸酶增加,骨钙素表达增强.电镜见胞质中有钙质成分.[结论]hBMP-7基因可促进兔MSCs向成骨细胞表型转化.hBMP-7基因转染的MSCs有望成为组织工程化骨理想的种子细胞.     

真核双表达载体pIRES-hVEGF121 cDNA/hBMP-4的构建与鉴定

目的构建人血管内皮生长因子(hVEGF121)和人骨形态发生蛋白-4(hBMP-4)的真核双表达质粒,转染COS-7细胞并表达。方法将hVEGF121 cDNA和hBMP-4通过非定向和定向克隆至真核双表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4,经酶切鉴定后,转染COS-7细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测。结果真核双表达载体pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4构建成功且hVEGF121cDNA和hBMP-4在COS-7细胞中得到了有效表达。结论hVEGF121和hBMP-4在COS-7细胞中成功表达,为进一步研究打下良好基础。     

人骨形成蛋白2,3成熟肽削短/突变体的构建与表达及其诱骨活性

0　引言　骨形成蛋白［1］(bone morphogenetic proteins, BMPs)是属于TGF-β超家族的成员,目前已有18个hBMP基因被克隆. 除BMP-1外,其他BMPs在胚胎时期骨组织分化发育、成年骨损伤修复、胚胎发育期中胚层的诱导和分化以及神经系统的发育和修复等方面都起着重要作用［2-4］,因而BMPs有十分乐观的临床应用前景. 利用E.coli表达的不同的长于成熟肽的羧端肽经复性后均具有不同程度诱骨活性［5,6］,但对短于成熟肽的肽段及其氨基酸组成与其生物学活性的关系,尚未见报道. 在上述工作的基础上,本研究在大肠杆菌中表达削短和突变的hBMP-2,3成熟肽,测试其活性,以探索其结构与功能的关系,并期望为获得更好的新型的基因工程hBMP2,3提供依据,为深入研究hBMP-2,3生物活性的分子机制和临床应用打下基础.     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的构建人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell,MSCs)mRNA的表达。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67,制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞,采用原位杂交、RT-PCR检测hBMP-7mRNA在MSCs中的表达。结果成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体,经hBMP-7基因转染的MSCs可表达外源性BMP-7mRNA。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

重组人骨形态发生蛋白—2在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2)，方法：hBMP-2原核表达载体pYR(pBV220-hBMP-2)转化E.coli BL21,SDS-PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系。离子交换层析DEAE和分子筛S－300纯化重组蛋白，自然缓降复性法对其复性。结果：SDS－PAGE显示在相对分子质量约为13000时出现明显外源蛋白表达带，而且当工程菌30℃活化至D600约为0．45时，其表达效率较高，在此状态下，温度诱导表达4h，目的蛋白表达量最高，以后随着时间的延长，表达量销下降，重组蛋白经纯化后植入小鼠肌肉，组织学观察到肌肉内大量间充质细胞增生以及软骨与骨形成，结论：重组hBMP-2具有良好异位成骨活性。