EG5和BCR/ABL在慢性粒细胞白血病中表达及其临床意义

目的观察驱动蛋白EG5 mRNA在正常人外周血和骨髓中的表达情况,探讨其在各期慢性粒细胞白血病（CML）中的表达及与BCR/ABL mRNA表达的相关性,评估EG5 mRNA在CML诊断和预后分析中的应用价值。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测EG5 mRNA和筑巢式逆转录聚合酶链反应（Nested-RT-PCR）检测BCR/ABL mR-NA,分别对8例正常人外周血及骨髓样本和62例CML患者的外周血样本进行检测。结果正常外周血标本中未检测到EG5的表达,正常骨髓标本中可见EG5的低丰度表达;EG5辅助诊断CML的敏感度和特异性分别为89.6%（26/29）和84.8%（28/33）;BCR/ABL融合基因诊断CML的敏感度和特异性分别为96.5%（28/29）和90.9%（30/33）;CML中EG5和BCR/ABL表达的差异无统计学意义,且两者之间呈高度正相关。结论EG5和BCR/ABL在慢性粒细胞白血病疾病进展中的表达情况基本一致,EG5和BCR/ABL的联合检测及动态观察,可作为CML临床辅助诊断、疗效和预后判断的指标之一。     

慢性粒细胞白血病患者外周血BCR/ABL融合基因表达水平及意义

目的观察慢性粒细胞白血病(CML)初发和急变患者外周血BCR/ABL基因的表达变化。方法建立实时定量RT-PCR同时检测b2a2和b3a2两种融合基因亚型,检测25例CML初发和25例CML急变患者的外周血样本中BCR/ABL融合基因的表达。结果BCR/ABL及GAPDH标准曲线的相关系数均为1.0,灵敏度为2pgRNA,根据熔解温度的不同可以区分b2a2和b3a2两种融合基因亚型。CML急变患者外周血BCR/ABL融合基因的表达水平是初发患者的4.72倍。结论本法简便、敏感、特异,可以相对定量BCR/ABL融合基因表达水平,有助于反映白血病细胞负荷,评价疗效及判断预后。     

BCR—ABL融合蛋白多样性及其与白血病表型的关系

本文报告ＢＣＲ－ＡＢＬ融合蛋白的变化及其与白血病表型的关系。首先报告各种ＢＣＲ－ＡＢＬ融合基因的结构及其转录本。可分为三种类型，即Ｍ－ｂｃｒ，ｍｂｃｒ和μ－ｂｃｒ，以及它们见于那些白血病。其次报告ＢＣＲ断点位置的变化，ＡＢＬ的特殊断点，ＢＣＲ－ＡＢＬ信息ＲＮＡ的拼接。ＢＣＲ－ＡＢＬ融合蛋白的结构和白血病的关系。引外ＢＣＲ／ＡＢＬ细胞还带有染色体的其它异常，Ｐｈ染以体的变种等。最后论述了ＢＣＲ／ＡＢ     

细胞凋亡在慢性粒细胞白血病中的研究进展

BCR/ABL融合蛋白抑制慢性粒细胞白血病(CGL)白血病细胞的凋亡,细胞凋亡受抑在CGL发病机制中具有重要的作用。本文简述BCR/ABL~ CML细胞凋亡过程中相关基因、蛋白及细胞周期变化。     

慢性粒细胞白血病的基因治疗策略

BCR／ABL融合基因及其表达产物p210^BCR/ABL对慢性粒细胞白血病（CML）的发生具有决定性作用。近年来对CML分子发病机制的深入研究，为治疗CML提供了多种思路，涌现出了包括生物治疗在内的许多新疗法，有些已进入临床试验或临床治疗。本文概述了针对CML BCR／ABL信号转导途径的各种基因治疗策略，大致可分为以下四类：抑制癌基因表达，抑制BCR／ABL信号通路下游重要分子基因表达，阻抑BCR／ABL蛋白产物的功能，免疫治疗。     

BCR／ABL阳性细胞对STI571耐药机制的研究进展

在慢性粒细胞白血病、成人急性淋巴细胞白血病以及儿童急性淋巴细胞白血病中常常发现染色体t(9;22)(q34;q11)易位。这种易位在22号染色体产生BCR／ABL融合基因，导致细胞恶性的扩增。STI571（以前称谓CGP57148B）抑制Bcr/Abl酪氨酸激酶活性。然而人们在对BCR／ABL阳性细胞研究中发现了对STI571耐药的细胞株，目前的研究认为BCR／ABL基因的扩增与过度表达是对STI571耐药的主要机制。     

慢性粒细胞白血病的细胞凋亡分子机制及临床治疗研究进展

慢性粒细胞白血病(CML)以染色体移位形成BCR／ABL融合基因为标志,编码的融合蛋白 P210BCR／ABL具有较强的蛋白酪氨酸激酶活性,可激活Ras-Raf-MAPK、STAT-Bcl-XL、PI3K-AKT、 NFκB等多条信号转导途径,直接或间接作用于细胞凋亡的开关——线粒体,使BCR／ABL阳性细胞耐受凋亡,导致肿瘤疾病发生。因此诱导凋亡是目前临床治疗慢性粒细胞白血病的重要方法之一,本文就慢性粒细胞白血病的细胞凋亡分子机制,以及在此基础上临床新近发展的一些治疗策略作一简述。     

慢性粒细胞白血病的细胞凋亡分子机制及临床治疗研究进展

慢性粒细胞白血病（CML）以染色体移位形成BCR／ABL融合基因为标志，编码的融合蛋白Pz，oBCR／ABL具有较强的蛋白酪氨酸激酶活性，可激活Ras—Raf-MAPK、STAT—Bcl—XL、P13K—AKT、NFκB等多条信号转导途径，直接或间接作用于细胞凋亡的开关——线粒体，使BCR／ABL阳性细胞耐受凋亡，导致肿瘤疾病发生。因此诱导凋亡是目前临床治疗慢性粒细胞白血病的重要方法之一，本文就慢性粒细胞白血病的细胞凋亡分子机制，以及在此基础上临床新近发展的一些治疗策略作一简述。     

慢性粒细胞白血病的基因治疗策略

BCR/ABL融合基因及其表达产物p210~(BCR/ABL)对慢性粒细胞白血病(CML)的发生具有决定性作用。近年来对CML分子发病机制的深入研究,为治疗CML提供了多种思路,涌现出了包括生物治疗在内的许多新疗法,有些已进入临床试验或临床治疗。本文概述了针对CML BCR/ABL信号转导途径的各种基因治疗策略,大致可分为以下四类:抑制癌基因表达,抑制BCR/ABL信号通路下游重要分子基因表达,阻抑BCR/ABL蛋白产物的功能,免疫治疗。     

荧光原位杂交在慢性粒细胞白血病细胞BCR/ABL融合基因检测中的应用及其意义

目的:探讨荧光原位杂交(FISH)技术检测慢性粒细胞白血病(CML)骨髓和外周血细胞的BCR/ABL融合基因的临床价值。方法:应用FISH对正常对照组及CML患者骨髓和外周血细胞BCR/ABL融合基因进行检测和分析。结果:慢性期CML患者骨髓和外周血细胞该融合基因阳性细胞率分别为(61.9±22.3)%和(68.4±19.8)%,加速期为(77.2±16.7)%和(86.8±12.1)%,急变期为(80.6±17.5)%和(81.4±18.0)%,两者细胞中BCR/ABL基因的阳性率未见统计学差异(P>0.05),且骨髓和外周血细胞之间融合基因阳性细胞比率呈直线正相关。同时发现在完全临床缓解患者中,经伊马替尼治疗的CML患者(71.4%)较经干扰素和羟基脲联合治疗者(10.0%)有更高的分子生物学缓解(P<0.05)。结论:通过FISH对CML患者骨髓和(或)外周血细胞融合基因进行监测,有助于CML的诊断、治疗及微小残留白血病的监测。     

慢性髓细胞白血病BCR/ABL1突变克隆演化和治疗策略

伊马替尼的应用使很多慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者获得了长期生存,但是CML的BCR-ABL1融合基因激酶区突变(kinase domain mutation,KDM)会造成耐药.KDM有多种类型,不同类型是随机出现的.带有不同KDM特征的白血病克隆有一定的演变规律.在伊马替尼用药期间,耐药程度较高的突变细胞容易发展为优势克隆.建议在治疗伊马替尼耐药的CML时,除了努力发展下一代酪氨酸激酶抑制剂以外,还可考虑用传统药物来辅助治疗.     

伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病患者ABL激酶区点突变检测的意义

目的研究发生伊马替尼（IM）耐药的慢性粒细胞白血病（CML）患者BCR／ABL融合基因ABL激酶区发生点突变的情况。方法采集11例（血液学耐药7例，遗传学耐药4例）共计17份发生IM耐药的CML患者IM治疗前后的骨髓，采用半筑巢式扩增长片段逆转录-PCR（RT-PCR）的方法，应用分别位于BCR基因和ABL基因的引物进行2次PCR，扩增BCR／ABL基因ABL激酶区周围863bp碱基，进行纯化、测序序列同源性分析。结果本研究共发现3种突变，即G250E、E255K和1315I。其中，血液学耐药发生突变的频率为4／7，95％可信区间为18％-90％；而遗传学耐药发生突变的频率为1／4，95％可信区间为1％-81％。所有患者发生耐药前均未发生点突变。结论发生IM耐药的CML患者BCR／ABL基因ABL激酶区周围存在高频率的点突变。通过对影响与IM结合的突变情况进行早期检测，有利于在发生耐药前进行治疗干预，为患者提供更有效的治疗选择。     

蛋白转导结构域-bcr/abl融合基因的构建和表达

目的 构建含蛋白转导结构域（PTD）与慢性粒细胞白血病（CML）bcr/abl融合基因片段的质粒，并在大肠杆菌中表达。方法 PCR扩增的CML bcr/abl基因片段，经DNA测序后，与合成编码PTD的DNA片段一起手稿质粒pET-16b，构建表达载体pEPb，转化大肠杆菌并进行了PTD－bcr/abl蛋白的诱导表达和纯化。结果 跨越bcr/abl断裂点的523bp的目的片段被有效地扩增，DNA序列分析表明所构建的含PTD－bcr/abl融合基因的质粒与设计相同。PTD－bcr/abl融合蛋白在转化大肠杆菌获得了高效表达并纯化。结论 成功地获得了PTD－bcr/abl融合蛋白片段的基因表达产物，为进一步研究CML的免疫治疗奠定了基础。     

M1-GS RNA靶向作用于K562细胞的研究

目的；探讨带有导引序列的核糖核酸酶P亚单位M1 RNA(M1-GS RNA)转染白血病细胞株K562细胞后对bcr-abl融合基因mRNA及其表达产物的作用效应。方法：含有针对bcr-abl mRNA的M1-GS RNA表达质粒pAVGS4，以X-treme Q2介导转染K562细胞，设置空载体组作为对照，分别在转染后24，48，72和96h收集细胞，以Trizol试剂抽提总RNA，通过RT-PCR检测转染后不同时间bcr-abl mRNA的变化；在转染后48和96h，抽提总蛋白质，通过Western blot检测癌基因的表达产物P210在不同时间的变化。利用半固体琼脂培养方法观察pAVGS4对K562细胞集落形成的影响。结果：pAVGS4转染K562细胞后24，48，72和96h RT-PCR结果显示：在转染后24h，随时间的推移，实验组细胞内bcr-ablmRNA含量下降近1个对数级，72和96h实验组细胞内bcr-abl mRNA的含量接近，而对照组无明显改变。Western blot结果显示：实验组在48h的灰度值是同期对照组的10．4％，96h时为6．7％。K562细胞集落形成分析显示96h后集落抑制率达81．3％。结论：M1-GS RNA可以有效、特异地破坏bcr-abl mRNA，显著下调P210的表达，抑制K562集落形成。     

BCR/ABL转基因动物模型研究进展及应用

转基因动物模型为研究慢性粒系白血病的发病机理与治疗提供了一个良好平台。利用不同的启动子或四环素调控系统已建立了一系列的BCR/ABL转基因动物模型,其中相当一部分动物模型能很好的模拟人的CML特征,并在CML的发病机理与治疗的研究中广泛应用。本文就目前BCR/ABL转基因动物模型的研究进展、优缺点及应用作一综述。     

接合物蛋白磷酸化水平在伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病中的临床意义

目的 探讨接合物蛋白(CRKL)的磷酸化水平在伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病(CML)中的临床意义.方法 分别采用筑巢式PCR扩增ABL激酶区序列、实时荧光定量PCR法、流式细胞术检测35例CML患者不同时期52份骨髓标本ABL激酶区点突变、BCR-ABL基因转录水平、CRKL磷酸化水平,分析CRKL磷酸化水平与前两者的关系.结果 15例伊马替尼耐药患者中6例(40.0%)检测到ABL激酶区点突变,涉及四种类型氨基酸的改变,分别为Y253H 1例、E255K 1例、T315I 3例、F317L 1例,其中2例(T315I、Y253H)处于急变期,3例(E255K、T315I、F317L)处于加速期,1例(T315I)处于慢性期.初诊组BCR-ABL mRNA水平高于伊马替尼治疗有效组(P=0.01);伊马替尼耐药组BCR-ABL mRNA水平高于伊马替尼治疗有效组(P=0.03);伊马替尼耐药组BCR-ABLmRNA水平与初诊组差异无统计学意义(P=0.18).伊马替尼耐药组与初诊组磷酸化CRKL阳性细胞百分率及平均荧光强度(MFI)均明显升高,两组差异无统计学意义(P=5.130;P=3.178);但初诊组较伊马替尼治疗有效组患者显著增高(P=0.000;P=0.01),伊马替尼耐药组较伊马替尼治疗有效组患者显著增高(P=0.000;P=0.02);磷酸化CRKL阳性细胞百分率、MFI与BCR-ABL mRNA表达水平存在正相关关系(P＜0.05).结论 应用流式细胞术检测P210BCR-ABL主要底物CRKL蛋白的磷酸化水平,是快速便捷的检测CML患者酪氨酸激酶活性的方法,CRKL磷酸化水平可作为评价伊马替尼治疗CML的疗效指标.

Abstract：

Objective To investigate the adaptor protein CRKL phosphorylation level( p-CRKL) and its significance in chronic myeloid leukemia(CML) treated with imatinib. Methods ABL kinase domain was amplified by nested RT-PCR, domain point mutations analysis by direct sequencing, BCR-ABL mRNA level by real time-PCR, and p-CRKL level by flow cytometry in 52 bone marrow samples from 35 CML patients,and the relationship of p-CRKL level with ABL kinase domain mutation and with BCR-ABL mRNA level was analyzed. Results In the 15 imatinib-resistant patients, ABL domain point mutations were detected in 6 with 4 types of nucleotide substitutions: T315I ( n = 3 ), Y253 H ( n = 1 ), E255 K and F317 L. The incidence of mutations in disease chronic phase ( CP), accelerated phase (AP) and blast phase (BP) was 25.00%,40.00% and 30.00%, respectively. The BCR-ABL mRNA level in newly diagnosed CML was higher than that in imatinib-responded patients (P =0.01 );and so did in imatinib-resistant patients than in imatinib-effective patients ( P = 0. 03 ). The level of BCR-ABL mRNA was not significantly different between newly diagnosed CML and imatinib-resistant patients. p-CRKL%, MFI showed a high degree of phosphorylation in newly diagnosed CML and imatinib-resistant patients(P = 5.130; P = 3.178 ). The level of p-CRKL % and MFI in newly diagnosed group was higher than that in imatinib responded group( P = 0.000; P = 0.01 ) and also higher in imatinib-effective group than in imatinib-resistant group (P = 0. 000; P = 0. 02 ). There was apositive correlation between the level of BCR-ABL expression and p-CRKL % ( and the MFI of p-CRKL)( P ＜ 0. 05 ). Conclusion It seems that p-CRKL detection might be helpful in predicting imatinib treatment outcomes.     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测白血病bcr/abl mRNA

目的　建立荧光定量RT PCR法检测白血病融合基因bcr ablmRNA的方法 ,为白血病临床诊断及微量残留病监测提供有用工具。方法　RT PCR扩增培养的K5 6 2细胞bcr abl融合基因 ,A T载体克隆法构建定量标准模板 ,用PE770 0型检测仪 ,建立荧光定量RT PCR方法 ,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定 ;定量检测 14例慢性髓细胞白血病 (CML)患者和 4例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血样本。结果　建立的荧光定量RT PCR方法 ,可检测出约 10 - 5μgK5 6 2总RNA中的bcr abl融合基因和 10个bcr abl重组质粒拷贝 ,重复性的CT值 (Cyclethreshold)管间、批间变异系数 (CV)分别为 :2 0 % ,3.7%。 14例CML患者bcr abl融合基因表达量中位数为 5 .15× 10 4 拷贝 μgRNA ,产物经电泳分析 ,其中 11例为b2a2 ,3例为b3a2 ,1例 12× 10 4 拷贝 μgRNA的CML患者 ,骨髓移植后 1个月变为 0 .2 3× 10 4 拷贝 μgRNA。 4例ALL患者中 1例有bcr abl融合基因的表达 ,为b2a2 ,表达量为 8.2×10 5拷贝 μgRNA。 结论　建立的荧光定量RT PCR方法灵敏、特异、重复性好 ,结果用拷贝数表示 ,准确可靠 ,利于统一标准。该方法能检测出b2a2、b3a2两种类型的融合基因 ,可广泛用于CML的诊断和微量残留病的检测     

As2O3对慢性粒细胞白血病原代细胞BCR-ABL蛋白水平及信号转导的影响

目的：阐述As2O3对慢性粒细胞白血病（CML）原代细胞BCR－ABL及信号转导的影响。方法：采用免疫沉淀、蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK)活性测定和Western印迹、实时定量PCR等方法。结果：1．0μmol/L和2．0μmol/L As2O3作用48h,CML患者骨髓单个核细胞BCR／ABL蛋白含量下调,0．5μmol/L时无明显改变。在0．5μmol/L As2O3作用下STAT1蛋白下调,1．5μmol/L和2．0μmol/L时下调更明显。P27蛋白无变化。As2O3作用60h,可使CML患者骨髓单个核细胞BCR－ABL蛋白PTK活性轻度下降。As2O3对bcr-abl融合基因的mRNA表达无明显影响。结论：As2O3下调BCR－ABL蛋白STAT1蛋白水平,减弱BCR－ABL信号的下传。As2O3下调PTK活性。     

T淋巴细胞识别自体慢性粒细胞白血病肿瘤细胞抗原的研究

目的：验证慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）患者体内是否存在细胞毒Ｔ淋巴细胞前体细胞，并鉴定其表型和功能特征。方法：用混合淋巴瘤细胞培养技术，用自体瘤细胞和细胞因子刺激扩增ＣＭＬ患者骨髓和外周血单个核细胞（ＭＮＣ）。结果：ＣＭＬ缓解期和慢性期均存在对自体和异体ＣＭＬ细胞杀伤活性的Ｔ淋巴细胞，这些细胞对自体和异体正常ＭＮＣ没有杀伤活性，对正常ＣＦＵ－ＧＭ无抑制作用。而ＬＡＫ细胞对自体ＣＭＬ细胞无杀伤活性（＜１０％），只对异体ＣＭＬ细胞有杀伤活性。上述Ｔ细胞包括ＣＤ３＋ＣＤ５６＋非主要组织相容性抗原（ＭＨＣ）限制性Ｔ细胞，和ＣＤ３＋ＣＤ６－ＭＨＣ限制性Ｔ细胞。用自体ＣＭＬ细胞刺激可增加Ｔ细胞激活抗原ＣＤ２５和ＨＬＡ－ＤＲ的表达。上述Ｔ细胞对自体ＣＭＬ细胞呈较弱的增殖反应，对异体ＣＭＬ细胞几乎无增殖反应，对载有ＢＣＲ－ＡＢＬ肽的自体缓解期ＥＢ病毒转染Ｂ细胞也无增殖反应。结论：ＣＭＬ细胞可能有共同的肿瘤抗原，后者可以被Ｔ细胞识别，但尚无证据表明是ｐ２１０的融合区序列。     

抗CD44单抗IM7对慢性粒细胞白血病CD34+细胞黏附和迁移能力影响的体外研究

目的 探讨抗CD44单抗IM7在体外对慢性粒细胞白血病(CML)干细胞(LSC)黏附和迁移的影响及其机制.方法 取20例初诊CML患者骨髓及20名健康新生儿脐血标本,用免疫磁珠分离法分离纯化CML患者骨髓和正常人脐血CD34+细胞,流式细胞术检测CD123和CD44的表达情况,MTT法检测CD44单抗IM7孵育前后细胞的黏附能力,体外跨内皮迁移实验检测其迁移能力.结果 ①CML患者骨髓CD34+细胞(CML-CD34+细胞)中CD34和CD123双阳性细胞率为7.5%,CD44阳性细胞率为(86.60±2.10)%;脐血CD34+细胞中CD44阳性细胞率为(25.40±1.70)%,两组之间比较差异有统计学意义(P<0.05).②与IM7孵育后的CML-CD34+细胞与血管内皮细胞黏附能力为0.34±0.07[吸光度(A)570值],未经IM7处理组为0.62 ±0.11,CML-CD34+细胞经IM7处理后的黏附能力显著下降,而脐血CD34+细胞IM7处理前后无明显变化.③跨内皮迁移实验显示经IM7处理后的CML-CD34+迁移能力明显受到抑制,抑制率为46%～63%,而CD34+细胞迁移抑制不明显.④经IM7处理后的CML-CD34+细胞与骨髓基质细胞黏附能力明显降低,而脐血CD34+细胞IM7处理前后无明显变化.结论 CML患者来源的CD34+细胞与脐血CD34+细胞为性质不同的造血干细胞,抗CD44单抗IM7在体外能有效抑制CML-CD34+的黏附和迁移,从而为白血病的靶向治疗提供依据.