小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况.方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012) pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力.结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体.     

Rag2 KO小鼠脏器重量、血液生理生化指标及免疫细胞的研究

目的 检测SPF级Rag2 KO小鼠的脏器重量,血生理生化等生物学特性指标和免疫细胞。方法 分别选5、10周龄的Rag2 KO 小鼠测定主要脏器重量,并测定主要血生理、生化指标。选取6周龄Rag2 KO 小鼠,应用流式细胞仪检测细胞免疫（T细胞-CD3 、T细胞亚群-CD4 、CD8 )、体液免疫（B细胞-CD19 、B220 ）、NK细胞（NK1.1 ）和粒细胞（CD11b ）进行检测。结果 同性别NOD/SCID小鼠,10周小鼠脑、肺脏、脾脏、肝脏、心脏、双肾脏重、TBIL、WBC高于5周龄。同周龄的雌雄相比,雄性小鼠心脏、双肾脏、肝脏、脾脏重量、AST、ALP、A/G、GLU、PLT、PCT、WBC、LYM%高于雌性。Rag2 KO小鼠无T细胞（0.36?.15）%、CD4 T细胞（0.21?.06）%、CD8 T细胞（0.23?.07）%、CD19 B细胞（0.28?.04）%和B220 B细胞（2.03?.42）%）。NK细胞比例为（24.13?.62）%,粒细胞比例为（57.20?.85）%。结论 Rag2 KO小鼠与C57BL/6J小鼠的主要生物学特性基本一致。周龄和性别因素对其脏器重量、血生理生化指标都有一定的影响。Rag2 KO小鼠T、B淋巴细胞缺失。     

Bax、Bag-l、Bcl-2在乳腺肿瘤组织中的表达及意义

目的：探讨Bcl-2相关X蛋白（Bax）、Bcl-2结合抗凋亡基因（Bag-1）、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）在乳腺肿瘤组织中的表达及临床意义。方法：选取本院乳腺浸润性导管癌及其癌旁组织各85例、乳腺导管内癌及其癌旁组织各70例,采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（S-P）免疫组化法检测Bax、Bag-l、Bcl-2蛋白在各组织中的表达。结果：Bax蛋白在浸润性导管癌组织中的表达与癌旁正常组织及导管内癌组织比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;Bag-1、Bcl-2蛋白在浸润性导管癌组织中的表达高于在癌旁正常组织,差异具有统计学意义（P〈0.05）;浸润性导管癌组织中Bag-1、Bcl-2蛋白阳性表达率明显高于导管内癌癌组织,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论：乳腺癌组织中Bag-1、Bcl-2蛋白表达高于癌旁正常组织,在浸润性导管癌中的表达高于导管内癌组织,Bag-1、Bcl-2高表达可作为判断乳腺疾病良、恶性及预后的指标之一。     

异种移植转基因用含粘附分子-2启动子的人CD59 重组基因的构建

目的：构建含人粘附分子－2（ICAM－2）启动子的人补体调节蛋白CD59重组基因,并钭其用于异种器官移植转基因。方法：利用PCR方法从人血基因组扩增得到ICAM－2启动子、CD59基因的第一内含子片段,经电泳分离、切胶回收纯化得到上述片段,分别双酶、单酶切这两条片段,纯化回收备用;双酶切pcDNA3-CD59真核表达载体,经电泳分离,切胶回收纯化得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段pcDNA3-CD59cDNA作为载体序列;ICAM－2启动子片段先与载体进行定向克隆连接反应后转化细菌,阳性转化蓖质粒抽提及酶切鉴定,得到pcDNA3-ICAM2-CD59质粒;再单酶切此质粒,纯化该载体与CD59第一内含子片段连接,转化细菌、抽提质粒,用脂质体将该质粒转染猪血管内皮细菌,流式细胞仪检测CD59蛋白表达。结果：得到pcDNA3-Enhancer-ICAM2-CD59质粒,以EcoR I消化此重组质粒,产生5．5及0．5kb两片段,以Hind Ⅲ消化重组质粒,得到5．45及0．55kb两片段,以Kpn I/Hind Ⅲ双酶切质粒时,出现5．0、0．55、0．4kb 3条片段,对插入子分别进行测序,上述结果完全符合设计要求及正确序列。流式细胞仪检测重组基因表达阳性。结论：含人ICAM－2启动子的CD59重组基因表达载体获得成功,该重组基因构建成功为转基因应用奠定了基础。     

小鼠Osf2／Cbfal基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况。方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012)pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体。     

靶向基因修饰技术在免疫缺陷动物模型研究中的应用进展

免疫缺陷动物模型在人类相关疾病机理研究、药物研发、器官移植研究和干细胞研究中有重要的应用。但由于传统基因修饰动物构建技术难度大、效率低等限制,在中型、大型动物中获得的免疫缺陷动物模型还很少。近年来新兴的靶向基因修饰技术,包括ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9等,为高效率免疫缺陷动物模型构建提供了技术基础。本文就ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9的技术原理及研究进展进行概况介绍,并详细地阐述这些技术在中型和大型动物中免疫缺陷动物模型构建方面取得的进展,包括KO Rag1/ Rag2兔、KO Rag1/ Rag2猪、KO IL2rg猪、KO Ppar-?/ Rag1猴等。这些免疫缺陷动物模型不仅能用于人类SCID相关疾病研究,评价干细胞移植的效率和安全性,且可进行临床前手术治疗研究,生产人源化动物模型等,进而架起实验动物与医学应用的桥梁,促进临床前细胞再生策略的综合评价体系的发展。     

载脂蛋白E基因缺陷对小鼠主动脉壁caveolin-1表达的影响

目的探讨高脂喂养的C57BL／6J小鼠和普饲喂养的apoE基因缺陷(apoE-／-)小鼠(品系为C57BL／6J)caveolin-1表达的差异。方法取apoE-／-小鼠作为研究对象，以普饲和高脂喂养的C57BL／6J小鼠为对照组，测定各组小鼠血脂和主动脉壁斑块的变化，Western—blotting检测caveolin-1在主动脉的表达。结果普饲喂养的apoE-／-组和高脂喂养的C57BL／6J组血脂水平较普饲喂养的C57BL／6J组明显升高；普饲喂养的apoE-／-组的主动脉形成明显的斑块，高脂喂养C57BL／6J组没有形成斑块，但血管壁平滑肌细胞出现增殖，普饲喂养的C57BL／6J组未见明显变化。Wester—blotting检测显示普饲喂养的apoE-／-小鼠和高脂喂养的C57BL／6J小鼠caveolin-1的表达与普饲喂养的C57BL／6J小鼠比较明显减弱。结论血管壁caveolin-1的表达下调可能是apoE-／-小鼠动脉粥样硬化形成的重要原因。     

MMP-2、MVD及MEK-2在子宫内膜异位症中的表达及临床意义

目的:探讨基质金属蛋白酶2(MMP-2)、微血管密度(MVD)、丝裂原活化蛋白激酶上游激活酶(MEK-2)在子宫内膜异位症的临床表达及意义。方法:选择2008年9月1日~2014年12月18日在我院妇产科行手术治疗的42例子宫内膜异位症患者,术中将异位内膜取出设置为异位内膜组。取上述42例子宫内膜异位症患者的在位内膜,将其设置为在位内膜组。选择同期在我院妇产科行手术治疗的34例子宫肌瘤患者,取其正常的子宫内膜作为正常内膜组。测定、评估3组MMP-2、MVD、MEK-2的临床表达,并进行统计学分析。结果:异位内膜组的MVD值均明显高于在位内膜组和正常内膜组(P均<0.05)。正常内膜组织中MEK-2、MMP-2表达主要以阴性及弱阳性为主,异位内膜以及在位内膜则100%表达为阳性。异位内膜中MEK-2、MMP-2的表达强度最高,在位内膜次之,正常内膜的表达强度最低(P<0.05)。结论:MMP-2、MEK-2在异位内膜中均呈现出高表达,MVD值在异位内膜中升高,探讨MMP-2、MVD、MEK-2在子宫内膜异位症的临床表达,有助于进一步明确本病的发病机理,指导临床诊断和治疗。     

MS2—a嵌合基因构建及在大肠杆菌中的表达

利用基因融合和基因工程技术，将乙型肝炎病毒表达抗原“a”决定簇基因片段，插入白细胞介素3融合表达载体PMT-hIL3中，成功构建了MS2-a嵌合基因表达质粒PMT-a，表达效率高达28%，表达产物经ELISA测定，具有“a“决定簇抗原性，可用作进一步开展乙型肝炎免疫调节治疗的参照体系。     

CDC2L1~2基因及与肿瘤的关系

细胞周期调节蛋白激酶(CDC2L)1和CDC2L2基因定位于人第1号染色体1p36.3区,在人体细胞中,通过选择性剪接,转录出超过20个不同的信使RNA和蛋白质,在CDC2L基因各种产物中指定的773⁷86氨基酸,总共有15个氨基酸的差异,12个非保守的和3个保守的。CDC2L1786氨基酸,总共有15个氨基酸的差异,12个非保守的和3个保守的。CDC2L1²在细胞有丝分裂、凋亡、纺锤体形成、微管稳定,肿瘤发生、发展等方面均有重要作用。进一步研究CDC2L12在细胞有丝分裂、凋亡、纺锤体形成、微管稳定,肿瘤发生、发展等方面均有重要作用。进一步研究CDC2L1²基因在肿瘤中的具体发病机制将为肿瘤的预防、治疗、预后等方面带来新思路。     

抑癌基因与细胞衰老研究进展

大量的文献表明,抑癌基因与细胞增殖调控密切相关,因此,它们与细胞衰老的关系已成为最近几年来人们研究的一个热门课题,p53、p21、p16、RB是目前研究比较深入的几个与细胞衰老相关的抑癌基因。     

TAFA2基因剔除小鼠模型的建立

目的 建立TAFA2基因剔除小鼠模型,为在体研究TAFA2基因的生物学功能及其与中枢神经系统发生、发育的关系创造条件. 方法 运用生物信息学手段确定小鼠TAFA2基因组的序列,设计基因剔除策略,构建基因剔除载体pBR322-MK-MCS-TAFA2,以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆,PCR鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆. 结果 同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚后获得嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti（野生型）毛色的小鼠41只,其中14只为TAFA2基因剔除杂合子小鼠,阳性率为34.1%.在雌、雄杂合子小鼠交配的后代中获得纯合子小鼠,初步的表型观察未发现TAFA2基因剔除小鼠出现异常改变. 结论 已成功建立了TAFA2基因剔除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.     

p57kip2 LIMK-1在胃癌组织中的表达及与肿瘤血管和淋巴管的关系

目的:探讨胃癌组织中细胞周期抑制因子p57kip2、LIMK-1与临床病理的关系以及在胃癌浸润转移及肿瘤微淋巴管和微血营形成中的作用.方法:用免疫组织化学方法(EnVision法)检测40例胃癌组织和其对应癌旁组织(距癌灶缘>5 cm)中p57kip2、LIMK-1的表达水平,及检测微淋巴管和微血营密度.结果:p57k...     

PICK1基因敲除小鼠的繁育及子代基因型的鉴定

目的 探讨蛋白激酶Cα相互作用蛋白(PICK1)基因敲除小鼠的优化繁育方法及 PICK1 基因敲除小鼠子代鼠的鉴定方法,为进一步研究 PICK1蛋白的功能奠定基础.方法 用 6 种不同的交配方式观察子代鼠的各表型比率及雌、雄性PICK1 基因突变纯合子小鼠的繁殖能力;从子鼠鼠尾中提取基因组 DNA,用 PCR 方法扩增 PICK1 基因片段,电泳后观察结果.结果 PICK1 / 、PICK1 /-、PICK1-/-各表型小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,且雌性PICK1 基因突变纯合子小鼠有繁殖能力,雄性PICK1 基因突变纯合子小鼠无繁殖能力.琼脂糖凝胶电泳显示PCR 产物分子量大小为 400 bp 和 200 bp,与目的 基因片段相对分子质量大小一致.结论 雌、雄性PICK1 基因突变杂合子小鼠交配是繁育PICK1 基因突变纯合子子鼠的较好方法;实验所用PCR方法能够精确鉴定PICK1 基因突变纯合子子鼠,为PICK1 蛋白功能的实验研究提供了较理想的动物模型.     

全长型脾酪氨酸激酶基因转染对人喉鳞癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的 探讨全长型脾酪氨酸激酶[full-length spleen tylosine kinase,SYK(L)]基因转染对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法 建立人喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分为SYK(L)重组质粒转染组、阴性对照质粒转染组和生理盐水组,分别向瘤体内注射SYK(L)重组质粒pIRES2-EGFP-SYK(L)及脂质体混合物、阴性对照质粒pIRES2-EGFP及脂质体混合物和生理盐水,观察肿瘤生长情况。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time fluorescence polymerase chain reaction,Q-RT-PCR)、Western blot法检测各组瘤体内的SYK(L) mRNA及蛋白表达水平。结果 SYK(L)重组质粒转染组的肿瘤平均体积为367.61±81.23mm³,明显小于阴性对照质粒转染组900.20±131.41mm³及生理盐水组930.71±143.73mm³,差异有统计学意义(F=99.91,P<0.01);Q-RT-PCR结果显示SYK(L)重组质粒转染组瘤体内mRNA相对表达量为2.268±0.075,明显高于阴性对照质粒转染组(1.212±0.025)及生理盐水组(1.175±0.031)(F=102.01,P<0.01);Western blot法检测结果显示SYK(L)重组质粒转染组瘤体内相对蛋白含量(0.834±0.021)明显高于阴性对照质粒转染组(0.243±0.041)和生理盐水组(0.301±0.039),差异有统计学意义(F=104.13,P<0.01)。结论 全长型脾酪氨酸激酶基因转染对人喉鳞癌裸鼠移植瘤有明显的生长抑制作用,有望成为基因治疗喉癌的新靶点及途径。     

惊恐孕鼠对子代小鼠IL—2活性的影响

以猫恐吓孕鼠塑造恐伤肾的自然模型，对照观察了子代成年小鼠ＩＬ－２活性。结果表明：恐吓模型组ＩＬ－２活性显著高于正常对照组（Ｐ＜０．０１），模型反证组则低于恐吓模型组（Ｐ＜０．０５）。提示：“恐伤肾”使子代小鼠ＩＬ－２活性处于亢进状态，而经典补肾方药“《金匮》肾气丸”对其有一定调节作用。为中医肾为先天之本的理论提供了科学依据。     

肝细胞Foxa2基因剔除小鼠的制备及鉴定

目的制备肝细胞Foxa2基因特异性剔除的小鼠模型,并进行鉴定.方法采用CreloxP重组系统,在Cre重组酶的作用下,将小鼠肝细胞DNA上的Foxa2基因进行条件性的靶向剔除;并通过PCR和免疫荧光染色法进行鉴定.结果PCR在剔除型小鼠中未扩增出Foxa2基因的条带;同时定量分析也未测出其mRNA的表达;免疫荧光显示剔除型小鼠的Foxa2蛋白也为阴性.结论条件性基因剔除技术能成功地制备肝细胞Foxa2基因特异性剔除的小鼠模型.     

Leprtm1Srcmo基因敲入小鼠模型的建立及表型分析

目的 建立Leprtm1Srcmo基因敲入小鼠模型并开展相关表型分析,以满足我国糖尿病相关研究和药物研发的需求.方法 通过基因工程技术建立Leprtm1Srcmo基因敲入小鼠模型,测定三种基因型小鼠体质量、血糖变化;分别取三种基因型8月龄小鼠,检测血糖、血清胰岛素,以及肝功能、肾功能、血脂等血液生化指标,进行统计分析;对纯合子和野生型小鼠的肝脏、肾脏进行病理分析.结果 成功获得Leprtm1Srcmo基因敲入小鼠模型;初步表型分析显示:Leprtm1Srcmo基因敲入纯合子小鼠出生4周起即表现出过度肥胖,纯合子雄鼠表现出高血糖、高胰岛素、脂质代谢紊乱、肝肾功能异常等表型,13月龄Leprtm1Srcmo小鼠血糖恢复正常;病理检测发现,Leprtm1Srcmo小鼠肝肿大,并出现肝细胞空泡化等脂肪变性现象,以及肾小球肥大等病理改变.结论 该模型的建立为进一步研究2型糖尿病发病机制及治疗方法奠定了基础.