小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究

目的构建小鼠β防御素3（mouse βdefensin3,mBD3）基因的原核表达载体pET-32a（＋）／mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性。方法运用PCR技术从质粒pcDNA3．1（＋）／mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a（＋）原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami（2）,用畀丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定融合蛋白。通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用微量液体稀释法测定融合蛋白鼠B防御素3（fmBD3）的抗菌活性。结果mBD3的原核表达载体PET-32a（＋）／mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白。fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌元作用。结论构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗微生物活性奠定了实验基础。     

非小细胞肺癌13防御素-1表达与树突状细胞浸润的关系

目的 探讨β防御素-1(Human beta-defensin-1,HBD-1)表达和树突状细胞(Dendritic cells,DC)浸润与非小细胞肺癌免疫的关系.方法 采用免疫组化方法检测、分析非小细胞肺癌组织和癌旁正常肺组织HBD-1的表达变化,并进一步分析其变化与未成熟树突状细胞(Immaturity dendritic cells,iDCs)浸润之间的关系.结果 非小细胞肺癌组织HBD-1蛋白表达显著高于正常肺组织,且在腺癌组织表达程度高于鳞状细胞癌组织,其表达与临床分期无关.同时肺癌内存在显著的iDCs浸润,HBD-1表达水平与之呈正相关.结论 在非小细胞肺癌组织内存在高水平的HBD-1蛋白表达,其表达程度与癌组织DC的浸润有关,提示HBD-1可能通过趋化未成熟的DC而在机体抗肿瘤免疫中发挥作用.     

β防御素-2表达和树突状细胞浸润与肺癌免疫的关系

目的研究β防御素2（HBD-2）在不同病理类型、不同临床阶段肺癌组织细胞中的表达以及树突状细胞（DC）在肺癌组织的浸润程度，分析两者的相关性，探讨HBD-2表达和树突状细胞浸润与肺癌免疫的关系。方法（1）免疫组化法（Envision法）测定肺癌组织、癌旁组织及正常组织中HBD-2表达，同时对其在不同病理类型及不同分期肺癌组织表达的阳性率进行比较分析；（2）以S100蛋白作为DC特异性标记蛋白，采用Envision法测定S100阳性细胞在肺癌组织、癌旁组织及正常组织浸润密度，同时分析HBD-2与DC在肺癌组织中表达的相关性。结果（1）HBD-2在肺癌组织及癌旁组织的表达均较正常组织高（P〈005）；（2）HBD-2在鳞癌组织内表达较其他非鳞癌组织高（P〈O．05）；（3）HBD-2在不同的临床阶段的肺癌组织中表达相似（P〉0.05）；（4）DC在肺癌组织及癌旁组织的表达高于正常组织（P〈005）；（5）采用Spearman等级相关分析HBD-2与DC在肺癌组织的分布，二者呈显著正相关（P〈0．05），提示HBD-2在肺癌组织的表达含量与DC的浸润有关。结论在肺癌组织内存在高水平的HBD-2蛋白表达，其表达程度与癌组织DC的浸润有关，提示HBD-2可能通过趋化未成熟的DC而参与机体抗肿瘤免疫反应。     

清气透热方体内抗菌作用的实验研究

腹腔注射金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌致小鼠感染模型，观察清气透热方的体内抗菌作用。结果显示：高、低剂量的清气透热方对感染小鼠均有明显的保护作用，使感染小鼠的存活率较空白组明显增加。     

人类β-防御素-2的研究进展

防御素(defensins)是已知发现的内源性抗生素肽家族中最大的亚家族,是一类重要的抗菌肽分子[1],它普遍存在于动物、植物、昆虫及人类体内,分子结构相对稳定,且又具有较为强力广谱抗菌、抗病毒、抗螺旋体及肿瘤等生物学活性。目前研究已经发现的人类β-防御素(HBD-1~6)中,β-防御素-2(HBD-2)广泛表达于皮肤和黏膜上皮细胞中,其诱导表达高、     

非小细胞肺癌组织中β防御素-3的表达与树突状细胞浸润的关系

目的探讨β防御素-3（HBD-3）在非小细胞肺癌组织中的表达,及其与树突状细胞浸润的关系。方法采用免疫组化方法分别对60例非小细胞肺癌组织及癌旁正常组织进行HBD-3及S100检测。分析HBD-3在不同病理类型、临床阶段的肺癌组织细胞中的表达,及其与S100表达的关系。结果（1）HBD-3在肺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织（P〈0．05）;（2）HBD-3在鳞癌组织中的表达明显高于腺癌组织（P〈0．05）;（3）HBD-3在不同临床阶段的肺癌组织中表达差异无统计学意义（P〉0．05）;（4）S100在肺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织（P〈0．05）;（5）HBD-3与S100在肺癌组织中的表达呈显著正相关（P〈0．05）。结论肺癌组织中HBD-3表达增高,可能是通过趋化未成熟的树突状细胞而在机体抗肿瘤免疫中发挥作用。     

重组人β防御素2在真皮多能干细胞中的表达及抗菌活性的测定

目的检测重组人Β防御素2(HUMANΒ-DEFENSIN2,HBD2)腺病毒表达载体在大鼠真皮多能干细胞(DERMALMULTIPOTENT STEM CELLS,DMSCS)中的表达,并观察重组HBD2的体外抗菌活性。方法将含有HBD2重组腺病毒转染DMSCS,RT-PCR、荧光免疫化学、WESTERN BLOTTING检测HBD2的表达情况,ELISA测定培养上清中HBD2的浓度,K-B纸片扩散法检测上清对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等标准菌株的杀灭效果。结果RT-PCR、荧光免疫化学和WESTERNBLOTTING的结果显示转染后HBD2可在DMSCS中有效地表达,上清中HBD2的浓度为743.6NG/ML,K-B纸片法显示HBD2对上述标准菌株有明显的杀灭效应。结论HBD2重组腺病毒表达载体在DMSCS可高效表达,并对大肠埃希菌等标准菌株有杀灭效应。     

重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达ｈＢＤ－２的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＣ－２以进行ＣＯＳ－７细胞转染表达实验。将本室克隆获得的ｈＢＤ－２全长ｃＤＮＡ片段插入带有报告基因的真核表达质粒ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ构建出ｈＢＤ－２的重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２,并经ＤＮＡ测序证明ｈＢＤ－２ｃＤＮＡ片段的插入方向和其全长ｃＤＮＡ的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２导入ＣＯＳ－７细胞。ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫印迹法分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平检测到被转染的ＣＯＳ－７细胞系能有效表达ｈＢＤ－２。     

人alpha防御素1真核表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:观察重组人alpha防御素1(HNP1)真核表达质粒对体外培养人肺腺癌细胞A549增殖的影响.方法:从人外周血白细胞中提取总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到人HNP1成熟肽基因片断.构建pSecTag-HNP1重组质粒,转染A549细胞,并设pSecTag转染组、脂质体转染组和未转染组作为对照.RT-PCR验证HNP1的表达,MTT法检测肿瘤细胞的生长情况,流式细胞仪及PI染色检测细胞凋亡情况.结果:构建了重组质粒pSecTag-HNP1,测序正确.转染A549细胞后,RT-PCR成功扩增出HNP1片断.与其他3组相比,HNP1转染A549细胞48 h后细胞的生存率降低,差异有统计学意义(P均<0.05).流式细胞仪及PI染色结果显示pSecTag-HNP1转染后的细胞凋亡增多(P<0.05).结论:转染pSecTag-HNP1后,重组HNP1能够在A549细胞中表达并有效地抑制A549细胞的增殖,促进细胞凋亡.     

重组人β-防御素基因在COS-7 细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达hBD-2的哺乳类动物型工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2 以进行COS-7细胞转染表达实验.将本室克隆获得的hBD-2全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV.tag2B构建出hBD-2的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2,并经DNA测序证明hBD-2cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.通过脂质体转染法将pCMV.tag2B/hBD-2导入COS-7细胞.RT-PCR 法和免疫印迹法分别从mRNA 水平和蛋白质水平检测到被转染的COS-7细胞系能有效表达hBD-2.     

小鼠β-防御素-2对肿瘤细胞 SiHa 生长的抑制作用及其机制

目的：探讨小鼠β-防御素-2（beta defensin 2,BD2）对 SiHa 细胞生长的抑制作用及其机制。方法将pcDNA3．1（＋）/mBD 2、pcDNA3．1（＋）/rmBD 2质粒转染 SiHa 获得的稳定转染细胞 SiHa/M、SiHa/R 裂解,用细胞裂解上清进行 Western blot 检测 mBD2蛋白表达;同时采用细胞活力分析对转染细胞的细胞活力进行测定,采用 AnnexinⅤ、PI 流式细胞分析法和 TUNEL 法检测细胞凋亡情况,并计算细胞凋亡指数。结果 SiHa/M、SiHa/R 组在4～6 Ku 区域出现目标条带;SiHa/M、SiHa/R 组细胞在贴壁后2～3 d 细胞活性明显低于 SiHa 细胞（P ＝0．018）,但随着时间推移,细胞活性开始下降,3组细胞的细胞活力差异无统计学意义（P ＝0．374）;SiHa/M、SiHa/R 及 SiHa 组 Annexin Ⅴ＋/PI＋双阳性细胞的百分率分别为2．4％、2．3％、2．3％;Annexin Ⅴ＋/PI-细胞分别为0．9％、1．2％、1．5％,3组差异无统计学意义（P ＝0．743）;SiHa/M、SiHa/R 组凋亡细胞发生率较高,分别达到40．7％、30．2％,而 SiHa 组细胞凋亡率只有7．3％,SiHa/M、SiHa/R 组细胞凋亡率明显高于 SiHa 组,差异有统计学意义（P ＝0．004）;SiHa/M 组凋亡发生率高于 SiHa/R 组,差异有统计学意义（P ＝0．003）。结论 mBD 2能够抑制 SiHa 细胞的生长和诱导细胞凋亡。     

多西环素对树突状细胞功能的影响

目的探讨多西环素对树突状细胞的免疫表型和功能的影响。方法采集健康人的外周血,密度梯度离心法获得外周血单个核细胞,用rhIL-4和rhGM—CSF诱导分化为树突状细胞,通过LPS诱导树突状细胞成熟。树突状细胞诱导成熟过程中向培养基中分别加入0μg／mL、100μg／mL和300μg／mL的多西环素,通过流式细胞术检测树突状细胞表面HLA—DR、CD83和CD80的表达,用ELISA检测树突状细胞分泌TNF—α、IL-6、IL-12和IL-10,与T细胞共培养检测刺激同种异型T细胞的增值能力。结果与对照组相比,100ng／mL和300ng／mL多西环素处理组诱导树突状细胞表达HLA—DR表达下调。多西环素可下调树突状细胞分泌IL-1B、IL-12、TNF-α和IL-6,也可抑制树突状细胞刺激同种异型T细胞增殖,并呈剂量依赖性。结论多西环素作用于树突状细胞成熟过程,导致树突状细胞下调HLA-DR的表达,抑制树突状细胞分泌IL-1B、IL-6、IL-12和TNF—α,下调其刺激同种异型T细胞的增值能力。     

核仁素表达下调对宫颈癌细胞Hela生物学行为的影响

目的 探讨核仁素表达下调对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响。方法 实验分4组：3个靶向人核仁素基因的实验组(siN1组、siN2组、siN3组)及1个阴性对照组(NC组)。体外化学合成各组siRNA并转染HeLa细胞;利用荧光实时定量RT-PCR法和Western blotting法分别从mRNA和蛋白水平检测核仁素基因的干扰效率,并筛选出干扰效率最高的片段;利用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测核仁素下调对HeLa细胞增殖活性的影响;利用流式细胞学Annexin V-FITC检测转染后HeLa细胞凋亡率的改变;Transwell实验检测转染后细胞侵袭能力的改变。结果 与NC组相比,各实验组核仁素mRNA表达水平均下降(P<0.05);蛋白表达水平也相应下调(P<0.05)。成功筛选出最佳干扰片段siN2,用于后续实验。siN2组HeLa细胞生长速率明显受到抑制(P<0.05);流式细胞学Annexin V-FITC检测siN2组HeLa细胞凋亡率明显高于NC组(P<0.05);Transwell实验显示siN2组HeLa细胞侵袭能力减弱(P<0.05)。结论 核仁素表达下调明显抑制宫颈癌Hela细胞增殖与侵袭能力,促进细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供了理论依据。     

人α防御素-5多肽体外抗单纯疱疹Ⅱ型病毒作用的研究

目的 探讨人α防御素-5(human α-defensin-5, HD-5)多肽体外抗单纯疱疹Ⅱ型病毒(herpes simplex virus type 2, HSV-2)的作用及其机制.方法 以绿猴肾细胞(Vero)为宿主细胞,采用CCK-8法首先分析10～200 μg/ml浓度范围内HD-5多肽的细胞毒性,再以HSV-2感染Vero细胞,分别于感染前后和感染的同时加入100 μg/ml 的HD-5多肽,72 h后测定细胞保护率,结合细胞病变效应观察,分析HD-5抗HSV-2的作用效果和起效环节,并通过改变培养基中血清的浓度,观察血清对HD-5抗病毒作用的影响.结果 在100 μg/ml 浓度以内,HD-5多肽几乎无细胞毒性,提前或同时加入HD-5多肽可以显著抑制HSV-2病毒引起的细胞病变反应、提高细胞保护率(P<0.01),而在HSV-2感染2 h后加入HD-5多肽对Vero细胞的保护作用不明显(P>0.05);血清浓度会显著影响HD-5多肽的抗HSV-2活性,血清浓度越高,HD-5多肽对细胞的保护率越低.结论 HD-5多肽在体外具有显著的抗HSV-2感染活性,其作用机制主要是通过干扰病毒对细胞的粘附、侵入而发挥作用.     

重组人β-防御素-2 基因在昆虫细胞的转染表达

目的探索杆状病毒表达系统(BEVS)高效表达人β-防御素-2 (hBD-2)的可行性及其技术路线.方法利用特异性引物经 PCR 扩增,从重组质粒 rpcDNA3.1/ hBD-2/ myc-His中扩增出完整重组 hBD-2/His基因片段.将此片段插入转移质粒pAcGHLT-A的多克隆位点中,构建成重组转移载体rpAcGHLT-A/hBD-2/His.用该重组转移载体和多角体病毒AcNPV DNA共转染草地夜蛾细胞(Sf21),二者在细胞内经过同源重组形成重组病毒rAcNPV/hBD-2/His.用终点稀释分析法检测感染上清重组病毒的感染效率.采用Western 印迹法通过特异性抗-His抗体检测细胞及上清hBD-2/His的表达.结果目的基因hBD-2/His正确地插入BEVS系统的转移载体.经rpAcGHLT-A/hBD-2/His和AcNPV DNA共转染的Sf21细胞有较高滴度的重组病毒rAcNPVhBD-2/his存在.被共转染的Sf21细胞的可溶性蛋白,在相对分子质量约47.5×103处有强反应条带显示,其大小与根据测序结果所推测的hBD-2融合肽相对分子质量接近.培养上清分别在相对分子质量约40×103和30×103处有强反应条带显示.结论可利用BEVS系统作为高效表达重组hBD-2的生物反应器.     

神经再生素对皮层细胞基因表达影响的基因芯片研究

目的：采用基因芯片技术,观察神经再生素对体外培养的胚鼠大脑皮质细胞基因表达的影响。方法：取ICR胚鼠（15d)大脑皮层细胞,无血清培养。实验组加入神经再生素（2μg/ml）,对照组加入等量基础培养液。培养6h后,抽提实验组和对照组皮层细胞总RNA,经反转录分别用Cy5、Cy3荧光标记成cDNA探针。将荧光标记的cDNA与MGEC－40s基因表达谱芯片杂交,芯片扫描、数据处理。结果：实验组与对照组大脑皮质细胞出现64条差异性表达的基因。呈现上调的基因有：钙调素结合蛋白、锌指蛋白激酶、核糖体蛋白等基因;下调基因有：抑制细胞分裂因子等基因。结论：神经再生素可作用于体外培养的胚鼠大脑皮层细胞,从基因调控水平促进脑细胞生长。     

抗P-选择素功能域单抗对急性肾损伤防治及免疫防御功能的影响

目的探讨抗P-选择素lectin-EGF功能域单抗(PsL-EGFmAb)对大鼠急性肾损伤防治及机体免疫防御功能影响.方法建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型,观察和比较经PsL-EGFmAb及其配体拮抗剂N-去硫酸肝素处理前后,大鼠肾组织P-选择素及其mRNA表达、组织病理学改变、肾功能变化以及免疫细胞功能状态.结果肾缺血再灌注后,大鼠肾内以肾小管上皮细胞为主P-选择素表达增强,出现明显的组织病理学改变及肾功能损害;同时体内T、B细胞活性受抑,而NK细胞明显激活.经给予PsL-EGFmAb及其配体拮抗剂N-去硫酸肝素处理后,肾组织P-选择素及其mRNA表达受抑,病理学改变及肾功能损害减轻,尤以PsL-EGFmAb治疗效果更为明显;此外大鼠体内三种免疫细胞功能均受到不同程度的调节.结论抗P-选择素功能域单抗对肾缺血再灌注损伤具有防治作用,其抗黏附靶向效果强于N-去硫酸肝素,并对大鼠免疫防御功能可能具有调节作用.     

重组β-防御素2多肽对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡的影响

目的：观察重组β-防御素2多肽预处理对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡的影响。方法：SPF级SD大鼠48只随机分成对照组和防御素组，采用盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症模型，防御素组在CLP前48h经气管插管气道滴注10^7PFU重组腺病毒（含有β-防御素2编码基因），而对照组则同法给予对照腺病毒（不合β-防御素2编码基因）。分别于CLP后0、12、36和72h处死大鼠，取肺组织，采用透射电镜，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡，采用电镜、苏木精-伊红（HE）染色观察肺组织病理变化。结果：TUNEL检测显示，对照组大鼠CLP后12、36和72h肺组织细胞凋亡指数显著增加（P〈0．01）；与对照组相比，防御素组CLP后相应时间点肺组织细胞凋亡指数显著降低（P〈0．05）。HE染色可见，两组大鼠CLP后12、36和72h肺泡及肺泡间质充血、水肿，炎症细胞渗出，肺泡腔不同程度狭窄。与对照组相比较，防御素组相应时间点肺组织内炎症细胞渗出减少，间质水肿减轻。结论：重组β-防御素2多肽预处理能抑制脓毒症肺组织的细胞凋亡，对急性肺损伤（ALI）具有保护作用。     

血管紧张素Ⅱ对树突状细胞功能的影响

目的以肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)为对照,探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)对树突状细胞(dendritic cells,DC)的功能影响并比较DC对上述刺激的反应差异。方法体外培养DC2.4细胞,分别加入20 ng/m L TNF-α和100 nmol AngⅡ诱导DC细胞成熟。用MTT、流式细胞仪、Transwell、混合淋巴细胞反应、FITC-Dxtra内吞实验、酶联免疫吸附试验等方法检测上述细胞的增生、分化成熟、迁徙、刺激淋巴细胞增生、内吞和分泌细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)等方面能力。结果与TNF-α相比,AngⅡ可以同等程度抑制DC的增生;可以诱导DC成熟标志表达,其能力弱于TNF-α;可以促进DC的迁徙,能力略弱于TNF-α;可以抑制树突状细胞的吞噬能力,其能力弱于TNF-α;促进相关细胞因子IL-6、IFN-γ分泌,与TNF-α作用基本一致;刺激淋巴细胞增生能力增强,其能力弱于TNF-α。结论 AngⅡ具有和TNF-α相近的能力,对于树突状细胞的功能起着正向调节的作用。