响应面优化贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株YH-18产芽孢培养基和培养条件

【目的】贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株YH-18是优良的抗病促生微生物,其制成的微生物菌剂具有无害、高效、环保等特点。通过优化菌株YH-18的培养基组分和培养条件,提高发酵液中的有效活菌数,以期增加发酵液中的芽孢数,延长储存时间,降低发酵成本,提高其在工业化生产发酵中的质量效益。【方法】以贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)菌株YH-18发酵液芽孢数为质量指标,采用单因素分析法对发酵液培养基(碳源、氮源、无机盐及其浓度)和培养条件(温度、转速、初始pH、装液量、接菌量)进行初步筛选。将初筛结果结合响应面试验设计[plackett-burman(PB)、最陡爬坡试验、box-behnken design(BBD)],筛选出对贝莱斯芽孢杆菌菌株YH-18产芽孢影响最为显著的因素进一步验证,建立各显著性因素的二次回归方程模型,完成对菌株YH-18培养基组分和培养条件的系统优化。对比优化前后发酵液产品的去菌体滤液对根癌农杆病菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58生长的抑制效果。每隔4个月测定优化后发酵液中的活菌数和芽孢数,考察优化...     

一株促生抗病的樱花内生细菌的分离、筛选和鉴定

【目的】解决樱属植物生产过程中根癌病的发生问题。【方法】采用组织分离法和稀释分离法分别从枝干和叶片中分离内生细菌;采用滤纸片法选拮抗菌,通过形态学、生理学和分子生物学法对筛选菌株进行种类鉴定;通过比色法测定筛选菌株的解有机磷的能力;以特定培养基测定菌株产IAA(anxin)的能力,通过测定OD₆₀₀值判断耐NaCl的能力。【结果】在樱花体内共分离到32株内生细菌,其中从枝条内分离到28株,从叶片内分离到4株。对32株内生细菌进行抑菌活性的筛选,有2株对根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)有明显的抑制作用。另对其中的1株细菌YH-20进行鉴定,鉴定结果为瓦雷兹芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。菌株YH-20具有良好的解有机磷和无机磷作用,其在第7天的解无机磷的量为178.43 mg/L,在第7天解有机磷的量为76.50 mg/L;具有较高的分泌IAA的能力,在第7天IAA的生成量为9.174 μg/mL;可在含10% NaCl的培养基上正常生长。【结论】筛选获得的瓦雷兹芽孢杆菌YH-20菌株具有抗植物根癌病菌和解磷能力,是一株在林木根癌病的防治上有很好应用前景的菌株。     

解淀粉芽孢杆菌HZM9菌株发酵液的抑菌谱及稳定性测定

【目的】将前期分离到的1株具有高效植物促生作用和生物防治作用的解淀粉芽孢杆菌HZM9开发为可以进行田间应用的菌剂。【方法】首先以10种土传病害病原菌为指示菌,用生长速率法测定了HZM9菌株发酵液对各病菌的抑制作用; 又以榉树枯萎尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为指示菌,测定了发酵液在不同条件下的稳定性。【结果】供试的10种土传病害病原菌经菌株HZM9发酵液处理后,菌丝生长均受到明显的抑制,特别是对尖孢镰刀菌和大豆菌核(Sclerotinia sclerotiorum)的抑菌率均达90%左右。菌株HZM9发酵液有很好的热稳定性,温度升至80 ℃后其抑菌作用变化十分微弱,抑菌率仍然保持在80%以上; 100 ℃处理30 min抑菌率会下降到66.55%,100 ℃处理120 min,抑菌率仍能达到58.78%; 在普通光照和紫外线照射后可以保持稳定的抑菌活性,在pH 5～9和蛋白酶的处理后抗菌活性也很稳定; 在4 ℃下可以持续储藏150 d。【结论】HZM9具有广谱抑菌活性和很好的稳定性,能够适用于土传病害的生物防治。     

3种促生有益微生物在上海梨树上的应用

【目的】探究有益促生微生物对梨树生长的影响,并分析其对梨树果实和土壤有效磷的影响,为促生有益微生物作为新型生物肥料在林业上推广应用提供理论依据。【方法】对每棵树采用每次根施800 mL稀释液(含100 mL原液)的方式,将吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007菌株、根围促生解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FZB42菌株和水拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)JZ-GX1菌株等3种促生有益微生物应用于上海地区生长的梨树上,比较分析它们在促进梨树生长、提升叶片生理指标(叶片的叶绿素含量和叶片组织中的含水率)、增加树体根际土壤有效磷含量,提高果实品质(果实的平均单果质量和可溶性固形物含量)中的作用。【结果】施菌处理8个月后,3种菌剂均可以明显地增加梨树的地径,以施用JK-SH007菌剂的效果最为显著,可以使地径增加0.34 cm; 施菌剂处理5个月后,3种菌剂可提高梨树叶片中叶绿素含量和叶片含水率,且以JZ-GX1菌剂的提高最为显著,可以使叶片中叶绿素含量(以SPAD值表示)增加1.8,使叶片含水率增加3.4%; 施菌处理8个月后,3种菌剂可增加根际土壤的有效磷含量,以施用JK-SH007的土壤增加最多,增加了42.9 mg/kg。施用JK-SH007菌剂可以显著增加6年生梨的平均单果质量,JK-SH007与FZB42菌剂能显著增加6年生梨的可溶性固形物含量。【结论】JK-SH007菌株对梨树具有促进树体生长、提高叶片叶绿素含量和叶片组织含水率、增加根际土壤有效磷含量、增加果实产量和可溶性固形物含量的作用; 相比其他两种促生微生物,JK-SH007菌株在6年生梨树上促生效果更好。     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株防治松材线虫病研究

【目的】松材线虫病是一种由松材线虫对赤松、马尾松、黑松等易感树种寄生取食继而引起树种死亡的病害,其发病速度快、易传播,传统的物理、化学防治成本高,且化学防治对环境易造成不可逆的污染,目前还没有较好的防治方法。为寻找安全有效的生物防治方法,笔者探究蜡样芽孢杆菌在温室下对马尾松盆栽苗松材线虫病的防治效果。【方法】采用人工皮接法将2 000、4 000和6 000条松材线虫AMA3虫株分别接种到2年生马尾松幼苗上,测定发生松材线虫病症状的临界值;蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株是从南京湿地松上分离出的具有杀线虫作用的松树内生细菌,在接种松材线虫AMA3虫株的前7天、当天和接种后第7天用灌根法灌入蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉水悬液,并设置对照试验:将发酵液、菌悬液和发酵滤液稀释10倍后,各取20 mL灌注到2年生马尾松根部,其中发酵液和菌悬液的菌体浓度为4×10⁸ cfu/mL,以无菌水和培养基处理为对照,比较蜡样芽孢杆菌不同发酵产物对松材线虫病的防治效果;以灌根法分别施入20 mL菌体浓度为4×10⁸、4×10⁷、2×10⁷ cfu/mL的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉水悬液;将蜡样芽孢杆菌以菌粉水悬液灌根法和菌粉涂抹法两种方式处理2年生马尾松幼苗。从施菌浓度、施菌方法和施菌时间等3个方面对经过低温喷雾干燥制备的蜡样芽孢杆菌菌粉进行防治松材线虫病试验,观察各处理下马尾松的发病情况。【结果】2年生马尾松接种松材线虫AMA3虫株后发病的临界值为4 000条。采用灌根法施入蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的发酵液和无菌发酵滤液后不能对松材线虫病起到预防作用,施蜡样芽孢杆菌菌悬液对松材线虫病有一定的预防效果(33%)。蜡样芽孢杆菌对马尾松松材线虫病的预防效果要大于治疗效果,健康马尾松在接种线虫之前以灌根法施入蜡样芽孢杆菌的预防效果会更好。将蜡样芽孢杆菌菌粉直接涂抹松枝,与菌粉水悬液灌根的方法相比,两者对松材线虫病的防治效果相当。同一菌体浓度下蜡样芽孢杆菌菌粉水悬液和发酵菌悬液对松材线虫病的预防效果相当;施用蜡样芽孢杆菌菌粉水悬液对松材线虫病的防治效果随菌体浓度的增加有所提高,当菌体浓度达到一定值以后,增加浓度也不会提高防治效果。【结论】在蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株防治2年生马尾松幼苗松材线虫病前,先筛选2年生马尾松接种松材线虫的临界值,能有效避免因接种松材线虫浓度过大而使真实防治效果降低的缺点。蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌悬液和经低温喷雾干燥制得的菌粉对松材线虫病均有一定的预防效果,在马尾松未感染松材线虫的健康状态施用蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株效果更好,通过菌粉涂抹法处理松枝可以对松材线虫病产生预防效果。     

两株樟树促生抗病内生细菌的分离、筛选及鉴定

【目的】解决城市绿化用樟树黄化病、溃疡病近年来多发的情况。【方法】本研究采集了上海地区健康的行道樟树枝条,分离、筛选并鉴定具有促生抗病作用的樟树内生细菌。通过组织切片法、组织匀浆法从健康樟树组织中分离内生细菌,再通过与2种樟树病害的病原菌进行平皿对抗试验,筛选出对樟树病害具有拮抗作用的菌株,同时还研究了拮抗细菌的解无机磷、解有机磷能力,以及分泌吲哚乙酸(IAA)的能力和耐盐性。在上海嘉定进行了施用优良菌株的田间试验,统计其促进生长情况。【结果】从樟树组织中分离到候选内生细菌共50株,其中有11株菌对樟树病害病原菌具有拮抗效果,4株菌具有解无机磷能力,2株菌具有解有机磷能力,2株菌具有产IAA能力,5株菌有较好的耐盐性。对其中综合性状优秀的2个菌株进行种类鉴定,菌株ZS-1被鉴定为微杆菌(Microbacterium resistens),菌株ZS-3被鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),发现2株菌对樟树扦插苗株高有较好的促生效果。【结论】筛选鉴定了樟树体内的2株优良内生细菌,为樟树促生抗病优良内生菌的研究与应用奠定了良好的基础。     

绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

【目的】构建高产麦芽糖α-淀粉酶的工程菌株并实现高效分泌表达。【方法】PCR扩增麦芽糖α-淀粉酶基因sva,再与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导型穿梭载体pHCMCO4-Pglv连接,构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并转入枯草芽孢杆菌进行表达,对重组酶进行SDS-PAGE分析,然后对重组菌株的生长及发酵条件进行优化。【结果】成功构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,SDS-PAGE分析发现,在55kDa处得到特异性蛋白条带。单因素试验结果显示,重组菌的最适诱导温度为35℃,最适接种量为4%(V/V),最适装液量为30mL。正交实验结果显示,重组菌的最佳发酵条件组合是诱导温度37℃、接种量5%(V/V)、装液量25mL,在此条件下发酵液粗酶活力达到257.3698U/mL。装液量对重组菌的产酶量影响显著。【结论】成功构建能高效分泌表达麦芽糖α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌株,经发酵条件优化后,重组酶产量显著提高10倍左右。     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫产卵和繁殖的影响

【目的】 已有研究表明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NJSZ-13菌株对于马尾松具有促生作用,且菌悬液的促生效果最佳。为了进一步解析和评价该菌对松材线虫的生防机理,在虫液和卵液中加入NJSZ-13菌株,研究该菌株对松材线虫的杀线效果以及对其产卵、卵孵化和繁殖量的影响。【方法】 首先通过离心将蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株分成菌悬液、发酵液和发酵滤液,并调配成原液、5、10、100和1 000倍的稀释液,其中菌悬液和发酵液的原液浓度为3×10⁸ cfu/mL,以无菌水和NB培养基为对照。①用浸渍法测定NJSZ-13菌株在24 h和48 h对松材线虫的杀线效果。②挑取10对生长良好的雌雄4龄幼虫于1.5 mL离心管,用NJSZ-13菌株处理24 h后将虫卵从离心管冲洗到35 mm培养皿中,统计各处理的产卵量。③在35 mm小皿中加入1 mL无菌卵液(约含400个卵)和NJSZ-13菌株,统计12、24和36 h的孵化虫数。④将100 μL线虫液(含500条松材线虫)与100 μL NJSZ-13菌株混合接入60 mm培养皿的灰葡萄孢中,在25 ℃培养箱培养5 d,用贝尔曼法分离线虫并计数。【结果】 ①NJSZ-13菌株的发酵液和发酵滤液原液处理24 h后的杀线率即高达100%,而其菌悬液原液处理48 h后的杀线率仅为81.47%。②NJSZ-13菌株原液能极显著地抑制松材线虫产卵,随着稀释倍数的增大,这种抑制作用逐渐减小。③NJSZ-13菌株的10倍稀释液处理松材线虫卵,在12 h时极显著地抑制卵的孵化,在24 h时仍达到显著水平,在36 h时仅发酵液和发酵滤液有显著的抑制作用。100倍稀释液处理12 h时,发酵液和发酵滤液相对于对照有显著差异,其他处理时间点均无显著差异。④NJSZ-13菌株原液和5倍稀释液处理松材线虫,其繁殖力与对照组有显著差异(P<0.05)。10倍稀释液处理松材线虫时,菌悬液对线虫繁殖力无明显的影响,而发酵液和发酵滤液与对照有显著差异。【结论】 蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的菌悬液、发酵液、发酵滤液均对松材线虫有杀线作用。其中,发酵液和发酵滤液的杀线效果更显著;NJSZ-13菌株能抑制松材线虫的产卵、卵孵化和繁殖,同样发酵液和发酵滤液的抑制效果较菌悬液明显。     

短小芽孢杆菌LYMC-3菌株对拟茎点霉的拮抗作用

【目的】短小芽孢杆菌LYMC-3菌株对稻瘟病、黄瓜枯萎病及棉花黄萎病等具有显著的防治效果,测定LYMC-3菌株对8种植物病原真菌的抑菌活性,检测其抑菌谱,为其推广应用提供依据。【方法】采用平板对峙法测定LYMC-3菌株对松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea)、松树脂溃疡病菌(Fusarium circinatum)、金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)、拟茎点霉(Phomopsis macrospora)、七叶树壳梭孢菌(Fusicoccum aesculi)、拟盘多毛孢(Pestalotiopsis theae)、山茶炭疽菌(Guignardia camelliae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothiorella)8种植物病原真菌的抑菌活性,筛选出抑菌活性最强的病原真菌,进行菌丝生长和孢子萌发抑制试验。【结果】LYMC-3菌株对8种供试植物病原真菌均有抑制作用,抑菌带长度及抑菌活性大小依次为:拟茎点霉>拟盘多毛孢>葡萄座腔菌>松球壳孢菌>七叶树壳梭孢菌>金黄壳囊孢菌>松树脂溃疡病菌>山茶炭疽菌。LYMC-3菌株发酵滤液对拟茎点霉菌丝生长的抑制率为70.36%,对其分生孢子24 h萌发抑制率为88.16%。【结论】短小芽孢杆菌LYMC-3菌株抑菌谱广,其发酵滤液对拟茎点霉有较强的拮抗作用。     

瓦雷兹芽孢杆菌FZB42菌株拮抗两种树木病原真菌及其机理研究

镰刀菌和交链孢菌是导致树木病害的两种常见病原真菌,常导致苗圃植物严重的危害和经济损失。瓦雷兹芽孢杆菌FZB42菌株具有高效生防性能和植物促生活性,为进一步探明该菌株的生防机理,首先测试了FZB42对镰刀菌和交链孢菌的抑制效果。在了解该菌株抑制作用的基础上,进一步构建质粒,通过同源重组的方式构建了FZB42的3个抗生素合成缺损菌株(ΔbmyA,ΔfenA、ΔbmyAΔfenA)。对这3个突变株进一步测试表明,FZB42合成的物质bacillomycin D和fengycin是抑制两种真菌生长的重要原因,且这两种物质的拮抗作用具有明显的协同强化效果。     

木腐真菌对松材线虫病疫木处理初探

【目的】筛选在疫木中迅速定殖扩展且能抑制松材线虫生长和繁殖的木腐真菌,在抑制松材线虫生长的同时快速降解疫木的木材成分,从而实现疫木中松材线虫在被媒介昆虫传带前就被大幅减少或不能正常进入蛹室,即在侵染循环的疫木环节即被阻断的目标,为松材线虫病的有效防控提供参考。【方法】分别将2 000条松材线虫接种至培养成熟的不同木腐真菌菌落上,通过室内平板试验测定不同木腐真菌对松材线虫生长和繁殖的影响;其次,将黑松木块接种至筛选获得具有抑制松材线虫生长和繁殖作用的木腐真菌菌落上,探究其对黑松木材的降解作用。以此筛选出能明显影响松材线虫生长繁殖且具有分解木材能力的优良木腐真菌;最后将筛选获得的优良木腐真菌经大量液体培养和固体培养繁殖后接种至田间当年染松材线虫病60 cm长的伐倒松木木段上,分别于接种后的120和150 d用电钻钻孔取木样,后将木段劈开,收集天牛蛀道周围的木样,分离并统计木样内松材线虫数量,比较接种前后疫木内松材线虫数量的变化,分析木腐真菌对疫木中松材线虫种群的影响。【结果】在室内培养茯苓菌的平板上松材线虫不能成活,在黄孢原毛平革菌、B18、C11和D16菌落上松材线虫的生长和繁殖也明显受到抑制。以接种茯苓菌后木材的质量损失率最大(7.30%),其分解纤维素和半纤维素能力也最强,分解率分别为19.21% 和29.65%;分解木质素能力最强的为黄孢原毛平革菌,分解率达到31.59%。在田间接种试验中,接种同种木腐真菌,以接种液体培养菌丝的效果优于接种固体培养菌丝的。不同木腐真菌中,以接种茯苓后减少疫木内的松材线虫数量显著优于接种其他木腐真菌处理的。接种茯苓液体培养菌丝和固体培养菌丝150 d后,均可最大程度减少疫木内松材线虫数量,减少率分别为74.51% 和65.78%。接种茯苓液体培养菌丝后天牛蛀道的松材线虫数量较接种前减少了65.45%。【结论】茯苓在室内外分解松木和减少疫木内松材线虫两方面效果均最佳;同种木腐真菌,以接种液体培养菌丝的效果优于接种固体培养菌丝的。研究表明,采用不利于松材线虫生长和繁殖的木腐真菌进行松材线虫病的疫木除治具有技术可行性和广阔的应用前景。     

鞭毛蛋白毒素导致的黑松超微结构病理学变化

【目的】以松材线虫、致病细菌荧光假单胞菌及其鞭毛蛋白毒素、非致病细菌缓慢葡萄球菌等材料对3年生黑松进行接种试验,通过其样枝切片的超微结构病理学变化,了解致病细菌毒素在松萎蔫病中的作用。【方法】分别以野生松材线虫悬液、荧光假单胞菌菌株GcM5-1A无细胞滤液、无菌松材线虫+荧光假单胞菌菌株GcM5-1A、荧光假单胞菌菌株GcM5-1A的鞭毛蛋白毒素Flg、无菌松材线虫+缓慢葡萄球菌菌株AM2C、无菌松材线虫悬液接种黑松,以健康松树为对照。对于发病的处理,在接种后病程的第2或第3阶段取样; 对于未发病的处理,则在接种11 d后取样。取样时,在距离接种点不同位置进行,然后制备透射电镜样品,观察这些切片的超微结构变化。【结果】野生松材线虫、GcM5-1A无细胞滤液、无菌松材线虫+GcM5-1A、GcM5-1A鞭毛蛋白毒素等4种处理下黑松树体组织的超微结构均遭受严重破坏,病理学变化趋势一致。无菌松材线虫、无菌松材线虫+AM2C等两种处理下树体组织基本未遭受破坏,超微结构观察结果与健康松树的基本一致。GcM5-1A无细胞滤液与野生松材线虫的处理中,在靠近接种点处,前者处理下切片的超微结构受害比后者严重; 在远离接种点处,前者受害反而比后者轻。通过GcM5-1A无细胞滤液与野生松材线虫接种观察结果比较,发现松材线虫在树体内的移动加速了致病菌的扩散,导致毒素的增产和扩散,加速了松树的死亡。【结论】在接种处理的第2阶段是松萎蔫病发展的关键阶段。无菌松材线虫不能致死松树,而松材线虫携带的致病细菌产生的毒素是致死松树的真正原因,验证了松萎蔫病是松材线虫与其携带致病细菌的复合侵染导致病害的假说,而松材线虫在树体内的移动加速了致病菌的扩散,最终导致松树加速死亡。     

基于SSR标记的丛生竹杂种鉴定、遗传分析和指纹图谱构建

【目的】 准确鉴定丛生竹杂交种,分析杂种及其亲本的遗传关系,开发可以利用的指纹图谱。【方法】 以孝顺竹(Bambusa multiplex)×麻竹(Dendrocalamus latiflorus)、孝顺竹(B. multiplex)×粉单竹(B. chungii)两个杂交群体为材料,从已公布的竹子SSR引物中随机选取30对引物进行筛选、检测和分析。【结果】 发现6对SSR引物(P8、P9、P18、P19、P20、P27)适于孝顺竹×麻竹组合的杂种鉴定和遗传分析,鉴定结果表明34个子代全部为真实杂种,杂种真实率为100%;另外6对SSR引物(P2、P9、P10、P11、P20、P28)则适于孝顺竹×粉单竹组合的杂种鉴定和遗传分析,鉴定结果表明59个子代中有54个真实杂种,杂种真实率为91.5%。孝顺竹×麻竹的杂种遗传了较多的母本位点,而孝顺竹×粉单竹的杂种则遗传了较多的父本位点。利用SSR引物扩增出的位点分别构建了两个杂交群体的指纹图谱,为品种保护提供了保障。【结论】 SSR引物能有效地鉴定丛生竹杂交种的真伪,父母本的遗传位点在不同杂交组合的子代中遗传概率不同,杂交群体指纹图谱的构建可为品种保护提供保障。     

两株我国南北松材线虫虫株形态指标与致病力比较

【目的】松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是世界多国公认的重大外来入侵物种,可引起松树大量死亡。目前,该虫已扩散至我国辽宁省的多个区县,打破了松材线虫最适温度线。通过对不同地理来源的两株松材线虫虫株的比较研究,试图阐释松材线虫向我国北方快速扩散的原因。【方法】通过比较我国南方松材线虫虫株AMA3和北方松材线虫虫株FCBX的形态指标值、不同温度条件下在灰葡萄孢培养基上的繁殖力,进而测定两虫株对黑松的致病力以及在黑松体内的繁殖量差异,解析松材线虫在我国北方地区的适应性。【结果】虫株AMA3和FCBX在形态学特征上无显著差异,均在伞滑刃属线虫测量范围之内;在15~35 ℃范围内,北方虫株FCBX和南方虫株AMA3在灰葡萄孢培养基上,随着温度的升高,繁殖量逐步增加。且FCBX虫株的繁殖数量除在30 ℃条件下稍低外,在其他温度条件下繁殖量均高于AMA3的繁殖数量。在低温(15~20 ℃)条件下,FCBX虫株的繁殖数量远高于AMA3虫株,差异显著;接种AMA3和FCBX后,黑松感病程度具有差异,FCBX相对于AMA3的致病力更强。在接种35 d后,FCBX的对黑松死亡率达到80%,感病指数为85;而AMA3对黑松的死亡率为60%,感病指数为73;接种35 d后,FCBX在黑松体内的繁殖数量大于AMA3虫株,但差异不显著。【结论】与南方虫株AMA3相比,北方虫株FCBX在灰葡萄孢上的繁殖能力、黑松体内的繁殖数量、对黑松的致病力等方面更强。松材线虫已突破最适温度线,在北移过程中经过了低温驯化,在低温条件下具有更强的繁殖能力和对低温的适应性。     

利用腐生线虫加速替代疫木中松材线虫种群数量研究

【目的】筛选在疫木中容易定殖且能够加快树体内松材线虫种群消退的腐生线虫,在媒介昆虫羽化前大幅减少疫木中松材线虫种群数量,使得松材线虫病害的传播得到有效控制。【方法】从安徽、四川和江苏3省的部分疫区采集的疫木中分离获得8种腐生线虫。将8种腐生线虫以1、2、4倍于木块中松材线虫数量的接种量接种至疫木块中,以接种无菌水的木块为对照,分别置于15和25 ℃下培养15和30 d,分离并计数疫木块中松材线虫和腐生线虫的种群数量,分析不同接种量及温度下,接种腐生线虫对疫木中松材线虫种群数量的影响。野外条件下,将8种腐生线虫接种至松材线虫病疫木段中,接种量为2.0×10⁵~2.5×10⁵条,以接种无菌水的木段作为对照。120 d后钻取木样,150 d后捕获松墨天牛并收集蛹室周围木样,分离并计数木样中的松材线虫数量,比较接种前后疫木内松材线虫数量的变化,分析腐生线虫对疫木整体、天牛及蛹室周围携带的松材线虫种群的影响。【结果】室内接种试验表明,15 ℃培养时,在第30 天接种量为4倍的虫株JHS2处理组和接种量为1倍的虫株JHS4处理组能显著降低松材线虫的数量。25 ℃条件下培养的第15 天,3种不同接种量的虫株JHS4处理组中松材线虫减少率均显著高于对照。培养 30 d后,接种量为4倍的虫株JHS4处理木块中松材线虫减少率显著高于对照,为对照的2.9倍。野外接种试验结果表明接种虫株JHS4能加速木段内松材线虫的消亡,与对照相比,木段整体松材线虫的减少率为96%,显著高于同期对照(74%);此外,所有处理组的蛹室周围木样和羽化天牛所携带的松材线虫量均低于对照。其中,虫株JHS4处理组蛹室周围木样和羽化天牛携带的松材线虫数量最低,每克蛹室木样中携带松材线虫的数量仅为20 条,平均每头天牛携带松材线虫的数量为132条。【结论】腐生线虫能够加快疫木中松材线虫种群消退,可影响天牛蛹室及天牛所携带的松材线虫数量。利用腐生线虫对疫木中松材线虫具有一定的生防潜力,将其应用于松材线虫病的疫木除治具有技术可行性和广阔前景。     

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆及表达分析

【目的】克隆吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007(Burkholderia pyrrocinia JK-SH007)多聚半乳糖醛酸酶基因(BpPG),并阐明BpPG基因在B. pyrrocinia JK-SH007定殖中的生物学功能。【方法】通过设计特异性引物(PG-F、PG-F)克隆BpPG基因,并对其全长基因进行生物信息学分析; 采用MEGA 5.0软件进行系统发育树分析; 将B. pyrrocinia JK-SH007接种杨树,利用实时荧光定量PCR方法,分析BpPG基因在B. pyrrocinia JK-SH007定殖过程中的差异表达。【结果】BpPG基因全长2 001 bp,编码666个氨基酸,预测蛋白质分子量69.23 ku,理论等电点为8.37; BpPG蛋白有6个蛋白质结合位点,属于Glycosyl hydrolases family 28家族,为亲水性蛋白,不具有信号肽。二级结构主要包括α-螺旋、β折叠、延伸链和无规则卷曲,三级结构预测结果与二级结构相符。系统进化分析表明,BpPG与PG(GenBank 序列号WP 034181566.1)具有同源性。实时荧光定量PCR结果显示B. pyrrocinia JK-SH007定殖过程中,不同时期的BpPG基因表达量存在差异。【结论】克隆得到BpPG基因,BpPG基因在进化上是保守的,其极有可能在B. pyrrocinia JK-SH007定殖过程中发挥作用。