草鱼免疫应答的初步研究

研究了草鱼在不同水温条件下受抗原刺激后其中和抗体的变化。15℃培养条件下中和抗体上升缓慢,9周内滴度低于1:8;20℃时,3周后抗体可上升到1:256,最高达1:5270,而在25℃时,1周中和抗体即达到1:570,最高可达1:20000以上。并探索了从草鱼血清中提纯抗体的条件,研究其抗体的特性。草鱼血清中的抗体为大分子蛋白,容易解离为抗原性相同,分子量近似于人IgG的较小分子,含有较多的二硫键,具有类似IgM的某些特性。     

草鱼感染GCRV后血液中淋巴细胞变化及BCL10表达分析

为了研究草鱼BCL10基因在草鱼出血病中的应答机制, 文章克隆了BCL10基因, 并利用生物信息学、荧光定量和血涂片等技术对其进行了分析。生物信息学结果显示, BCL10基因开放阅读框为738 bp, 编码245个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示, 感染病毒后草鱼体内BCL10表达量持续上调, 在肝胰腺和中肾中第4天达到峰值, 第7天表达量开始下调。血涂片显微镜观察发现了血液中淋巴细胞在感染病毒后第1到第4天下降, 第7天时上升。肾脏的组织病理学观察也发现中肾中肾小管上皮细胞第1到第7天逐渐空泡化, 脱落坏死。以上结果表明, BCL10基因参与了草鱼应对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)入侵的免疫应答。     

GCRV感染存活草鱼的血清蛋白表达特性

为挖掘草鱼关键抗性分子,研究利用4D label-free定量蛋白质组学技术系统分析了团队前期获得的GCRV感染存活草鱼(候选抗性草鱼)与对照草鱼的血清蛋白表达差异。共鉴定到858个草鱼血清蛋白, 329个蛋白在两类草鱼中差异表达,其中163个蛋白在候选抗性草鱼血清中显著高表达, 166个蛋白显著低表达。差异表达蛋白的功能主要注释为体液免疫反应调节相关蛋白,显著富集到补体凝血级联、细胞黏附和铁死亡等信号通路。对差异表达的免疫相关蛋白进行分析发现,候选抗性草鱼血清中体液免疫分子MASP2、C4a、C4b、C7b、C8b、C8g、C9、CFI、C3a.1、C3a.2、C3a.3和C3a.6等补体和抗原提呈相关免疫分子MHC1UBA和IGL4V8等蛋白表达水平显著高于对照草鱼,而T细胞免疫相关分子TRAV、IGHV1-1、IGHV2-1、IGHV6-1、IGHV3-2和IGHV11-2等蛋白表达水平显著低于对照草鱼。免疫印迹检测进一步证实,以C3和IgM为代表的体液免疫分子在候选抗性草鱼血清中显著高表达,可能与草鱼抗病能力关联。研究将为高抗性草鱼的选育提供可参考的分子资源。     

水温与草鱼免疫应答关系的研究

通过在不同水温条件下，用ＣＦＲＶ疫苗免疫后的草鱼血清中和抗体效价和免疫保护力的变化探讨水温与草鱼免疫应答的关系。结果表明：（１）水温在１０℃以下，草鱼的免疫应答受到抑制，它对ＣＦＲＶ疫苗的免疫临界温度是１０℃；（２）在免疫临界温度之上，草鱼的免疫应答随温度的升高而增强，超过草鱼的适宜生长温度（３２℃以上），其应答反应反而有下降的趋势；（３）免疫诱导期的水温是决定草鱼免疫应答发生与否和免疫应答强弱的     

草鱼鳃介导草鱼呼肠孤病毒免疫应答

采用草鱼呼肠孤病毒腹腔注射草鱼, 通过定量RT-PCR检测了12个抗病毒免疫相关基因在鳃中不同时间点的表达模式, 以了解鳃对内源性病毒的免疫应答。模式识别受体基因CiTLR3、CiTLR7、CiTLR22、CiRIG-I、CiMDA5、CiLGP2、CiNOD1和CiNOD2, 以及干扰素基因CiIFN-I的表达在注射病毒后12h、24h、48h及72h基本都上调。IgM基因的表达仅在72h上调。接头分子CiMyD88和CiIPS-1基因的表达在早期下调（6h）, 然后逐渐上升。为了证实病毒感染的可靠性, 通过RT-PCR检测了病毒VP4基因。结果表明草鱼鳃在抗病毒免疫方面发挥着重要作用。       

GCRV 及其细胞灭活苗对草鱼 4 种酶活性的影响

以G1组1×10^6 TCID50／mL、G2组1×10^3 TCID50／mL两种不同浓度草鱼呼肠孤病毒通过腹腔注射感染草鱼,G3组用草鱼呼肠孤病毒细胞灭活苗注射免疫草鱼,并设计对照组：用相同体积的PBS腹腔注射草鱼,分别在注射后1、2、7、14d取血清及肝脏,测定其酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、髓过氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性,通过各项酶活力变化规律来研究病毒感染及疫苗免疫对草鱼非特异性免疫功能的影响。结果表明：ACP活性,与对照组比较血清中各处理组变化不显著,肝脏中大体呈现先降低后升高的趋势;AKP活性,血清中G1组呈现先升高后降低的趋势,G2、G3组呈现持续升高的趋势,肝脏中G1、G2组均呈现先降低再升高再降低的趋势,G3组呈现先升高再降低的趋势;MPO活性,血清中G1组呈上升趋势,G2组呈先升高再下降的趋势,G3组呈现升高再降低再升高的趋势,肝脏中G1组呈现先降低再升高再降低的趋势,G2组与G3组均呈现先升高再降低的趋势;SOD活性,血清中G1组呈现先升高再降低的趋势,G2组呈现升高的趋势,G3组呈现先高再降低再升高的趋势,肝脏中G1组呈现先升高后降低的趋势,G2组呈现降低的趋势,G3组呈现先降低后升高的趋势。结果显示：MPO及SOD两种酶活性在G1、G2及G3血清中变化趋势不一,说明这两种酶活性跟刺激物浓度及种类存在一定关系。     

草鱼鳃介导草鱼呼肠孤病毒免疫应答（英文）

采用草鱼呼肠孤病毒腹腔注射草鱼,通过定量RT-PCR检测了12个抗病毒免疫相关基因在鳃中不同时间点的表达模式,以了解鳃对内源性病毒的免疫应答。模式识别受体基因CiTLR3、CiTLR7、CiTLR22、CiRIG-I、CiMDA5、CiLGP2、CiNOD1和CiNOD2,以及干扰素基因CiIFN-I的表达在注射病毒后12h、24h、48h及72h基本都上调。IgM基因的表达仅在72h上调。接头分子CiMyD88和CiIPS-1基因的表达在早期下调(6h),然后逐渐上升。为了证实病毒感染的可靠性,通过RT-PCR检测了病毒VP4基因。结果表明草鱼鳃在抗病毒免疫方面发挥着重要作用。     

草鱼呼肠孤病毒新分离株（GCRV991）的病毒学特性分析

从湖南长沙分离到一株致病性强的草鱼呼肠孤病毒 (GCRV991) ,该病毒能使草鱼CIK ,肥头鲤FHM细胞产生明显的CPE ,对水生动物BF2 ,EPC及哺乳动物BHK ,VERO细胞株不敏感。中和实验显示 ,GCRV873 抗体能有效地中和GCRV991病毒颗粒 ,形成抗原抗体免疫复合物。纯化的病毒核酸与蛋白经SDS PAGE分离 ,分别呈现 11条清晰的核酸带及 5条主要与 2条微量结构多肽图谱 ,其核酸蛋白分子量大小与GCRV873 相近似。该毒株基因组总分子量为 14.48× 10 6kD ,大小范围是 0 .5 5～ 2 .6 1× 10 6kD ;5条主要与两条微量结构多肽分子量近似值分别为136kD、132kD、6 5kD、43kD、34kD及 138kD、82kD。上述结果提示 ,新分离的GCRV991与GCRV873 具有相似的抗原性     

草鱼呼肠孤病毒新分离株(GCRV991)的病毒学特性分析

从湖南长沙分离到一株致病性强的草鱼呼肠孤病毒(GCRV991),该病毒能使草鱼CIK,肥头鲤FHM细胞产生明显的CPE,对水生动物BF2,EPC及哺乳动物BHK,VERO细胞株不敏感.中和实验显示,GCRV873抗体能有效地中和GCRV991病毒颗粒,形成抗原抗体免疫复合物.纯化的病毒核酸与蛋白经SDS-PAGE分离,分别呈现11条清晰的核酸带及5条主要与2条微量结构多肽图谱,其核酸蛋白分子量大小与GCRV873相近似.该毒株基因组总分子量为14.48×106kD,大小范围是0.55～2.61×106kD;5条主要与两条微量结构多肽分子量近似值分别为136kD、132kD、65kD、43kD、34kD及138kD、82kD.上述结果提示,新分离的GCRV991与GCRV873具有相似的抗原性.     

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因的表达与产物纯化

草鱼呼肠孤病毒是引起草鱼出血病的主要病原,隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属。序列分析表明,GCRVS2片段长为3877核苷酸,编码一个分子量为138kDa的蛋白VP2,具有RNA聚合酶性质。为进一步了解该病毒RNA聚合酶特性,本研究在对GCRV RNA聚合酶基因(GCRV—RdRp)保守区(约1．5kb)重组质粒pR／RRp高效表达的基础上,分别构建了编码GCRV RNA聚合酶保守区N端与C端部分基因的pR／RRpN及pR／RRpC重组表达载体,并在原核细胞中获得成功表达。筛选的重组表达菌株经IPTG诱导培养,得到分子量分别为98kDa、103kDa的目的表达融合蛋白。Western blot分析表明,该表达产物与兔抗GCRV—VP2血清呈阳性反应。通过ProBond柱亲和层析,纯化了融合有6个组氨酸的重组表达产物,并获得约90％纯的目的蛋白。上述结果为GCRV RNA聚合酶特性分析提供了依据。     

草鱼转铁蛋白基因的克隆及其组织表达

转铁蛋白(Transferrin,Tf)功能广泛,不仅参与机体内铁离子的运输和代谢,还在细胞呼吸、细胞生长和增殖中起重要作用,而且它具有抗菌杀菌的功能。研究从草鱼肝肾全长cDNA文库中克隆得到草鱼转铁蛋白基因(CtTf),该基因全长cDNA5′非编码区包含31bp,最大开放阅读框为2025bp,编码674个氨基酸,3′非编码区为266bp。研究使用了Signal P、SMART等在线软件对草鱼转铁蛋白全长cDNA的分子特征进行预测,结果显示CtTf编码的蛋白质N-端有1个由15个氨基酸残基组成的信号肽,第24-334个和第338-665个氨基酸为2个保守的结构域,二者同源率为31%。与其他物种的转铁蛋白类似,草鱼转铁蛋白每个结构域包含4个铁离子结合位点,它们在两个结构域中的位置相对保守,除了这8个铁离子结合位点外,还存在多个完全保守的氨基酸位点。草鱼转铁蛋白与人及其他物种有很高的同源性,与其他鲤科鱼类的同源性为65%-73%;与海洋鱼类同源性为43%-50%;与两栖、爬行、鸟类、哺乳类的同源性为40%-42%。系统进化树也显示草鱼转铁蛋白基因与斑马鱼和鲤鱼的亲缘关系最近。RT-PCR的实验结果表明,在草鱼肝、肠、肾、脾、心、肌肉、鳃和脑8种组织中,草鱼转铁蛋白基因在肝中的表达量最高,其次为脾和肠,在鳃和脑中有痕量表达。       

草鱼cadm2b基因的克隆及在成体组织中的表达分析

为研究CADMs（Cell adhesion molecules）在草鱼构建抵御病害感染的第一道防线中发挥的作用,用RT-PCR和RACE方法结合测序分析,在草鱼脑组织中检测到了该基因家族成员cadm2b基因的4条不同的cDNA全长序列。序列比对结果表明这4条全长cDNA在5'端的序列完全相同,在3'端的3个局部区域有不同片段的缺失。因此,可以确定这4条不同的mRNA是cadm2b的不同剪接体。这4条不同的剪接体被分别命名为cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6。cadm2b的cDNA序列全长1669 bp,开放阅读框（ORF）1203 bp,编码400个氨基酸。cadm2bX2的cDNA序列全长2783 bp,开放阅读框长1323 bp,编码440个氨基酸;cadm2bX3的cDNA序列全长2755 bp,开放阅读框1296 bp,编码431个氨基酸;cadm2bX6基因的cDNA序列全长2649 bp,开放阅读框1161 bp,编码386个氨基酸。根据碱基序列所进行的氨基酸序列和蛋白结构预测显示这4个CADM2b蛋白亚型都具有CADM家族保守的4个功能区,但其C端的蛋白结合位点存在差异。CADM2b具有近膜4.1蛋白结合位点和Ⅱ型PDZ蛋白结合位点,CADM2bX2、X3缺失了PDZ蛋白结合位点,而CADM2bX6则同时缺失4.1蛋白和PDZ蛋白的结合位点。实时定量RT-PCR检测结果显示cadm2b剪接突变体是该基因mRNA的主要形式。半定量RT-PCR和套式PCR实验检测结果表明cadm2b基因在草鱼成体脑中高水平表达,在肝、肾、心脏和肌肉组织中有微量表达。这种表达模式提示草鱼中CADM2b主要是由非免疫细胞,而不是由免疫肥大细胞合成分泌的细胞黏附因子,可能通过介导免疫肥大细胞与病原靶细胞的黏附而起非特异性抵御病害感染的作用。     

几种鱼类细胞对草鱼呼肠孤病毒敏感性的研究

比较研究了鲫鱼异倍体细胞系(CAB-80)、团头鲂尾鳍细胞系(BCC)、大鳞副泥鳅雌核发育单倍体胚胎细胞系(PHG)、草鱼胚胎细胞系(GCE)、草鱼尾鳍细胞系(GCRF-2)、草鱼肾细胞系(GCK-84)及其四个克隆对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的敏感性。证实了这些细胞(PHG除外)在不同程度上对GCRV敏感,其中以GCK-84的敏感性最强。这表明,在体外培养条件下,GCRV并无严格的种族特异性。用经GCK-84传代的病毒感染草鱼种,能复制出典型的出血病症状。用GCK-84检测了病毒在GCK-84、GCRF-2、CAB-80、BCC和PHG中的滴度(TCID_(50/ml)),其值分别为8.24,7.36,2.90,2.15和1.33。4个克隆与肾细胞系对病毒的敏感程度亦不尽相同,其滴度在6.3到9.32之间变化。上述结果对细胞工程抗病育种预示有较大的潜在意义。在电镜下可见GCRV对被感染的细胞造成了严重的破坏。病毒为平均直径58nm的球形颗粒,具有一个高度电子密度的核心,平均直径约为38nm。病毒在细胞中的分布方式有三种:即散布于细胞质中的、呈晶格状包于一膜状结构中的和整齐或不整齐地聚集在一起但无膜包裹的。     

感染GCRV的草鱼miRNA测序与比较分析

为探索基于高通量筛选抗性主效miRNA功能分子的方法应用于抗性草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的选育,研究借助高通量测序鉴定分析感染GCRV前后的草鱼头肾组织中miRNAs.测序结果共鉴定出821个成熟miRNAs,其中118个在GCRV攻毒组特异表达,82个为未攻毒组特有;差异分析结果显示,G...     

草鱼TP53INP1基因的克隆及微囊藻毒素对其表达的影响

为深入研究肿瘤蛋白p53诱导核蛋白1(Tumor protein 53-induced nuclear protein 1, TP53INP1)的结构及其在微囊藻毒素-LR(MC-LR)胁迫下的表达变化,以MC-LR诱导的草鱼(Ctenopharygodon idella)肝脏转录组测序获得的unigenes序列为基础,扩增获得了TP53INP1基因的cDNA序列(GenBank登录号:MG797689),其中开放阅读框(Open reading frame, ORF)为759 bp,编码252个氨基酸,属于β类型,具有4个PEST结构。氨基酸同源性分析结果表明, TP53INP1具有较高的保守性,其中与鱇浪白鱼(Anabarilius grahami)相似性最高。系统进化分析结果表明其与鱇浪白鱼(Anabarilius grahami)、斑马鱼(Danio rerio)等鱼类聚为一大支。采用荧光定量PCR分析发现TP53INP1基因在草鱼各组织中广泛分布,其中,在肝脏和血液等组织中表达丰富,显著高于在头肾组织中的表达(P<0.05)。采用Western blot检测分析不同剂量...     

半滑舌鳎AKT-ineracting protein基因的克隆及免疫应答表达分析

研究克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis膜蛋白AKT-interacting protein (AKTIP)基因, 研究了其在健康组织中的表达模式、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后免疫组织和不同病原物刺激外周血淋巴细胞中的表达特征。通过常规克隆和RACE技术, 获得的半滑舌鳎AKTIP基因全长cDNA序列为1224 bp, 其中包括5'-UTR为116 bp, 3'-UTR为117 bp和完整的ORF序列891 bp, 编码296个氨基酸, 预测蛋白质的等电点(PI)为9.12,分子量是33.74 kD; 同源比对发现半滑舌鳎AKTIP的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性; 荧光实时定量PCR (qRT-PCR)检测到半滑舌鳎各个组织中均有AKTIP基因的表达, 在卵巢中表达量最高; 鳗弧菌感染半滑舌鳎后, AKTIP基因在肝、鳃、血液、肠、头肾和脾中均上调表达; 病原模拟物PGN、LPS、poly I:C和WGP刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞均诱导AKTIP基因下调表达。研究表明半滑舌鳎AKTIP基因参与了机体免疫反应为给半滑舌鳎免疫防御技术的研究提供理论依据。     

鲢神经肽Y基因的克隆及其在禁食-恢复投喂条件下的表达特征分析

为深入研究神经肽Y对鲢摄食活动的调节作用,研究利用同源克隆方法获得鲢NPY基因cDNA全长序列,并检测在禁食-恢复投喂条件下,NPY在脑和肝脏中的表达情况. 结果表明: 鲢NPY基因cDNA全长782 bp,包括5'端非翻译区68 bp,3'端非翻译区423 bp,开放阅读框291 bp,编码96个氨基酸; 氨基酸相似性比较和系统进化分析结果显示NPY较为保守; NPY在所检测的13个组织中均有表达,并且在脑垂体中表达量最大; 禁食导致NPY mRNA在脑中的表达量显著上升,恢复投喂6h后下降到基本水平,表明NPY对鲢摄食有促进作用; 在肝脏中,禁食前5天NPY mRNA表达量显著上升,禁食第7天急剧下降,恢复投喂4h后下降到基本水平; NPY mRNA在脑和肝脏中的表达具有组织差异性,其在肝脏中的具体作用机制有待进一步研究. 研究结果为探讨NPY在鲢中的生物学功能和在遗传育种中的作用提供了理论依据。     

大菱鲆脂联素受体基因的克隆及饲料糖脂比对其表达的影响

脂联素作为一种重要的细胞因子在哺乳动物中起到调节糖脂代谢的重要作用, 为探究脂联素在大菱鲆糖脂代谢中是否具有同样的调节作用, 研究利用分子克隆和RACE技术克隆到了大菱鲆脂联素AdipoR1受体和AdipoR2受体的基因全长序列。其中AdipoR1受体的核苷酸序列全长为1125 bp, 共编码375个氨基酸, 氨基酸序列与其他脊椎的同源性都很高。AdipoR2受体的核苷酸序列全长为1940 bp, 共编码380个氨基酸, 氨基酸序列与其他脊椎动物同源性也都很高。蛋白跨膜结构域预测得出大菱鲆AdipoR1和AdipoR2都具有7个明显的跨膜区, 最优拓扑模型为N端在细胞内侧模型, 与其他脊椎动物相同。配制不同糖脂比(1鲶6, 1鲶2, 2鲶1和14鲶1)的饲料养殖大菱鲆9周, 利用实时荧光定量PCR技术检测大菱鲆肌肉和肝脏中脂联素受体基因的表达量。结果显示, 在饲料糖脂比为1鲶2的处理组中, 大菱鲆肌肉中AdipoR1的表达量显著低于糖脂比为1鲶6的处理组(P<0.05), 但与其他2组无显著差异。饲料糖脂比的变化对肌肉中AdipoR2和肝脏中这2种受体的表达量均没有产生显著影响(P>0.05)。由此可见, 饲料糖脂比的变化可能通过改变脂联素受体的表达量, 从而间接影响大菱鲆体内脂联素的作用。AdipoR1和AdipoR2对饲料糖脂比变化的反应不同步, 而且肌肉和肝脏中脂联素受体对饲料糖脂比变化的反应也存在不同。适量提高饲料糖脂比可以显著下调肌肉中AdipoR1的表达。