不同能量摄入水平对围产期奶牛肝载脂蛋白E mRNA丰度的影响

将年龄、胎次相同，年产奶量大于5000kg的围产期健康奶牛30头随机分为3组，每组10头。低能组饲喂中国奶牛饲养标准（2000）减少20％日粮（能量摄入80％组）、对照组饲喂中国奶牛饲养标准（2000）日粮（能量摄入100％组）和高能组饲喂中国奶牛饲养标准（2000）增加20％日粮（能量摄入120％组），试验从产前28d开始至产后56d结束，产后各组奶牛均饲喂标准日粮。采用内对照RT-PCR方法检测了不同能量摄入围产期奶牛肝组织载脂蛋白E（apolipoprotein E，apoE）mRNA丰度。结果表明：apoE mRNA相对表达量从产前28d至产后56d各组均呈现先升高后降低的趋势，各组apoE mRNA水平均在产后一天达到最大值（P〈0．01），且产后均高于产前（产后56d除外）；产前14d至产后28d低能组apoE mRNA相对表达量均高于其他两组（P〈0．05或P〈0．01），高能组在产后28d和56d高于对照组（P〈0．01）。可见，围产期奶牛能量摄入水平对肝组织载脂蛋白E mRNA丰度有显著影响。     

干乳期能量摄入水平对围产期奶牛肝载脂蛋白B100mRNA丰度的影响

将年龄、胎次相同，年产奶量大于5000kg的围产期健康奶牛30头随机分为3组，每组10头。Ⅰ组饲喂中国奶牛饲养标准（2000）减少20％日粮（能量摄入80％组）。Ⅱ组饲喂中国奶牛饲养标准（2000）日粮（能量摄入100％组），Ⅲ组饲喂中国奶牛饲养标准（2000）增加20％日粮（能量摄入120％组）。试验从产前28d开始至产后56d结束，产后各组奶牛均饲喂标准泌乳日粮。采用内对照RT—PCR方法，检测了干乳期摄入不同能量的围产期奶牛肝脏活体组织载脂蛋白B100（apoB100）mRNA丰度。结果表明。apoB100mRNA相对表达量，产前至产后Ⅰ、Ⅲ组均呈先升高后降低的趋势，Ⅲ组产后apoB100mRNA丰度降低了61．45％，Ⅰ组呈逐渐降低的趋势，各组均在产后28d达最低值（Ⅰ组，P〈0．05；Ⅱ、Ⅲ组，P〈0．01）。产前14d至产后1d，apoB100mRNA相对表达量Ⅲ组高于Ⅰ组，Ⅰ组高于Ⅱ组，组间差异极显著（P〈0．01）；产后28d。Ⅰ组高于Ⅱ、Ⅲ组（P〈0．05）。由此可见，围产期奶牛能量摄入水平对肝脏载脂蛋白B100mRNA丰度有显著影响。     

竞争定量RT-PCR检测不同能量摄入对围产期奶牛肝PCmRNA丰度的影响

建立了奶牛肝PCmRNA丰度的竞争定量RT-PCR检测方法,优化的PCR反应条件(25μL)为:60℃退火、30个循环数、1:1的PC cDNA与PC DNA竞争模板浓度比。同时应用该方法检测不同能量摄入对围产期奶牛肝PCmRNA丰度的影响,结果表明:低能量日粮饲喂干奶期奶牛,肝脏PC mRNA丰度升高,而干奶期高能饲喂奶牛,肝脏PC mRNA丰度降低。说明干奶期低能饲喂奶牛,可以增强围产期奶牛的肝糖异生能力。     

摄入不同能量的围产期乳牛肝低密度脂蛋白受体mRNA丰度的比较

将30头健康、经产、处于围产期的黑白花乳牛随机分为3组，每组10头。从产前28d开始，低能量组乳牛饲喂《中国奶牛饲养标准（2000）》减少20％日粮（能量摄入80％），对照组乳牛饲喂《标准》日粮（能量摄入100％），高能量组乳牛饲喂《标准》增加20％日粮（能量摄入120％），产后各组乳牛均饲喂标准日粮。至产后第56d结束试验；采用内对照RT-PCR方法检测摄入不同能量的围产期乳牛肝活体组织低密度脂蛋白受体（LDLR）mRNA丰度。结果，不同能量组乳牛肝LDLR mRNA丰度产前至产后均呈现先升高后降低的趋势。100％和120％能量组肝LDLR mRNA丰度在产后14d达最大值，且产后均高于产前（产后56d除外，P〈0．01或P〈0．05）；而80％能量组产后1d即达到最大值，产前14d至产后14d，LDLR mRNA相对表达量显著高于100％和120％能量组；产后28～56d，120％能量组显著高于80％和100％能量组（P〈0．01）。表明围产期乳牛能量摄入水平对肝LDLR mRNA丰度有显著影响。     

不同能量摄入对围产期奶牛脂肪组织胰岛素受体mRNA丰度的影响

将年龄、胎次相同,年产奶量大于5000kg的围产期健康奶牛30头随机分为3组,每组10头。按照中国奶牛饲养标准(2000),低能组饲喂减少20%日粮(能量摄入80%组),对照组饲喂标准日粮(能量摄入100%组),高能组饲喂增加20%日粮(能量摄入120%组),试验从产前14天开始至产后28天结束,产后各组奶牛均饲喂标准日粮。采用半定量RTPCR方法检测了不同能量摄入对围产期奶牛脂肪组织胰岛素受体(InsR)mRNA丰度的影响。结果表明:各组脂肪InsRmRNA相对表达量从产前14天至产后28天均呈现先升高后降低的趋势,产后14天达到最大值,且产后高于产前;低能组产前InsRmRNA相对表达量低于高能组和正常组,产后1天至产后28天高于高能组和正常组,产后14天显著高于高能组(P<0.01)。可见,干乳期低能饲喂奶牛,产后脂肪InsRmRNA表达增加,提示产前适当降低能量摄入水平,有利于胰岛素抑制泌乳初期脂肪动员作用的发挥。     

应用半定量RT-PCR方法测定围产期奶牛肝PEPCK-C mRNA的丰度

建立了奶牛肝PEPCK-CmRNA丰度的半定量RT-PCR检测方法，其优化的PCR反应条件（25pL）为：57C退火、2．4mmol／L Mg^2＋、26～28个循环数、cDNA不小于2．6mg／L、2：1的PEPCK-C／β-actin引物比。同时，应用该方法检测了围产期奶牛肝中PEPCK-CmRNA丰度，结果显示：产前低血糖奶牛肝PEPCK-C mRNA丰度显著低于对照组，但是产后却高于对照组。围产期奶牛血糖水平与肝PEPCK-C mRNA丰度之间的相关系数，对照组为0．68（P=0．14），低血糖组为0．82（P=0．047）。因此，围产期奶牛肝PEPCK-CmRNA丰度对奶牛血糖浓度具有调节作用，低血糖奶牛表现得更为明显。     

干奶期不同能量摄入对围产期奶牛糖异生的影响

将围产期健康奶牛30头随机分为三组,分别于产前第28d开始饲喂标准日粮(能量摄入100%组)、标准日粮增加20%日粮(能量摄入120%组)和标准日粮减少20%日粮(能量摄入80%组),产后各组奶牛均饲喂标准泌乳日粮,至产后第56d结束,观察干奶期不同能量摄入水平对围产期健康奶牛糖异生的影响。结果表明,产前低能饲喂可以增加围产期奶牛血浆葡萄糖(GLU)浓度,肝脏丙酮酸羧化酶(PC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因表达升高。说明干奶期低能饲喂奶牛,可以增强围产期奶牛的肝糖异生能力。     

干奶期不同能量摄入水平对奶牛产后能量负平衡的影响

选择围产期健康奶牛30头,随机分为三组,产前第28d开始,饲喂不同能量日粮,即对照组(C组)、高能量组(H组)和低能量组(L组);产后各组奶牛均饲喂标准泌乳日粮,至产后56d结束。研究干奶期不同能量摄入水平对产后奶牛能量负平衡的影响。结果表明:低能量组奶牛产后干物质摄入量显著高于其它两组、体重消耗较低,能量负平衡状态缓解。     

干奶期奶牛不同能量摄入对其肝脏胰岛素受体mRNA表达的影响

将健康围产期奶牛30头随机分为3组,预产前28 d分别饲喂奶牛标准日粮（能量摄入100%组）、标准日粮增加20%日粮（能量摄入120%组）和标准日粮减少20%日粮（能量摄入80%组）,产后各组奶牛均饲喂标准的产奶日粮,至产后56d结束,采用半定量RT-PCR方法,观测干奶期不同能量摄入水平对围产期健康奶牛肝脏胰岛素受体（IR）基因表达的影响.试验结果表明,干奶期低能饲喂奶牛,产后肝脏IR mRNA表达增加,提示低能饲喂有利于调节奶牛产后血糖平衡.     

不同能量摄入水平对围产期奶牛生产性能及血浆瘦素浓度影响的研究

将健康的围产期奶牛30头随机分为3组, 每组10头。其中Ⅱ组为对照组, Ⅰ组和Ⅲ组分别为试验组。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均于产前28d开始分别饲喂NRC标准减少20%日粮(能量摄入80%组)、NRC标准日粮(能量摄入100%组)、NRC标准增加20%日粮(能量摄入120%组), 产后各组奶牛均饲喂标准日粮, 至产后56d结束。观察妊娠后期奶牛不同能量水平对干物质摄入量、产奶量、乳成分及体重等生产性能和血浆瘦素浓度的影响。试验结果表明: 奶牛产后干物质摄入量、产奶量、乳中蛋白质、乳脂率和非固体物质为Ⅰ组高于Ⅱ组、Ⅱ组又高于Ⅲ组(P>0 05 ); 同时血浆瘦素浓度为Ⅰ组高于Ⅱ组、Ⅱ组又高于Ⅲ组, 经统计分析组间差异极显著(P<0 01) 或差异显著(P<0 05); 但产前28~14d瘦素浓度组间差异均不显著(P>0 05 ), 此后Ⅰ组和Ⅲ组差异显著(P<0 05 )。此外, Ⅰ组体重消耗最小, Ⅲ组体重消耗最大, 各组间差异极显著(P<0 01)。可见, 围产期健康奶牛不同能量水平与干物质摄入量、产奶量、乳成分、体重等生产性能及血浆瘦素浓度之间存在着密切的关系。     

不同能量摄入水平对围产期奶牛脂肪组织Leptin mRNA和HSL mRNA表达的影响

选用围产期健康奶牛30头随机均分为3组,其中组为对照组,组和组为试验组。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组于产前28d开始分别饲喂中国奶牛饲养标准(2000)标准日粮(能量摄入100%组)、标准日粮增加20%日粮(能量摄入120%组)和标准日粮减少20%日粮(能量摄入80%组),产后各组奶牛均饲喂同一标准日粮至56 d。试验各组奶牛分别于产前28、14 d、产后1、14、28、56 d尾根部手术采取脂肪样品,采用荧光RT-PCR法对脂肪组织Leptin mRNA及HSL mRNA表达水平进行定量分析。结果表明,不同能量摄入水平显著影响脂肪组织Leptin mRNA和HSL mR-NA表达。低能饲喂明显提高了脂肪组织中Leptin mRNA表达,降低了HSL mRNA表达;高能饲喂明显降低了脂肪组织中Leptin mRNA表达,提高了HSL mRNA表达。     

健康奶牛围产期脂肪组织ADPN mRNA和HSLmRNA丰度

为探讨脂联素(ADPN)与激素敏感脂肪酶(HSL)对围产期奶牛脂肪动员的影响及其相互关系,随机选取围产期健康奶牛10头,分别于产前28天、产前14天、产后1天、产后14天和产后28天,应用荧光定量RT-PCR法检测其脂肪组织ADPN mRNA和HSL mRNA丰度。结果表明:在围产期,随着分娩日龄的临近,其脂肪组织的HSL mRNA水平随着ADPN mRNA丰度的降低而下降,产后则随其升高而上升,初步推测脂联素可能是通过调控脂肪HSL mRNA的表达和分泌来调节围产期奶牛脂肪的。     

乳牛肝MTP基因mRNA定量检测模板的构建

应用RTPCR方法。克隆394bp的MTP片段，连接到pMD18-T载体上构建pMD-MTP394重组质粒；应用限制性内切酶ApaI消化重组质粒pMD-MTP394，切下-194bp的小片段。回收大的线性片段。T4DNA连接酶连接，成功构建了-个重组的竞争模板质粒pMD-MTP200。为建立竞争性RTPCR法检测乳牛肝MTP基因mRNA奠定了基础。     

干奶期不同能量摄入对围产期乳牛血液葡萄糖胰高血糖素和胰岛素浓度的影响

将围产期健康乳牛30头随机分为3组，分别于产前第28d开始饲喂标准日粮（能量摄入i00％组）、标准日粮增加20％的日粮（能量摄入120％组）和标准日粮减少20％的日粮（能量摄入80％组），产后备组乳牛均饲喂标准泌乳日粮，至产后第56d结束，观察干奶期不同能量摄入水平对围产期健康乳牛血液葡萄糖、胰高血糖素和胰岛素浓度的影响。结果表明，产前低能饲喂可以增加围产期乳牛血浆葡萄糖浓度，干奶期不同能量摄入水平对围产期健康乳牛血液葡萄糖、胰高血糖素和胰岛素浓度起重要调节作用。     

填饲后朗德鹅肝脏和小肠组织中MTP基因表达研究

为了探讨填饲对MTP基因表达的影响,本研究采用RT-PCR法检测了填饲后MTP基因在朗德鹅肝脏和小肠组织中的表达情况,并对6种体组成参数和甘油三酯等4种血清生化指标进行了检测.结果表明:填饲后,各体组成参数和血清生化指标的水平都显著升高;MTP基因在朗德鹅的肝脏和小肠组织中都有表达;填饲后肝脏组织中MTP基因的表达无显著性变化(P>0.05),而小肠组织中的MTP基因的表达水平却显著升高(P<0.05).结论:填饲引起MTP基因在小肠和肝脏中的变化差异可能与肝细胞中可利用脂类物质的水平、其它调控因子及填饲的高脂食物有关.     

神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞MTP mRNA表达的影响

为了阐明神经内分泌因子在奶牛肝脂蛋白组装与转运过程中的调控作用,通过向体外培养的新生犊牛肝细胞添加胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白,采用内对照RT-PCR方法检测神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)mRNA丰度的影响。结果显示,随着细胞培养液中胰岛素和胰高血糖素浓度升高,MTP mRNA的丰度呈现剂量依赖性下降(P<0.01);随着瘦蛋白浓度的增加,MTP mRNA的丰度先升高后降低(P<0.01或P<0.05)。这表明胰岛素和胰高血糖素对肝细胞MTP mRNA表达具有抑制作用,呈现剂量依赖性;瘦蛋白对肝细胞MTP mRNA表达具有低剂量促进而高剂量抑制的双重作用,且均呈现剂量依赖性。     

酮病、脂肪肝奶牛胰岛素受体mRNA丰度

选择自然发生的酮病奶牛、脂肪肝奶牛和正常围产期荷斯坦奶牛（对照）各5头，通过手术方法采取其肝脏样品，采用半定量RT—PCR方法检测了这3组奶牛肝胜样品胰岛素受体（InsR）mRNA丰度的变化。结果表明，酮痛奶牛InsRmRNA相对表达量低于正常对照奶牛，而高于脂肪肝奶牛；脂肪肝奶牛InsR mRNA相对表达量低于正常对照奶牛和酮病奶牛（P〈0．05）。可见，酮病奶牛InsR mRNA相对表达量下降，提示此有利于酮病奶牛糖异生和脂肪动员，从而缓解能量负平衡；脂肪肝奶牛InsR mRNA相对表达量降低，提示奶牛胰岛素应答显著减弱，此时奶牛可能发生了胰岛素抵抗。     

瘦蛋白(Leptin)对体外培养新生牛脂肪细胞Leptin、HSL基因表达的影响

取单层生长良好的脂肪细胞,采用单因素重复试验,分别添加0、2.5、5、10、50、100μg/L的外源牛重组瘦蛋白(Leptin),培养12h后提取总RNA,每个处理3个重复(孔),应用半定量PCR方法检测外源Leptin对脂肪细胞Leptin mRNA和HSL mRNA水平的影响.结果表明,Leptin对脂肪细胞内Leptin mRNA表达具有抑制作用,但一定浓度的Leptin能提高脂肪细胞内HSL mRNA水平,其中以5μg/L Leptin的作用最为明显;当Leptin的质量浓度超过5μg/L,HSL mRNA表达水平呈下降趋势.