实时定量PCR评价小鼠胸腺功能方法的建立

目的建立实时定量PCR检测小鼠胸腺及脾脏T淋巴细胞中信号结合T细胞受体删除环（sjTRECs）水平的方法。推测其中的初始T细胞的数目,评价胸腺功能,从而为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。方法提取小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞基因组DNA,PCR扩增目的片段。纯化构建标准质粒的RAG2片段,构建标准重组质粒并鉴定。优化PCR体系后,实时定量PCR反应建立标准曲线,并检测不同品系（BALB／c和C57BL／6）成年小鼠胸腺及脾脏淋巴细胞sjTRECs含量。结果成功构建标准质粒。确定最适实时定量PCR反应条件后,在实时定量PCR中建立可信度高的标准曲线。建立的方法分析表明,这两个不同品系的sjTRECs含量统计学差异不显著。结论成功建立定量检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量从而推测其中的初始T细胞数目的方法。为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。     

实时定量PCR检测小鼠成熟过程中T淋巴细胞sjTRECs水平

目的:实时定量PCR检测正常小鼠成熟过程中胸腺及脾脏T淋巴细胞的信号结合T细胞受体重排删除DNA环(sjTRECs)含量,从而推测T淋巴细胞中的初始T细胞的数目,评价小鼠成熟过程中的胸腺功能.为胸腺发育和功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法.方法:实时定量PCR(SYBR Green法)检测T淋巴细胞中sjTRECs含量.结果:1～6 wk的小鼠胸腺中的初始T细胞含量持续增加,9wk时已经开始下降,12 wk时持续下降.而小鼠的外周中初始T细胞的含量则随着周龄增加而增加(1～12wk).结论:在小鼠的成熟过程中,从9wk开始胸腺的生成功能减弱,而胸腺的输出功能持续增加;成功建立和应用实时定量PCR检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量,是准确评价小鼠胸腺功能的方法.     

应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法.方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25% Chelex-100,0.5%NP40,TE配制,pH=9.0);56℃孵育30 min;100℃水浴10 min;离心后所得上清即为DNA.电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度.结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1.79±0.03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度.结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR.     

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

外周血干细胞移植后并发巨细胞病毒感染的荧光定量PCR检测与防治

目的评价荧光定量PCR技术对外周血干细胞移植(PBSCT)后并发巨细胞病毒(CMV)感染的临床意义.方法用荧光定量PCR技术对5例行异基因PBSCT(Allo-BSCT)、1例行自体PBSCT患者的血液,在移植前后进行CMV DNA动态检测.CMV感染的预防,移植早期采用阿昔洛韦,外周血中性粒细胞数达1.0×109/L用国产更昔洛韦5mg/kg/天.血CMV DNA阳性患者用进口更昔洛韦10mg/kg/天加膦甲酸钠80mg/kg/天治疗.结果 5例PBSCT患者血CMVDNA阴性,临床上未发生CMV引起的疾病;1例Allo-PBSCT患者在移植前后血CMV DNA呈阳性,+60天发生间质性肺炎,用进口更昔洛韦、膦甲酸钠和免疫球蛋白治疗,低氧血症一度好转,后合并细菌和真菌败血症而死亡.结论荧光定量PCR对CMV DNA的检测特异性强、快速、灵敏.PBSCT患者CMV DNA阳性者应按CMV活动性感染及时治疗.     

实时荧光定量PCR检测尿液CK20方法的建立

目的:建立一种简便、快速、灵敏度和特异性较好的定量检测尿液CK20方法,用于膀胱移行细胞癌(Transitional cell ear-cinoma of the bladder,TCCB)早期诊断、预后及复发的评估.方法:培养膀胱癌T24细胞,针对CK20基因保守序列设计合成两对引物和Taqman探针,将PCR扩增产物片段克隆,作为定量检测的标准品,优化反应条件,建立快速检测CK20mRNA的实时荧光定量PCR方法,并进行方法学评价.结果:荧光定量PCR检测尿液CK20方法能较好的定量枪出尿液CK20mRNA,检测范围为102～102copies/μ1,灵敏度为102 copies/μ1,特异性好,批内、天间重复性(Coefficient of variation,CV)分别为0.89%和2.45%.结论:成功建立了快速检测尿液CK20的荧光定量PCR方法,为进一步开发出用于TCCB早期诊断、预后及复发评估的定量检测试剂盒奠定了基础.     

实时荧光定量PCR在肝炎检测中的应用

目的:探讨实时荧光定量PCR在肝炎尤其是乙型肝炎(乙肝)检测中的应用。方法:对450例急、慢性乙肝患者,采用经酶联免疫吸附试验检测血清,并按血清学标志分为三组,并对所用患者血清实时荧光定量PCR检测。结果:不同血清学标志模式的实时荧光定量PCR检测阳性率分别为95.95%、31.47%、52.20%,三组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:实时荧光栋梁PCR检测可以为乙肝病毒感染诊断、治疗及预后判断提供客观依据。但对于病毒非复制感染不能有效检测,不可在肝炎检测中完全替代血清标志物检测。     

实时荧光定量PCR检测精子线粒体DNA的提取效率

目的：测定宝生物工程有限（大连）公司和上海杰美基因医药科技有限公司两种试剂盒精子线粒体DNA提取的效率,以及核基因组DNA的残留。方法：CASA法计数精子数量,试剂盒提取线粒体DNA,TaqMan法荧光实时定量PCR,利用标准曲线测定线粒体基因Cox-I片段、核基因β-actin片段的拷贝数,计算出精子线粒体DNA的提取效率和核基因组DNA的残留。结果：两种试剂盒精子线粒体DNA提取效率分别是：0.44%±0.03%和6.19%±0.17%。核基因组DNA的残留率分别为4.71%±0.76%和38.1%±1.97%。结论：后者线粒体DNA提取效率高一个数量级,但核基因组DNA的残留率也高一个数量级。     

荧光定量PCR检测土拨鼠肝炎病毒核酸方法的建立

目的建立土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)核酸的荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法,应用于土拨鼠肝炎病毒模型的研究。方法分别根据土拨鼠肝炎病毒核心抗原(WHcAg)和表面抗原(WHsAg)的DNA序列设计13对扩增引物,从中筛选无非特异性扩增及引物二聚体且灵敏度高的引物,用于土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测。建立感染土拨鼠肝炎病毒的土拨鼠血清中WHV核酸的Real-timePCR检测方法。结果根据WHsAg基因的5’端设计的一对引物WHVSF1与WHVSR1,检测灵敏度可达1×101拷贝/μL,病毒拷贝数与Real-time PCR Ct值的标准曲线的R2值为0.997,且电泳未见明显非特异性条带及引物二聚体。结论建立了土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测方法,该方法为进一步研究土拨鼠肝炎病毒模型奠定了基础。     

两种HBV-DNA荧光定量PCR检测比较

目的优化HBV—DNA特异性定量检测方法。方法采用荧光定量PCR检测法，用10份正常血清、10份HBV高滴度（10^6 IU／mL）血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品，验证两种检测方法的重复性、特异性和灵敏度；并将结果进行配对检验。结果10份正常血清标本均无假阳性HBV—DNA检测结果，特异性极好；10份HBV高滴度血清中检出1份YMDD变异，灵敏度均可达到10^3 IU／mL，重复性和灵敏度两者之间无显著性差异（t=0．702，P〉0．05）。结论该方法特异性和灵敏度高，可用于HBV的临床检测和科学研究。     

异基因造血干细胞移植合并胸腺移植及CD4--DLI后T细胞重建情况

目的 评价异基因造血干细胞(allo-HSCT)联合胸腺移植(TT)时给予去除CD4+T细胞供体淋巴细胞输注(CD4--DLI)对T细胞重建及向外周T细胞储存库输出能力的影响.方法 分为两组,对照组allo-HSCT时联合TT,处理组allo-HSCT时联合TT及CD4--DLI,移植5个月后提取小鼠脾脏T细胞的基因组DNA,以实时定量PCR检测小鼠脾脏T细胞中信号结合T细胞受体重排删除环(sjTRECs)水平,PCR扩增目的基因与RAG2片段,建立PCR标准曲线并比较对照组和处理组脾脏T细胞sjTRECs含量.结果 对照组和处理组的脾脏T细胞sjTRECs水平差异有统计学意义,处理组显著高于对照组(P＜0.01).结论 allo-HSCT+TT时给予CD4--DLI能够显著加快移植后T细胞重建及向外周T细胞储存库输出能力的恢复.     

实时荧光定量PCR检测肾移植患者术后BK病毒感染

目的:建立肾移植术后患者尿液和外周血BK病毒(BKV)感染负荷的实时荧光定量PCR检测方法,并初步探讨其临床应用价值.方法:构建含有BKV VP1蛋白保守区核苷酸序列片段的质粒作为外参照品,采用TaqMan荧光探针检测技术,建立定量检测BKV DNA方法;并对112例肾移植术后患者,40例正常体检者的尿液和外周血标本BKV含量进行检测.结果:本研究建立的BKV实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异度及重复性较好,定量PCR方法最低检测下限为8×102copy/ml,测量批内差异为0.54%～3.78%,批间差异为0.62%～4.58%.112例肾移植术后患者尿液和外周血BKV DNA的检测阳性率分别为27.7%和11.6%,BKV DNA阳性者尿液和外周血BKV中位数水平分别为8.2×104copy/ml和2.4×103copy/ml.40例正常人BKV尿液和外周血阳性率为2.5%和0%;与正常体检者相比,肾移植术后患者尿液及外周血BKVDNA阳性率及水平明显升高(P＜0.01).尿液BKV阳性率较外周血明显升高(P=0.02),但尿液和外周血中BKV含量无明显相关性.结论:实时荧光定量PCR检测肾移植患者术后BKV感染方法简便、可靠、准确,为进一步研究BKV感染与肾移植术后移植物丢失的关系奠定了基础.     

Real-time fluorescent quantitative PCR assay for measuring cytomegalovirus DNA load in patients after haematopoietic stem cell transplantation

Cytomegalovirus （CMV） infection is a major and often deadly complication of haematopoietic stem cell （HSC） transplantation. Successful preemptive CMV therapy in transplant patients depends on the availability of sensitive, specific, and timely diagnostic tests for CMV infections. The pp65 antigenemia assay has been used for this purpose with considerable success but has disadvantages of being time-consuming and labor-intensive .     

定量PCR检测CMV在异基因造血干细胞移植中的临床意义

目的通过监测造血干细胞移植后患者的外周血CMV DNA含量,探讨对患者进行抗病毒治疗的有效性。方法采用实时定量PCR方法对接受异基因造血干细胞移植（Allogeneic HCT）患者进行外周血CMV DNA定期检测。可评价患者57例,其中男38例,女19例,年龄13-59岁（中位年龄31岁）;含急性白血病30例（ALL 11例、AML 19例）,慢粒（CML）11例,淋巴瘤（NHL）8例,骨髓增生异常综合征（MDS）5例,急性重症再障（SAA）3例。在移植后每周检测1次,CMV DNA拷贝数〉102为阳性,连续2次〉103或1次〉1×10^4时行抗病毒治疗。结果57例患者中有32例（56.1%）在病程中检测到CMV DNA阳性,拷贝数1.2×10^2-7.8×10^5,行抗病毒治疗26例,死亡11例,仅1例与CMV感染有关。结论CMV DNA的定期检测可以使患者在病毒血症时及时接受治疗,减少CMV疾病的发生,有利于改善患者的生存。     

小鼠胸腺输出功能及免疫重建的研究方法

目的建立实时定量PCR检测小鼠T淋巴细胞中信号结合T细胞受体删除环（sjTREC）水平和T细胞受体β链可变区（TRBV）CDR3的方法,推测其中的初始T细胞的数目和克隆性,评价胸腺输出功能及免疫重建,从而为胸腺输出功能及移植后T细胞免疫提供可靠的研究方法。方法分别提取小鼠脾脏细胞基因组DNA和总RNA。PCR方法扩增DNA标本目的片段。纯化鉴定并构建含sjTREC片段的质粒标准品。建立稳定的实时定量PCR反应检测小鼠脾脏淋巴细胞sjTREC含量的方法。采用半巢式PCR扩增TRBV基因产物,采用ABI3700分析TRBV谱型。结果构建了可靠的sjTREC和TCRα质粒标准品。在实时定量PCR中建立了可靠的标准曲线。建立的定量PCR方法分析可成功用于脾细胞的sjTREC含量的检测。8周龄BALB/c小鼠脾细胞sjTREC含量为（626±115）拷贝/10^5个脾细胞。结论建立了可靠的定量检测小鼠T淋巴细胞中sjTREC含量的方法,建立了分析T细胞谱型的方法,为研究生理和病理条件下胸腺输出功能及T细胞免疫重建改变提供了可靠的方法。     

外周血干细胞移植后迟发性出血性膀胱炎的护理

目的探讨异基因外周血干细胞移植(allo-PBSCT)后出血性膀胱炎(HC)的护理对策。方法对2004年1月—2011年1月在新疆医科大学第一附属医院血液科收治的外周血干细胞移植177例患者中发生HC的28例患者(Ⅰ度13例,Ⅱ度11例,Ⅲ度3例,Ⅳ度1例,所有HC均为迟发性)的护理措施及效果进行总结和分析。结果肉眼血尿及尿频、尿急、尿痛、膀胱刺激症状均消失,尿常规恢复正常,无相关护理并发症发生。结论护士掌握出血性膀胱炎的监测和病情观察要点,配合采取积极有效的护理措施,可提高出血性膀胱炎治愈率,减轻病人的痛苦。     

荧光定量PCR检测膀胱癌患者尿沉淀细胞TWIST1基因启动子甲基化状态的临床价值

目的:评估尿沉淀细胞TWIST1基因启动子甲基化状态在膀胱癌诊断中的价值?方法:用实时荧光定量PCR的方法,对50例临床确诊的膀胱癌患者?13例非肿瘤性尿路疾病患者?7例健康志愿者检测了尿沉淀细胞TWIST1基因启动子的甲基化状态;同时行尿脱落细胞学检查?结果:50例膀胱癌患者中尿脱落细胞TWIST1基因启动子甲基化阳性率为64.0%(32/50),对照组均未发现甲基化改变,两者比较差异有统计学意义(P < 0.01)?TWIST1基因启动子甲基化率有随组织分期升高的趋势,但在不同分级?分期膀胱癌中的差异无显著性?实时荧光定量PCR法检测尿液中TWIST1基因启动子甲基化的敏感性和特异性分别为64.0%?100.0%?而尿脱落细胞学检查阳性率为48.0%(24/50),其敏感性和特异性分别为48.0%和100.0%?结论:尿脱落细胞TWIST1基因启动子的甲基化检测诊断膀胱癌敏感性和特异性均较高,且无创?无痛苦,可作为早期诊断膀胱癌的敏感指标?     

小鼠单倍体相合外周血移植模型的建立

目的建立单倍体相合外周血移植小鼠模型,探讨移植后造血及免疫重建特性。方法经大剂量全身照射预处理BDF1小鼠后,经尾静脉输注新生第一天DBA/2小鼠的外周全血,移植后动态观察受体鼠的造血重建及急性移植物抗宿主病(GVHD)发生情况,并用流式双染色法进一步检测粒系、淋巴系造血细胞的长期植入水平。结果移植后小鼠的白细胞、血小板、血红蛋白分别在第18、21、18天明显回升,其中白细胞和血小板分别于第29天和36天恢复正常,而血红蛋白至第50天仍为部分恢复。受体鼠90%长期存活,且不发生明显的GVHD。移植后第50天流式细胞仪检测供鼠来源的造血细胞占总有核细胞的88.81%,其中含供者来源的粒细胞33.92%,T细胞16.83%。结论单份新生小鼠外周血含有足够的造血干细胞,能重建单倍体相合小鼠的造血及免疫系统而不引起明显的GVHD,并可形成稳定的以供者细胞为主的嵌合体,其中粒细胞为完全嵌合。