重组转化生长因子β3基因对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察转化生长因子D3基因（TGFβ3）对大鼠肝星状细胞株（HSC—T6）Ⅰ型胶原合成的影响。方法TGFβ3表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFβ31和TGFβ1表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFD11的构建。通过脂质体介导方法，将pcDNA3．1（＋）-TGFβ1、pcDNA3．1（＋）-TGFβ3分别及共同转染体外培养的HSC—T6细胞，荧光定量PCR法及Westernblot法分别检测转染后TGFβ1、TGFD3、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达。将pcDNA3．1（＋）-TGFD1转染HSC—T6细胞，经G418筛选建立高表达TGFD1的HSC～T6细胞克隆，pcDNA3．1（＋）-TGFD3转染克隆细胞，荧光定量PCR法检测转染后TGFβ3、TGFβ1及Ⅰ型胶原mRNA的表达，Westernblot法检测TGFβ1、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。结果构建的pcDNA3．1（＋）TGFD3、pcDNA3．1（＋）-TGFD1质粒可转染HSC—T6细胞，转染率28．2％。pcDNA3．1（＋）TGF侈3转染细胞后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达较空白组及对照组增加，以72h增高最为明显（P〈0．05）；共转染组Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达较pcDNA3．1（＋）-TGFβ1转染组明显降低（P〈0．05）。TGF侈3转染克隆细胞后，TGFD1mRNA表达较克隆组无明显改变（P〉0．05），而蛋白质表达明显下降（P〈0．05），Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质表达均较克隆组明显降低（P〈0．05）。结论TGFD3基因转染正常培养的HSC—T6细胞，增加Ⅰ型胶原的表达；转染高表达TGFβ1的克隆组HSC—T6细胞，Ⅰ型胶原表达明显降低，提示TGFβ3对肝纤维化的发生有抑制作用。     

转化生长因子β1对不同活化状态肝星状细胞增殖与Ⅰ型胶原表达的影响

目的 观察不同活化状态肝星状细胞(HSC)对外源性转化生长因子-β_1(TGF-β_1)旁分泌刺激的生物学效应作用。方法 原代分离培养大鼠HSC,无包被塑料培养皿上分别培养1、4、7d,细胞处于静止、中间活化与完全活化状态,继以10～500 pmol/L TGF-β_1温育细胞24h,~3H—TdR掺入法测定细胞增殖,western blot法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)与Ⅰ型胶原蛋白表达沉积,~3H-脯氨酸掺入与胶原酶消化法测定细胞总胶原的分泌量。100pmol/L TGF-β_1温育细胞15～90min,northern blot法检测细胞Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平。结果 TGF-β_1浓度依赖性抑制培养1d HSC的细胞增殖,10～500 pmol/L TGF-β_1浓度组细胞内~3H—TdR掺入率分别为对照组的52.8％～16.8％,与对照组比较,q值为5.44～10.37,P<0.01。但TGF-β_1对培养4d与7d的细胞增殖无影响。随细胞活化,HSC基础性α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白与mRNA水平明显增加,而TGF-β_1刺激各培养时间HSC以上蛋白与基因的表达。培养1、4、7d HSC基础水平与TGF-β_1刺激的总胶原分泌量分别为(804±274)dpm/孔与(1 200±708)dpm/孔;(2 966±1 701)dpm/孔与(6 160±1 123)dpm/孔;(2 580±767)dpm/孔与(4 583±1 467)dpm/孔,后2组组内比较,t值分别为3.84与2.96,P<0.01或P<0.05。以培养4d HSC     

大鼠肝星状细胞转化生长因子β3/β1 mRNA比值与Ⅰ型胶原合成的关系

转化生长因子β1(TGF β 1)是激活肝星状细胞(HSC)并促进其胶原合成的最重要因子.TGF β 3被认为具有抗组织纤维化的功能.Carrington等[1]研究提示:TGF β 1与TGF β 3的比值是纤维化发生程度的关键因素.本实验研究大鼠HSC中TGF β 3/TGF β 1 mRNA比值的变化及与Ⅰ型胶原合成的关系,阐明TGF β 3是拮抗TGF β 1的重要因子,为TGF β 3对肝纤维化的防治作用提供实验依据.     

反义转化生长因子βⅠ型受体表达质粒对大鼠肝星状细胞功能的影响

目的　观察反义转化生长因子 (TGF) βⅠ型受体 (TβRⅠ )表达质粒对大鼠肝星状细胞 (HSC)增殖及细胞外基质分泌的影响。方法　双酶灌注和梯度离心法分离大鼠HSC ,将构建的反义TβRⅠ真核细胞表达质粒与 pcDNA3空质粒经脂质体转染培养活化的HSC ,通过RT PCR、Western印迹检测外源导入质粒在HSC中的表达 ,采用MTT法、3 H TdR掺入法检测细胞增殖情况 ,ELISA法检测TGF β1含量变化 ,并应用Western印迹检测HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达。结果　反义TβRⅠ真核细胞表达质粒可抑制活化HSC中TβRⅠmRNA及蛋白表达。与 pcDNA3转染组相比 ,反义TβRⅠ质粒表达可抑制HSC增殖 (P <0 .0 1) ,降低TGF β1含量 (P <0 .0 5 ) ,抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌 (P <0 .0 5 )。结论　重组反义TβRⅠ表达质粒可在HSC中获得较好表达 ,并可显著抑制HSC增殖及细胞外基质分泌。     

虫草菌丝和丹参对肝星状细胞活化、Ⅰ型胶原及转化生长因子β1mRNA与蛋白表达的影响

目的探讨虫草菌丝、丹参抗肝纤维化的作用机理。方法虫草菌丝与丹参流浸膏分别给大鼠经口灌胃给药后分离药物血清,观察药物血清对体外传代活化的大鼠肝星状细胞α－平滑肌肌动蛋白（SMactin,SMA）表达、[3H]TdR及[3H]脯氨酸掺入,TGFβ1、I型前胶原mRNA表达及其蛋白生成量的影响。结果丹参抑制HSC的SMA表达、I型胶原生成量及细胞内[3H]脯氨酸掺入的作用显著,分别为对照组的39.8％,42．7％与38．9％（P＜0．01;前2项显著低于虫草菌丝组,P＜0．05）,尚可抑制细胞1型前胶原＜mRNA,TGFβ1＜mRNA及其蛋白的表达（P＜0．01）;虫草菌丝对上述指标也均有抑制作用,以抑制TGFβ1＜mRNA及其蛋白表达的作用尤著,分别为对照组的47．7％和21．1%(P＜0．01）;显著低于丹参组,P＜0．05。结论丹参具有较强的抑制HSC活化与胶原合成的作用,抑制胶原合成主要作用于前胶原转录后的水平;虫草菌丝的主要作用点抑制HSC的TGFβ1mRNA表达与自分泌。     

肝素对大鼠肝星状细胞中转化生长因子β1和Ⅰ型胶原的影响

目的: 研究肝素与大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)作用后转化生长因子beta1(transforming growth factor beta1, TGF-beta1)和Ⅰ型胶原表达的变化及意义. 方法: 大鼠肝星状细胞以1×108/L浓度接种于96孔培养板, 每孔100 muL. 实验分组为肝素Ⅰ组、肝素Ⅱ组、肝素Ⅲ组, 加入肝素使各组培养液中肝素浓度分别是10, 100, 1000 mg/L, 加生理盐水为对照组(每组6孔重复3次)培养48 h. 培养终止后吸取上清液-20℃冰冻保存, ELISA法检测其上清液TGF-beta1和Ⅰ型胶原水平, MTT法观察细胞增殖情况. 结果: 肝素Ⅱ组和Ⅲ组HSC培养上清液TGF-beta1水平均显著低于对照组(4.59±1.27 ng/L, 3.34±1.13 ng/L vs 5.95±1.72 ng/L, P均<0.01), 肝素各组Ⅰ型胶原水平均低于对照组(87.20±9.30 ng/L, 73.17±12.04 ng/L vs 95.61±12.55 ng/L, 63.31±10.93 ng/L vs 95.61±12.55 ng/L, P均<0.05), 肝素Ⅲ组平均吸光度低于肝素Ⅰ组和对照组(0.29±0.07 vs 0.42±0.12, 0.46±0.17, P均<0.05). 结论: 大鼠肝星状细胞在肝素作用下TGF-beta1和Ⅰ型胶原分泌受抑制, 其增殖减少.     

肝素对大鼠肝星状细胞中转化生长因子β1和Ⅰ型胶原的影响

目的:研究肝素与大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)作用后转化生长因子β1 (transforming growth factorβ1,TGF-β1)和Ⅰ型胶原表达的变化及意义.方法:大鼠肝星状细胞以1×10~8/L浓度接种于96孔培养板,每孔100μL.实验分组为肝素Ⅰ组、肝素Ⅱ组、肝素Ⅲ组,加入肝素使各组培养液中肝素浓度分别是10,100,1000 mg/L,加生理盐水为对照组(每组6孔重复3次)培养48 h.培养终止后吸取上清液-20℃冰冻保存,ELISA法检测其上清液TGF-β1和Ⅰ型胶原水平,MTT法观察细胞增殖情况.结果:肝素Ⅱ组和Ⅲ组HSC培养上清液TGF-β1水平均显著低于对照组(4.59±1.27 ng/L,3.34±1.13 ng/L vs 5.95±1.72 ng/L,P均<0.01),肝素各组Ⅰ型胶原水平均低于对照组(87.20±9.30 ng/L,73.17±12.04 ng/L vs 95.61±12.55 ng/L,63.31±10.93 ng/L vs 95.61±12.55 ng/L,P均<0.05),肝素Ⅲ组平均吸光度低于肝素Ⅰ组和对照组(0.29±0.07 vs 0.42±0.12,0.46±0.17,P均<0.05).结论:大鼠肝星状细胞在肝素作用下TGF-β1和Ⅰ型胶原分泌受抑制,其增殖减少.     

维生素E对肝脏星状细胞Ⅰ型胶原、TGFβ1和TIMP2表达的影响

目的　探讨维生素E对肝脏星状细胞 (HSC)Ⅰ型胶原、转化生长因子 β1(TGFβ1)和基质金属蛋白酶组织抑制剂 2 (TIMP2 )表达的影响。方法　体外培养的HSC ,经 1mg/L维生素E作用后 ,用免疫组织化学法检测Ⅰ型胶原表达 ;原位杂交技术检测TGFβ1和TIMP2 mRNA表达。结果　实验组中维生素E能使HSCⅠ型胶原表达明显少于对照组 (P <0 .0 1) ,但对TGFβ1及TIMP2 mRNA表达无影响。结论　维生素E抗肝纤维化作用可以通过抑制Ⅰ型胶原表达实现。     

柔肝冲剂对大鼠肝星状细胞表达转化生长因子β1和胶原的影响

[目的]观察柔肝冲剂对大鼠肝星状细胞(HSC)表达转化生长因子β1(TGF-β1)和胶原的影响.[方法]采用血清药理学方法处理HSC,以貂肺上皮细胞(Mv1Lu)生长抑制MTT法检测培养上清液中TGF-β1活性,免疫细胞化学染色检测HSC TGF-β1和胶原的表达.[结果]经柔肝冲剂处理的HSC培养上清液中TGF-β1的生物活性和细胞内TGF-β1的表达受到显著抑制,其中对纤维肝HSC的作用更明显,抑制作用优于秋水仙碱.柔肝冲剂能显著抑制纤维肝HSC表达胶原,对Ⅳ型和Ⅰ型胶原具有较高的抑制率.[结论]柔肝冲剂能抑制HSC产生TGF-β1和胶原,阻断肝纤维化时HSC合成胶原等细胞外基质的自分泌放大过程.     

肝星状细胞中的TGFβ信号转导通路

肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化是肝纤维化形成的中心环节,转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)启动了肝星状细胞的活化,TGFβ信号在HSC内主要通过ALK5/smad2/3途径在HSC内传递,而近年来的研究表明,ALK1/smad 1/5途径及非smad信号也起非常重要的作用.有必要对HSC中复杂的TGFβ信号进行研究,为有效抗TGFβ治疗肝纤维化提供依据.     

丹酚酸B对转化生长因子β1促肝星状细胞分泌胶原的影响

目的 观察丹酚酸B(SA—B)对肝星状细胞(HSC)分泌转化生长因子β1(TGFβ1)与TGFβ1促HSC分泌胶原的影响。方法 用ELISA法测定培养4d的原代与传代HSC的TGFβ1分泌量；添加TGFβ1于原代HSC中温育24h后，[^3H]脯氨酸掺人与胶原酶消化法观察TGFβ1促进HSC分泌胶原的作用；Western印迹法检测：HSCⅠ型胶原的表达；添加SA—B，观察对上述实验的干预。结果 传代HSC分泌TGFβ1的量明显高于原代HSC；添加SA—B后，对原代HSC的TGFβ1分泌量无明显影响，而传代HSC的TGFβ1分泌量显著减少。TGFβ1可显著促进HSC胶原的分泌和I型胶原的表达，而SA—B可拮抗TGFβ1的效应。结论 SA—B可抑制传代HSC的TGFβ1分泌与减弱TGFβ1促HSC胶原的合成，这两个环节可能是SA—B抗肝纤维化的主要作用机制。     

姜黄素激活PPARγ下调肝星状细胞α-SMA和Ⅰ型胶原的基因表达

[目的]研究姜黄素抑制大鼠肝星状细胞（HSC）活化作用与过氧化物酶体增殖因子活化受体γ（PPARγ）信号转导途径之间的关系。[方法]肝脏原位灌流酶消化、Nycodenz密度梯度离心方法分离培养大鼠HSC，并使用姜黄素对细胞进行相应处理，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色分析法检测姜黄素对细胞增殖的影响。收集裂解细胞并抽提细胞总RNA，采用半定量RT-PCR检测姜黄素处理对α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原的基因表达水平的影响。[结果]姜黄素在10-50μmol／L范围内呈剂量依赖性抑制体外培养大鼠传代HSC的增殖，且能在基因水平显著降低α-SMA（P〈0．05）和Ⅰ型胶原的基因表达水平（P〈0．01）。这些作用均可以被PPARγ特异性阻断剂GW9662阻断。[结论]姜黄素抑制HSC增殖、活化和合成Ⅰ型胶原的作用依赖于PPARγ信号转导途径的激活。     

转化生长因子β1对大鼠肝星状细胞表达β-连环蛋白的影响

目的研究转化生长因子β1（TGF—β1）对大鼠肝星状细胞（HSC）表达β-连环蛋白（β-catenin）的影响。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）比较经不同浓度的TGF-β1刺激不同时间后HSC表达β-catenin、smad3和α-SMA mRNA的变化,并比较三者之间的关系。结果1ng／ml TGF—β1刺激2h后,HSC表达β—catenin mRNA、smad3 mRNA和α—SMA mRNA量最大,β—catenin mRNA表达与两者均具有明显的相关关系（r=0．947,P〈0．01;r=0．950,P〈0．01）。结论β—catenin在TGF—β1活化HSC的过程中发挥重要作用。     

抗纤二号药物血清对活化型肝星状细胞的影响

为了解抗纤二号的抗肝纤维化作用机制，采用动物体内给药，分离药物血清，作用于体外培养细胞的血清药理学实验方法，探讨该方对肝星状细胞（HSC）激活的标志平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin，SMA）表达的影响及Ⅰ、Ⅲ型胶原和转化生长因子β1（TGFβ1）及其下游信号Smad 3表达的影响，从细胞分子学水平探讨该方抗肝纤维化的作用机制。     

Smad7抑制TGF-β1对肝星状细胞α1(Ⅲ)前胶原基因表达的促进作用

目的:探讨在加入TGF-β1的条件下,Smad7过度表达对肝星形细胞-T6(HSC-T6)α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平的作用.方法:体外培养HSC-T6细胞,分为正常对照组、TGF-β1对照组、空载质粒组、Smad7质粒组、TGF-β1+空载质粒组和TGF-β1+Smad7质粒组.通过Fugene6介导Smad7质粒转染,继续培养48 h.采用Real time-PCR、RT-PCR方法检测Smad7和α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平.结果:TGF-β1+Smad7质粒组、Smad7质粒组Smad7 mRNA水平较正常对照组、空载质粒组显著增高(t=59.43、59.41、54.27及54.25,均t>t0.01,均P<0.01).Smad7质粒组α1(Ⅲ)前胶原基因mRNA表达与正常对照组、空载质粒组相比无明显差异(t=1.25与1.27,均t0.05).但TGF-β1+Smad7质粒组α1(Ⅲ)前胶原mRNAff水平较TGF-β1+空载质粒组和TGF-β1对照组明显降低(t=103.87与45.70,均t>t0.01,均P<0.01).结论:Smad7可显著抑制TGF-β1对HSC-T6ct1(Ⅲ)前胶原mRNA表达的促进作用,而对HSC-T6α1(Ⅲ)前胶原mRNA表达无明显影响.     

转化生长因子β1对肝星状细胞迁移及细胞内Rho三磷酸鸟苷酶表达的影响

目的 观察转化生长因子(TGF)β1刺激后肝星状细胞迁移和细胞骨架的变化,并观察TGFβ1刺激对肝星状细胞内Rho三磷酸鸟苷(GTP)酶表达的影响.方法 分离原代大鼠肝星状细胞,用Transwell Chamber观察不同浓度TGFβ1直接及趋化刺激后细胞迁移改变,FITC标记的鬼笔环肽标记F-actin,共聚焦激光扫描显微镜观察细胞骨架的变化,GST pull-down分析检测不同浓度TGFβ1刺激后活性RhoA、Rac1及Cdc42的表达.结果 TGFβ1直接及趋化刺激后肝星状细胞迁移均比对照组增加,≥5 ng/ml浓度时增加明显(直接刺激后130.90±7.64比102.93±1.01,趋化刺激后205.17±10.78比102.93±1.01,P＜0.05);TGFβ1刺激后细胞形态改变,刺激5 min后层状伪足出现,并随时间推移应力纤维逐渐增多;不同浓度TGFβ1刺激后活性Cdc42、RhoA表达较对照组均增强,≥5 ng/ml浓度时表达明显增加(GTP-Cdc420.273±0.024比0.176±0.001,P＜0.05;GTP-RhoA0.176±0.005比0.096±0.004,P＜0.05),而活性的Rac1表达无明显改变.结论 TGFβ1可导致肝星状细胞骨架改变,并可通过激活Cdc42、RhoA GTP酶信号途径,增加细胞迁移.     

转化生长因子β1对大鼠血管平滑肌细胞Smurf2和Ⅰ型胶原表达的影响

目的探讨体外条件下转化生长因子β1(TGF-β1)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)Smad泛素调节因子2(Smurf 2)以及Ⅰ型胶原(ColⅠ)表达的影响。方法应用RT-PCR法检测Smurf2 mRNA的表达,Western印迹法检测Smurf2蛋白的表达,ELISA检测ColⅠ的表达。结果不同浓度TGF-β1(1、5、10μg/L)作用于VSMCs后,细胞中Smurf2的表达量均低于对照组(P<0.05),且5、10μg/L组同对照组相比差异显著(P<0.01),ColⅠ的浓度高于对照组(P<0.05),且5μg/L组同对照组相比差异显著(P<0.01)。结论 TGF-β1呈浓度依赖性抑制Smurf2的表达,促进ColⅠ的产生。     

SB-525334下调肝星状细胞miR-19b和miR-29b的表达

目的了解TGF-β1刺激HSC后SB-525334对I型胶原分泌、miR-19b和miR-29b表达的影响。方法用MTT法检测TGF-β1与SB-525334干预LX-2细胞的最适药物浓度、最佳作用时间。LX-2细胞干预分为4组,对照组、TGF-β1干预组、SB-525334干预组、TGF-β1和SB-525334共干预组。通过蛋白质印迹法分析I型胶原蛋白的表达。反转录实时定量聚合酶链反应(RT-qRCR)分析各组miR-19b和miR-29b的表达。结果 TGF-β1浓度为10 ng/mL时,HSC生存率最高,为132.0%。当SB-525334浓度为10μmol/l时,其抑制率最强,为38.4%。TGF-β1干预组LX-2细胞I型胶原蛋白的表达量(82.80±4.39)%较对照组(17.89±4.27)%显著增高(P0.01),TGF-β1和SB-525334共干预组LX-2细胞I型胶原蛋白表达量为(62.62±3.72)%低于TGF-β1组(82.80±4.39)%(P0.05)。RT-qPCR结果显示SB-525334可下调miR-19b的表达,TGF-β1干预组、SB-525334干预组、以及TGF-β1和SB-525334共干预组LX-2细胞miR-19b相对表达量分别为0.62±0.07、0.28±0.06、0.64±0.20,较对照组明显降低(P0.01),TGF-β1和SB-525334共干预组LX-2细胞miR-19b的相对表达量较SB-525334组高(P0.05),TGF-β1和SB-525334共干预组与TGF-β1干预组LX-2细胞miR-19b的相对表达量比较无明显差异(P 0.05)。SB-525334可下调miR-29b的表达,TGF-β1干预组、SB-525334干预组、以及TGF-β1和SB-525334共干预组LX-2细胞miR-29b相对表达量分别为0.77±0.05、0.44±0.04、0.61±0.06,较对照组降低(P0.05),TGF-β1和SB-525334共干预组LX-2细胞miR-29b的相对表达量较TGF-β1干预组降低(P0.05),TGF-β1和SB-525334共干预组LX-2细胞miR-29b的相对表达量较SB-525334干预组升高(P0.05)。结论 TGF-β1抑制剂SB-525334可抑制HSC分泌I型胶原,并下调其miR-19b和miR-29b的表达。     

益肝康抑制肝星状细胞Ⅰ型胶原合成的作用机制

目的:探讨活血化瘀中药复方“益肝康”抑制肝星状细胞Ⅰ型胶原合成的作用机制。方法:应用West-ern印记检测p38的活化程度;3H-Pro掺入法检测Ⅰ型胶原合成。结果:IL-1β有明显促大鼠HSCⅠ型胶原合成作用,IL-1β(10μg/L)作用培养的HSC24小时后,3H-Pro掺入量明显高于对照组(618.33±52.69vs388.83±49.72,P<0.01),阻断p38通路后,IL-1β的促HSCⅠ型胶原合成作用受到抑制。经不同浓度p38特异性阻断剂SB203580(10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L)预处理的各组细胞,3H-Pro掺入量分别为487.33±42.75、408.50±27.47、400.83±19.49,与对照组(未用SB203580预处理,629.67±69.88)相比,其掺入量均明显降低(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。益肝康可抑制IL-1β诱导的HSC中p38活性,与未用IL-1β处理组相比,在分别刺激HSCs5分钟、15分钟、30分钟和60分钟,HSC p38活性受到明显抑制(P<0.05,P<0.01)。经益肝康浸膏预孵育的益肝康 IL-1β组与单纯IL-1β组相比,p38活性明显受到抑制(1.550±0.410vs2.973±0.953,P<0.01)。结论:IL-1β可促进大鼠HSCⅠ型胶原合成;细胞内p38信号蛋白参与了IL-1β促HSCⅠ型胶原合成;益肝康可通过阻断p38通路,从而发挥抑制HSCⅠ型胶原合成作用。