人SUMO1蛋白表达纯化及单克隆抗体的制备、鉴定

目的 表达重组人SUMO1(small ubiquitin-related modifier 1)蛋白并制备单克隆抗体.方法 构建含人SUMO1基因的重组表达质粒pET32a-HIS-SUMO1,在大肠杆菌中表达重组蛋白HIS-SUMO1;以纯化后的HIS-SUMO1蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,通过ELISA和Western blot方法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定抗体Ig的类型及亚类;取一株筛选细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore抗体纯化试剂盒进行抗体纯化,Western blot方法检测抗体效价.结果 表达纯化了重组人HIS-SUMO1蛋白;3株稳定分泌特异性抗人SUMO1的单克隆抗体杂交瘤细胞株被筛选出,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得效价较高的鼠抗人SUMO1单克隆抗体.结论 通过表达纯化人SUMO1重组蛋白,制备出高效价鼠抗人SUMO1的单克隆抗体,该抗体可用于蛋白质SUMO化的研究.     

抗狂犬病病毒CVS-11株单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗狂犬病毒单克隆抗体,为建立快速准确的狂犬病毒抗原检测方法奠定基础.方法 将狂犬病病毒CVS-11株纯化浓缩后免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经细胞克隆和间接ELISA筛选,获得稳定分泌抗狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株.小鼠腹腔注射法制备大量单克隆抗体并测定腹水效价,用G蛋白亲和层析柱进行纯化,间接ELISA法和间接荧光法鉴定单克隆抗体的类型、特异性及敏感性.结果 细胞融合率达100%,经克隆筛选获4株稳定分泌抗狂犬病病毒抗体的杂交瘤细胞株,其腹水效价分别为1×104,1×105,1×104和1×105;4株单抗均为IgG类型且特异性好.结论 制备的单抗具有良好特异性和敏感性.     

鼠抗人PD-L1单克隆抗体的研制和生物学活性鉴定

目的 研制鼠抗人PD-L1功能性单克隆抗体,并对其生物学活性进行鉴定.方法 以前期原核表达的人硫氧还原蛋白-（PD-L1）融合蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,Western-Blot和酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选阳性杂交瘤细胞,竞争抑制法ELISA实验鉴定抗体的特异性亲和力,小鼠腹水法作大量抗体制备.结果 获得4株能够稳定分泌特异性抗PD-L1抗体的杂交瘤细胞,经验证所分泌的抗体具有较强的特异性亲和力,经过大量抗体制备和纯化获得效价大于1∶32000的纯化抗体;同时获得1株能稳定分泌抗硫氧还原蛋白抗体的杂交瘤.结论 成功制备了鼠抗人PD-L1单克隆抗体,为下一步应用研究奠定了基础.     

人肝再生增强因子单克隆抗体的制备:以非纯化的大肠杆菌表达抗原筛选杂交瘤

目的 :利用杂交瘤技术、以非纯化的大肠杆菌表达重组蛋白作为筛选抗原 ,制备小鼠抗人肝再生增强因子(hALR)的单克隆抗体。方法 :用实验室纯化的重组hALR 硫氧环蛋白融合蛋白免疫BALB c小鼠 ;小鼠脾细胞与SP2 0骨髓瘤细胞融合后经HAT选择培养基筛选杂交瘤 ;以重组质粒pQE30 hALR与空质粒pQE30在大肠杆菌中诱导表达后的细菌裂解产物作为筛选抗原和对照抗原 ,用ELISA方法筛选能分泌抗hALR单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆 ;进一步以ELISA方法和免疫印迹方法检测该杂交瘤细胞产生的抗体对真核细胞表达的重组hALR及人体血清中天然hALR的反应性。结果 :成功筛选出一株能稳定分泌抗hALR单克隆抗体的杂交瘤细胞 ;其产生的抗体能对真核细胞表达的重组hALR及人体血清中天然的hALR发生特异的抗原抗体反应。结论 :大肠杆菌表达的重组蛋白在以空质粒表达产物作为对照下 ,不经过任何纯化步骤也能够用于单克隆抗体制备中的杂交瘤筛选 ;hALR单克隆抗体为深入研究hALR提供了研究手段。     

前列腺特异性抗原的纯化及其单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的:制备抗人前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen,PSA)单克隆抗体.方法:利用盐析、离子交换和凝胶过滤的方法,从人精液中纯化前列腺特异性抗原,采用SDS-PAGE和游离前列腺特异性抗原定量试剂盒联合检测目的蛋白的纯度和含量,用纯化的PSA抗原免疫BALB/c小鼠,按常规的细胞融合与杂交瘤细胞的筛选方法,并对杂交瘤细胞产生的抗体进行了亚型、亲和力、特异性鉴定.结果:获得分泌抗-PSA单克隆抗体的杂交瘤细胞系15株,亲和力高,特异性和稳定性较好,亚型鉴定一株为IgG2a,其余均为IgG1.结论:本次制备的前列腺特异抗原单克隆抗体可用于临床PSA-ELISA诊断试剂的研发.     

抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体并研究其生物活性.方法：分离纯化后的抗CD3 ScFv蛋白免疫BALB/c小鼠,采用传统杂交瘤技术制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体;采用ELISA和Western blot鉴定其亚类和抗原结合特异性;采用FACS测定抗抗CD3 ScFv单克隆抗体对Jurkat细胞特异活性.结果：成功筛选出一株能稳定分泌抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的杂交瘤细胞株（10B7）,其分泌的抗体亚类为IgG1.该抗抗CD3 ScFv单克隆抗体直标后可特异性结合抗CD3 ScFv蛋白和抗CD3抗体.结论：文中所研制的抗抗CD3 ScFv单克隆抗体具有与抗CD3抗体、抗CD3 ScFv蛋白特异结合的活性,在肿瘤导向治疗中抗CD3/抗肿瘤双特异抗体的亲和层析纯化、药代动力学监测等方面具有广泛的应用前景.     

重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)单克隆抗体,为rLZ-8的药效学及药代动力学研究奠定基础.方法:以纯度99%的rLZ-8免疫BALB/c小鼠;应用常规的细胞融合技术建立一种能够稳定分泌抗rLZ-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用小鼠腹腔接种法制备腹水;Protein A Sepharose 亲和层析柱在AKTA纯化仪上对抗体进行纯化;间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价;Western blot胶片曝光方法对rLZ-8单克隆抗体特异性进行分析.结果:筛选出2株可特异性分泌抗rLZ-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株.分别命名为clone13-2-3和clone11-4-4.其抗体亚型分别为IgG1亚型和IgG2a亚型.腹水抗体效价分别为1:12 000和1:7 500,细胞培养上清效价分别为1:3 000和1:2 800.Western blot检测证明这两株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均具有良好的特异性.结论:成功制备出较高效价和较高特异性的鼠抗rLZ-8的单克隆抗体.     

S100A9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备S100A9重组蛋白及其单克隆抗体(mAb),并对抗体进行特异性鉴定。方法以成人肝cDNA表达文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-S100A9和pET-32a-S100A9。融合蛋白在大肠杆菌中表达,纯化后以His-S100A9作为免疫原制备鼠mAb。采用ELISA和Western blot法鉴定筛选抗体。挑取杂交瘤细胞株制备腹水并纯化,采用Western blot法和间接免疫荧光染色鉴定mAb的特异性。结果 GST-S100A9和His-S100A9融合蛋白均成功构建表达。共筛选到抗S100A9杂交瘤细胞18株,其中15株在Western blot检测中与重组蛋白呈强阳性反应,3株呈弱阳性反应。2株可识别肝癌组织间隙液中的S100A9天然蛋白。结论成功地制备出多株抗S100A9的mAb。     

Pfs25蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

目的:制备恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25的单克隆抗体( mAb),建立检测Pfs25蛋白的双抗体夹心ELISA方法.方法:纯化毕赤酵母表达的重组Pfs25蛋白,并免疫BALB/c小鼠,采用骨髓瘤细胞Sp2/0与免疫BALB/c鼠脾细胞杂交的细胞融合技术,通过间接ELISA检测获得分泌抗Pfs25抗体的阳性杂交瘤细胞株,通过免疫F1鼠诱生腹水,纯化腹水,并进行mAb的各项生物学鉴定.辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化后的抗体,以4B7为包被抗体,1B4为酶标抗体,建立了双抗体夹心ELISA法.结果:获得3株抗Pfs25的杂交瘤细胞株,其中2株有良好的稳定性和特异性.并建立了双抗体夹心ELISA检测法,检测有效范围在0.07～1 mg/mL,其检测灵敏度为41.6 ng/mL.结论:成功制备抗Pfs25蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于Pfs25蛋白检测的双抗体夹心ELISA法,为Pfs25蛋白制备传播阻断型疟疾疫苗奠定了基础.     

红系分化相关基因相互作用蛋白质的分离与鉴定

目的制备红系分化相关基因(erythroid differentiation-associated gene,EDAG)蛋白的单克隆抗体,利用免疫沉淀联合质谱技术对EDAG相互作用蛋白质进行分离与鉴定。方法构建EDAG原核表达载体,通过诱导、表达、纯化获得EDAG融合蛋白,杂交瘤技术建立分泌EDAG单克隆抗体的杂交瘤细胞株,利用Western印迹筛选阳性杂交瘤细胞,免疫小鼠得腹水,最后用免疫共沉淀与质谱联合鉴定EDAG相互作用蛋白。结果纯化获得EDAG重组蛋白,筛选出4株分泌EDAG单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备了腹水。该抗体均可用于内源EDAG蛋白的检测,其中两种抗体可用于免疫共沉淀实验,运用质谱技术筛选获得EDAG候选相互作用蛋白。结论利用EDAG单克隆抗体,筛选到EDAG候选相互作用蛋白质13种,涉及细胞增殖及转录等过程,为EDAG的功能研究及其分子机制的阐明提供了新的线索。     

抗人GCRG213单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备GCRG213单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法:在大肠杆菌中表达HIS-GCRG213融合蛋白,并以所获蛋白作为免疫原制备鼠mAb。采用ELISA、Westernblot法鉴定抗体的效价及特异性。免疫组化染色观察GCRG213在胃癌和正常组织中的表达。结果:HIS-GCRG213融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,经常规的细胞融合和筛选获得2株可稳定分泌抗GCRG213的杂交瘤细胞株。ELISA法检测腹水的效价可达到1∶106,Western blot证实该抗体可与重组HIS-GCRG213蛋白特异性结合。免疫组化染色显示GCRG213在胃癌组织中的表达明显强于正常胃黏膜组织。结论:成功地制备出2株抗GCRG213的mAb,为进一步研究GCRG213的生物学功能提供了有效的工具。     

Monoclonal antibodies specific for dengue virus type 3.

Mouse lymphocyte hybridomas were prepared by polyethylene glycol-mediated fusion of cells from a mouse plasmacytoma line with lymphocytes from a mouse hyperimmunized with dengue virus type 3 (dengue-3). Media from 50 hybrid colonies were screened; 46 of them showed antibody activity against dengue-3-infected cells as determined by an indirect immunofluorescent antibody technique. Dengue monoclonal antibody obtained after cloning one of these colonies demonstrated activity in hemagglutination inhibition and indirect immunofluorescent antibody assays with dengue-3 antigen, but not type 1, 2, and 4 antigens. In addition, this antibody activity could be removed from culture media only by absorption with dengue-3 antigen.     

Annexin A2单克隆抗体制备及初步鉴定

制备Annexin A2特异性单克隆抗体(McAb),为Annexin A2的体内外功能的研究提供有力的抗体工具。以原核表达的全长p36蛋白(Annexin A2单体)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对Annexin A2的McAb。以间接ELISA法筛选出目的杂交瘤细胞株并进行染色体计数;分析McAb的亚型,检测其效价、浓度及亲和常数;以细胞荧光染色,Western blot和RT-PCR鉴定McAb特异性。结果得到1株能稳定分泌特异性针对p36的McAb的细胞株F8,其抗体亚类重链为IgG2a,轻链为κ型;腹水纯化后效价为1∶4 000;亲和常数为3.4×109L/mol。成功获得了能稳定分泌AnnexinA2特异性McAb的细胞株。     

抗天花粉蛋白单抗用于天花粉蛋白免疫毒素的亲和纯化

天花粉蛋白（ＴＣＳ）是一种单链致核糖体失活的蛋白，用细胞融合技术筛选到一株分泌抗该蛋白单抗的杂交瘤细胞株（Ｔ１Ａ９），并将单抗Ｔ１Ａ９制成免疫亲和凝胶，用此亲和凝胶纯化以ＴＣＳ和抗人黑色素瘤单抗Ｎｇ７６构建的免疫毒素，能有效地分离掉样品中的游离抗体，提高免疫毒素的毒效。体外细胞毒性实验表明，亲和纯化的免疫毒素对黑色素瘤细胞（Ｍ２１）的杀伤作用比分子筛（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００）层析后的样品提高了６．３倍。它对Ｍ２１细胞的半致死浓度（ＩＣ＿（５０））为１．０×１０￣（－１０）ｍｏｌ／Ｌ。比ＴＣＳ和Ｎｇ７６的混合物的毒性（ＩＣ＿（５０）＝２．５×１０￣（－７）ｍｏｌ／Ｌ）提高了２５００倍。ＴＣＳ是制备免疫毒素的一种有效和常用的“弹头”，用此法纯化这类免疫毒素将会有一定的普遍性。     

人促甲状腺激素单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备特异性强、灵敏度高的人促甲状腺激素（hTSH）单克隆抗体,为建立高灵敏性和高特异性的hTSH检测方法奠定基础。方法：人工合成人促甲状腺激素（hTSH）上的28个氨基酸,采用戊二醛交联法与牛血清白蛋白（BSA）构建完全抗原。用人工免疫原免疫BALB／c小鼠,利用杂交瘤技术建立分泌抗hTSH单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对得到的单抗进行鉴定。结果：建立了一株杂交瘤细胞4E5,制备了腹水单抗,经鉴定,抗体重链属于IgG1类型,轻链属于K型,McAb腹水ELISA效价达1：1．6×10^5,与促黄体生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）无明显交叉反应,细胞株冻存复苏后抗体分泌稳定。结论：本实验建立的细胞株显示稳定性好,特异性高,McAb腹水效价高,为进一步提高hTSH检测的灵敏性和简便性提供依据。     

抗ssDNA单克隆抗体的研制和在检测凋亡细胞中的应用

为了制备抗单链DNA单克隆抗体和建立检测细胞凋亡的新方法 ,采用杂交瘤细胞融合技术用于筛选分泌抗单链DNA抗体的单克隆杂交瘤细胞株 ,并用斑点印迹和竞争ELISA法鉴定单抗的特异性 ,进而结合免疫组织化学和免疫荧光方法用于检测凋亡细胞。通过筛选得到单克隆杂交瘤细胞株B17,其分泌的抗体与单链DNA结合而与双链DNA无交叉反应 ,用此单抗建立的凋亡细胞检测方法能够检测出凋亡细胞 ,区分非凋亡细胞和坏死细胞。实验结果表明 ,成功地获得一株分泌特异性抗单链DNA抗体的单克隆杂交瘤细胞株 ,以此建立的凋亡细胞检测方法特异性高、敏感性强     

FcεRⅠ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基，并用重组蛋白制备单克隆抗体。方法用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεRⅠα蛋白基因，经T-A克隆、亚克隆至pET28a（＋）原核表达载体，将重组质粒转化到大肠杆菌BL．21．STAR（DE3），IPTG诱导表达FeaRIOt亚基蛋白，通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白；并用其免疫BALB／c小鼠，运用杂交瘤技术制备抗FeaRIOt亚基单克隆抗体，用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定。结果成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因，且测序正确；构建原核表达质粒FcεRⅠα-pET28a（＋）；成功建立4株稳定分泌抗FcεRⅠα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为G101、C22、G113、G42。通过细胞免疫荧光实验证实，4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠα亚基。结论成功利用基因重组技术制备了FcεRⅠα亚基蛋白，制备了4株效价高、特异性好的抗FcεRⅠα亚基单克隆抗体，为FcεRⅠα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础。     

副溶血弧菌TDH单克隆抗体的研制与性质鉴定

目的:制备副溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体,并分析其免疫学特性。方法:用纯化的TDH毒素蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法进行阳性细胞筛选,有限稀释法进行亚克隆。并对该单克隆抗体进行了分子量大小、效价、亚类、特异性和亲和力分析。结果:筛选出一株能够稳定分泌TDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为T9H4,其免疫球蛋白亚型鉴定为IgG1,亲和力常数可达2.19×109L/mol,并表现出较强的特异性。抗体纯化后效价达1∶1 024 000,SDS-PAGE电泳结果显示单抗蛋白重链分子量约为50 kD和轻链23 kD。结论:成功获得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,为开发免疫学快速检测方法提供重要实验基础。