睾丸支持细胞的基本生物学特性

目的通过了解睾丸支持细胞(Sertoli cells,SC)的基本生物学特性,探讨SC鉴定的良好方法。方法联合应用复合胶原酶及差速贴壁法从睾丸组织中分离、培养SC,光镜和电镜下观察细胞的形态、MTT法测定细胞的生长曲线,观察其在体外培养条件下的增殖特性;利用免疫细胞染色及免疫荧光染色的方法,检测Fas配体(FasL)的表达,观察其免疫功能;应用吖啶橙荧光染色进行细胞鉴定。结果联合应用复合胶原酶及差速贴壁法分离、培养的细胞在光镜下呈长柱状及三角形,增殖能力强,电镜下胞核中可见特异性卫星小体,胞质中细胞器丰富,免疫细胞染色及免疫荧光染色证实其高表达FasL,吖啶橙荧光染色可见胞核中含有大量异染色质,核仁明显,证实其为SC。结论复合胶原酶及差速贴壁法分离的SC具有良好的增殖能力及免疫功能,电镜、吖啶橙荧光染色是鉴定SC方便、有效的方法。     

大鼠及人肝枯否细胞的分离纯化和培养

目的 改进大鼠肝枯否细胞分离、纯化和培养技术,探讨从人体肝脏手术标本中分离、纯化和培养枯否细胞的可行有效方法.方法 32只SD大鼠肝脏及9例人体肝脏手术标本用于本实验.大鼠肝脏经门静脉、人体肝组织通过肝静脉灌注预灌流液,灌注后肝脏标本采用离体胶原酶灌注消化获得细胞悬液,差速离心获得富含KC的肝非实质细胞.改传统PBS重悬肝非实质细胞为25%percoll重悬,形成新percoll梯度由上向下为:PBS、含肝非实质细胞的25%percoll、50%percoll,不连续密度梯度离心分离获得枯否细胞,最后选择性贴壁进一步纯化.应用吞噬功能实验对KC进行鉴定,台盼蓝拒染实验判定细胞活力.结果 最终获得的枯否细胞的产量分别为:大鼠3.1±0.5×106/g肝脏,人体肝脏组织为2.3±0.4×106/g肝脏,细胞活力和纯度均达90%.结论 本实验建立的大鼠及人体肝脏枯否细胞分离方法,简便经济,效果稳定,获得的枯否细胞可用于进一步的实验研究.     

成年大鼠嗅鞘细胞的分离培养及形态学研究

目的：探讨成年大鼠嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）的分离培养和纯化方法,并观察其形态学变化及免疫组织学特性,为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富嗅鞘细胞来源奠定理论基础。方法：采用原代培养技术,从成年SD大鼠的嗅球分离培养嗅鞘细胞,用Nash差速贴壁法和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养纯化,倒置相差显微镜下观察嗅鞘细胞的形态变化特点及其生长情况,并行神经生长因子受体（NGFRp75）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组织化学染色鉴定以及纯度检测。结果：体外培养的成年大鼠嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞,其突起细长。未经纯化则成纤维细胞生长迅速而占据优势,而纯化培养后的嗅鞘细胞纯度可达90％以上。免疫细胞化学染色显示,培养的嗅鞘细胞呈现NGFRp75和GFAP染色阳性。结论：成年大鼠嗅鞘细胞的原代培养中细胞纯化是必要且必须的;而在脊髓损伤修复的研究中,Nash差速贴壁法和化学药物法不失为一种简单、经济、实用的嗅鞘细胞纯化方法。     

大鼠移植肝内Kupffer细胞分离及对T细胞增殖的抑制效应

目的:建立分离、纯化和培养大鼠肝脏Kupffer细胞(KC)的方法,并观察KC对同种反应性T细胞增殖的影响。方法:采用在体原位肝脏灌注结合密度梯度离心技术,进行肝移植受体大鼠肝脏KC分离、纯化和培养。在体外实验中进一步观察KC在MLR(混合淋巴细胞反应)体系中对同种反应性T细胞增殖程度的影响。结果:KC得率为(1.1±0.2)×107/肝,平均存活率为(93.5±1.8)%,纯度≥90%,ED-2( )。培养24h可见大量细胞伸展生长,呈现典型的星形或多边形。在MLR体系中加入未经辐照的KC后,反映T细胞增殖程度的每分钟脉冲数值明显降低,且接受联合免疫治疗并长期存活的D、E两组所获得的KC对T细胞增殖有着更为明显的抑制作用。结论:本实验成功建立了分离、纯化和培养大鼠KC的方法。KC对同种反应性T细胞增殖具有抑制作用,尤其从接受联合免疫治疗后长期存活受体大鼠所获得的KC抑制作用更为明显。     

成年大鼠嗅球成鞘细胞的原代培养及形态学研究

目的探讨大鼠嗅球成鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs)分离与纯化培养方法并对形态学进行研究。方法取材后采用差速贴壁和阿糖胞苷(Arac)抑制相结合的纯化培养方法培养嗅鞘细胞,并分不同阶段进行观察和NGFRp75和GFAP免疫组化染色鉴定。结果成功培养出高纯度的嗅鞘细胞,胞体呈梭形、多突起形及油煎蛋形三种类型,突起细长编织成网状为其特点。结论差速贴壁和Ara-c抑制相结合的纯化培养方法兼收了两者的优点,实践证实是一种简单经济而又有实效的嗅鞘细胞培养方法。     

人胚胎嗅球嗅鞘细胞的体外培养

目的探讨人胚胎嗅球嗅鞘细胞的分离和培养方法。方法：选取家属同意下引产的4-5月胎儿，分离原代嗅球成鞘细胞，利用差速贴壁法结合无血清饥饿培养法对细胞进行纯化，计算其纯度。结果通过差速贴壁法结合无血清饥饿培养法，可获得纯度70％-80％嗅鞘细胞．显微镜下观察细胞形态，以双极和三极细胞为主，亦有少许多极及梭形细胞。结论应用差速贴壁法与无血清饥饿培养法分离培养人胚嗅球成鞘细胞是一种较为稳定可靠的方法。     

兔骨髓源性单核细胞分化为血管内皮祖细胞的体外研究

目的探讨采用密度梯度离心法和差速贴壁法分离兔骨髓源性血管内皮祖细胞,并对分离细胞进行培养及鉴定。方法通过细胞形态观察、免疫荧光染色、管腔形成实验以及低密度脂蛋白吞噬和植物凝集素贴附实验进行鉴定。结果分离培养的细胞呈多角形生长,细胞能够形成放射样克隆集落,细胞表达血管假性血友病因子(vW F),在基质胶呈管腔样生长,吞噬低密度脂蛋白并能够黏附植物凝集素。结论采用密度梯度离心法和差速贴壁法分离兔骨髓源性干细胞,在一定条件下能分化成为血管内皮祖细胞。     

BALB/c鼠枯否细胞的分离培养与鉴定

目的 :肝脏是肿瘤转移的好发部位 ,而肝脏含有丰富的免疫细胞 -枯否细胞 (Kupffer Cell,KC)。为研究枯否细胞的抗癌活性 ,旨在探讨 BAL B/ c鼠枯否细胞的分离培养方法。方法 :选用健康雄性 8～ 10周龄 BAL B/ c鼠 ,麻醉无菌取肝 ,注射冲洗去血并剪去部分结缔组织 ,小玻璃瓶中剪碎肝组织 ,加入 0 .0 4 %的 EDTA和 0 .0 5 %链霉蛋白酶 E溶液 ,交替轻轻吹打消化。不锈钢筛网滤过 ,用 0 .0 0 4 % Dnase 的 16 4 0液清洗细胞液 ,加 Tris-氯化胺溶解红细胞。 30 %～ 70 % Percoll梯度离心 ,10 % FBS贴壁培养 4～ 6 h洗去非贴壁细胞。通过对比体内、体外枯否细胞吞噬墨水和体外吞噬聚苯乙烯乳珠 (latexbeads,D1.1μm )鉴定枯否细胞。结果 :Kupffer细胞的得率为 (7.5 7± 1.92 )× 10 6 个 /鼠肝 ,即 6 .15× 10 6 个 / g,贴壁率为4 0 .18%。用 0 .4 %台盼蓝染色鉴定 ,细胞存活率在 95 %以上 ,吞噬鉴定发现 Kupffer细胞的纯度可达 90 %。贴壁 Kupffer细胞的形态多样 ,可见不规则 ,多边形 ,多角伪足 ,典型的星形及多角形。体外培养枯否细胞存活 2周后未见再有吞噬功能。结论 :酶消化法结合梯度离心和贴壁培养是分离 BAL B/ c鼠枯否细胞的可靠方法 ,为进一步实验打下了基础     

大鼠胰腺导管上皮细胞体外分离与定向分化

目的分离和纯化大鼠的胰腺导管上皮细胞，在体外培养并诱导其向胰岛细胞定向分化。方法采用胶原酶逆行灌注法消化、密度梯度离心结合不同细胞贴壁差异性分离和纯化胰腺导管上皮细胞；以角蛋白-19（CK-19）免疫细胞化学染色进行鉴定；用RMPI1640＋含体积分数为10％的胎牛血清（FBS）培养基培养促进胰导管上皮细胞增殖，1周后，更换无血清培养基DMEM／F12并加入角朊细胞生长因子等进一步促进其增殖，细胞达80％汇合时传代，加入高糖及尼克酰胺促进胰导管上皮细胞向胰岛细胞定向分化；对胰岛样结构行双硫腙染色。结果CK-19染色结果证实所获细胞绝大多为导管上皮细胞。体外培养中导管上皮细胞24h开始贴壁，14-21d达80％融合并形成细胞克隆，第28d胰岛细胞样结构形成，且被双硫腙染成猩红色。结论采用密度梯度离心结合差异贴壁法可获得纯化的大鼠胰腺导管上皮细胞，在体外培养与诱导分化条件下可生成胰岛样结构。     

BALB/c鼠肝脏枯否细胞不同分离培养方法的比较

目的建立简便易行,存活好、产量和纯度高,稳定的枯否细胞（Kupffer Cell,KC）分离培养方法。方法根据酶消化时间不同和裂解红细胞的方法在酶消化之后和之前分方法Ⅰ和方法Ⅱ。分别运用0.1%的Ⅱ型胶原酶、0.05%链酶蛋白酶E和0.005%DnaseⅠ在不同方法中离体消化肝组织并进行密度梯度离心和贴壁培养提取KC,通过吞噬实验观察鉴定KC。结果方法Ⅰ和方法Ⅱ中KC的数量分别是（0.71±0.21）×10^7/g和（0.96±0.20）×10^7/g,细胞贴壁率分别40.1%、45.1%。用0.4%台盼蓝染色鉴定,存活率分别为90%、95%。吞噬实验发现,细胞纯度分别为90%、95%。结论结合碾磨筛网滤过降低酶作用时间并在酶消化之前裂解红细胞分离提取枯否细胞具有存活好产量纯度高的优点。     

In vitro lipofectamine mediated NF-κB decoy oligodeoxynucleotides transfection of Kupffer cells

Objective To study the transfection effects of nuclear factor-KappaB(NF-κB)decoy oligodeoxynucleotides(ODN) to Kupffer cells (KCs) mediated by lipofectamine,and investigate it's suppression effects on KCs activation. Methods Twenty-four Wistar rats were divided into three groups (n=8).(1)Control group,in which the normal KCs were isolated.(2)LPS group,in which 1 ms/L LPs was added to the culture system.(3)NF-κB decoy ODN group,in which KCs were transduced with NF-κB decoy ODN (4μg×105KCs)prior to LPS stimulation.The transfection efficiency Was assayed,and the phagocytosis function,NF-κB(P65) translocation,CD40 mRNA expression of KCs were also detected respectively. Results Kupffer cells were obviously activated after LPS stimulation.the phagocytosis function was reinforced.the activity of NF-κB transloeated from cytoplasm into nucleus was obviosly increaced.The co-stimulatory molecules expression(CD40 mRNA)significantly increased compared with control group(t=4.01,P<0.01).NF-κB decoy oligodeoxynucleotides can efficiently transfected into KCs mediated by lipofectamine,which can obviously suppress KCs activation,and downregulate the expression of downstream gene(compared with LPS group,t=4.89,P<0.01). Condusion NF-κB decoy ODN can efficiently transfect into KCs and inhibit it's activation.     

In vitro lipofectamine mediated NF-κB decoy oligodeoxynucleotides transfection of Kupffer cells

Objective To study the transfection effects of nuclear factor-KappaB(NF-κB)decoy oligodeoxynucleotides(ODN) to Kupffer cells (KCs) mediated by lipofectamine,and investigate it's suppression effects on KCs activation. Methods Twenty-four Wistar rats were divided into three groups (n=8).(1)Control group,in which the normal KCs were isolated.(2)LPS group,in which 1 ms/L LPs was added to the culture system.(3)NF-κB decoy ODN group,in which KCs were transduced with NF-κB decoy ODN (4μg×105KCs)prior to LPS stimulation.The transfection efficiency Was assayed,and the phagocytosis function,NF-κB(P65) translocation,CD40 mRNA expression of KCs were also detected respectively. Results Kupffer cells were obviously activated after LPS stimulation.the phagocytosis function was reinforced.the activity of NF-κB transloeated from cytoplasm into nucleus was obviosly increaced.The co-stimulatory molecules expression(CD40 mRNA)significantly increased compared with control group(t=4.01,P<0.01).NF-κB decoy oligodeoxynucleotides can efficiently transfected into KCs mediated by lipofectamine,which can obviously suppress KCs activation,and downregulate the expression of downstream gene(compared with LPS group,t=4.89,P<0.01). Condusion NF-κB decoy ODN can efficiently transfect into KCs and inhibit it's activation.     

阻塞性黄疸患者肝脏巨噬细胞功能变化的临床研究

为探讨阻塞性黄疸患者围手术期感染发生率明显增高的原因，对３６例阻塞性黄疸患者围手术期肝脏Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞吞噬功能和血浆内毒素水平变化进行了观察，并与２０例单纯性胆囊结石患者进行比较。结果显示：胆道梗阻后Ｋｕｐｆｅｒ细胞吞噬功能降低，与对照组比较有显著性差异（Ｐ＜０．０５）；血浆内毒素含量升高，与对照组比较有高度显著性差异（Ｐ＜０．０１）。经手术胆道引流后，血浆内毒素水平则逐渐降低。随着Ｋｕｐｆｅｒ细胞吞噬功能恢复，血浆内毒素进一步降低。由此表明，胆道梗阻后Ｋｕｐｆｅｒ细胞吞噬功能变化与血浆内毒素水平有显著的相关关系。     

小鼠肝内源性损伤下TLRs在Kupffer细胞和肝窦内皮细胞中的表达

目的　观察在小鼠内源性损伤模型下肝脏Kupffer细胞 (Kupffercell,KC)和肝窦内皮细胞 (sinusoidalendothelialcells,SEC)表面Toll样受体 2 (TLR2 )蛋白及mRNA表达。方法　在肝部分缺血 再灌注损伤模型下 ,采用原位灌注消化法分离并纯化KC和SEC ,用大鼠抗小鼠TLR2 IgG和异硫氰酸荧光素 (FITC)的二抗进行染色 ,流式细胞仪 (FCM)测定阳性细胞数 ,并用实时定量PCR(Real TimeRT PCR)检测两种细胞中TLR2 mRNA含量。结果　损伤组KCTLR2 的表达明显高于假手术组 ,蛋白质表达为 ( 9.19± 1.0 7) %vs ( 1.5 2± 0 .2 1) % ,P<0 .0 1;mRNA表达为 0 .5 4± 0 .77vs 2 .6 2± 2 .19,P<0 .0 5。SEC差异并无显著性意义。结论　在肝缺血 再灌注损伤中 ,小鼠肝KCTLR2 在蛋白质和mRNA水平的表达明显增高     

谷氨酰胺对内毒素激活大鼠枯否细胞的免疫调理作用

目的　探讨谷氨酰胺调节大鼠枯否细胞（KC）免疫功能的可能机制。方法　体外培养条件下,内毒素(LPS)激活KC,采用聚苯乙稀颗粒检测KC的非特异吞噬作用,3-氢尿嘧啶(3H-Uridine)掺入法反映KC合成RNA的能力,生物素链亲和素酶联免疫吸附法（ELISA）法检测KC肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6的分泌量。结果　培养液中谷氨酰胺的浓度从0.000mmol/L上升到0.500mmol/L时,KC吞噬聚苯乙稀颗粒数量、3H-Uridine掺入量、TNF-α和IL-6分泌量分别从(8.80±0.74)/细胞、(20425±2768)DPM/1×106细胞、(105±80)μg/L、(12±2)μg/L上升到(18.53±2.15)/细胞、(39328±2169)DPM/1×106细胞、(300±30)μg/L、(37±4)μg/L。结论　KC的非特异性吞噬作用、3H-Uridine掺入量、TNF-α和IL-6分泌量依赖于培养液中谷氨酰胺的含量,谷氨酰胺缺乏或不足导致KC的特异性和非特异性的免疫功能低下。     

Role of Kupffer cells in the survival after rat liver transplantation with long portal vein clamping times

Applying the orthotopic rat liver transplantation (ORLT) model, postoperative survival has been shown to be mainly dependent on the portal vein clamping time (PVCT). It was hypothesized that prolonged intestinal congestion was responsible for the activation of Kupffer cells (KC) with overproduction of TNF, secondary to splanchnic endotoxin accumulation and release on reperfusion. The role of KCs was directly investigated in the context of long PVCTs by eliminating them (using liposome-encapsulated dichloromethylene diphosphonate), by preventing their activation (using a calcium channel blocker, nisoldipine) and by inhibiting TNF production (using thalidomide). Livers from different groups of rats were transplanted following 24-h cold preservation in the UW solution with long PVCTs (from 18–21 min). KCs depletion, preservation with nisoldipine and pretreatment with thalidomide significantly improved survival in conditions using long PVCTs. KC depletion and nisoldipine preservation had no effect on liver enzymes or pathological findings while lung injury was significantly improved. The present data confirm that, in the context of ORLT with long PVCTs, KCs are directly responsible for the systemic endotoxin-like shock syndrome and their effect is mediated through overproduction of TNF. Received: 30 August 1999 Revised: 18 May 2000 Accepted: 12 September 2000     

雷抑素对肝移植大鼠肝Kupffer细胞的影响

利用大鼠原位肝移植模型，观察移植术前应用雷抑素（Ｌｅｆ）对大鼠肝Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞形态及功能的影响，结果显示，对照组肝移植术后３小时血清肿瘤坏死因子（ＴＮＦ），ＡＬＴ活性显著升高，肝组织丙二醛（ＭＤＡ）水平也显著增加，有药组血清ＴＮＦ，ＡＬＴ活性及肝组织ＭＤＡ水平显著下降，电镜检查，对照组肝Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞呈典型“活化”表现，而用药组肝Ｋｕｐｆｆｅｒ则呈非“活化”表现。结果提示，移植术前应用Ｌｅ     

枯否细胞和肝脏缺血再灌注损伤

目的 了解枯否细胞在肝脏缺血再灌注损伤中的作用。方法 采用文献回顾的方法对枯否细胞在肝脏缺血再灌注损伤中的作用加以综述。结果 活化后的枯否细胞可产生和释放多种介质直接或间接地影响肝脏微循环。结论 枯否细胞在肝缺血再灌注损伤中发挥了重要作用。     

脂质体包裹氯膦酸二钠剔除大鼠肝脏枯否细胞作用的研究

目的探讨脂质体包裹氯膦酸二钠剔除大鼠肝脏枯否细胞的作用。方法实验组大鼠给予脂质体包裹的氯膦酸二钠,对照组给予等量生理盐水。给药后不同时间点计数ED1、ED2阳性细胞数目;尾静脉注射印度墨汁判断枯否细胞吞噬碳素颗粒的情况;RT-PCR检测枯否细胞受体mRNA的表达情况。结果给药后2d大鼠肝脏吞噬碳素颗粒的枯否细胞消失,ED1、ED2阳性细胞基本消失,PCR检测不到肝脏枯否细胞受体mRNA的表达。给药后第8天ED1阳性细胞开始明显增多,至第11天其数目基本恢复正常。ED2阳性细胞至第11天开始增加,但平均每中倍视野仍仅有(4.8±1.7)个细胞,明显少于对照组的(17.7±2.1)个细胞,差异具有统计学意义(P0.01)。结论静脉单次注射脂质体包裹氯膦酸二钠至少在1周内能有效剔除肝脏枯否细胞。     

肿瘤坏死因子-α、Fas/FasL在急性胰腺炎肝细胞凋亡中的作用

目的 观察大鼠肝枯否细胞(KCs)产生的炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、Fas/FasL和核因子(NF)-κB在重症急性胰腺炎(SAP)肝细胞凋亡中的作用,并探讨其与全身炎症反应综合征(SIRS)之间的关系.方法 将50只SD大鼠随机分成3组:(1)假手术对照(SO)组;(2)SAP组;(3)SAP(枯否细胞抑制)组.SAP模型通过胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠诱导.假手术及造模大鼠均24 h后处死,无菌条件下取肝脏组织,制作石蜡切片,免疫组织化学SP法检测TNF-α、Fas/FasL的表达,原位杂交法检测NF-κB的表达,TUNEL法检测肝细胞凋亡.结果 (1)TNF-α、Fas/FasL和NF-κB在SAP组高表达,阳性率分别为90.0%、85.0%和80.0%,与SO组比较差异均有统计学意义(P<0.05);SAP枯否细胞抑制组它们表达下降,与SAP组比较差异有统计学意义(P<0.05),与SO组比仍然高表达(P<0.05).(2)NF-κB与Fas/FasL及TNF-α的表达均密切相关,相关系数分别为r1=0.78(P<0.05),r2=0.88(P<0.05).(3)肝细胞的凋亡与TNF-α、Fas/FasL和NF-κB的表达呈正相关,相关系数分别为ra=0.72,rb=0.91,rc=0.34,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 在SAP时TNF-α能造成肝细胞凋亡并能引起全身炎症反应,NF-κB在SAP时细胞因子基因表达中起中心作用,Fas/FasL在肝细胞凋亡中起重要作用;枯否细胞在SAP时释放炎症因子造成肝损伤引起肝细胞凋亡,抑制枯否细胞能减轻SAP时肝细胞凋亡,从而降低SAP病死率,提高SAP的治愈率.