Thermobifida fusca麦芽三糖淀粉酶的重组表达及其在麦芽三糖制备中的应用

麦芽三糖淀粉酶以淀粉或麦芽糊精为原料,可生产麦芽三糖,在食品、饮料等行业具有广泛的应用前景。实验将Thermobifida fusca NTU22来源的麦芽三糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌WS11中进行重组表达,并进行酶学性质分析,重组酶的最适温度和pH分别是55℃和6.0。在此基础上探究了重组酶作用于麦芽糊精生产麦芽三糖的最佳条件。结果表明,以15%浓度的麦芽糊精(DE 5-7)作为底物时,酶转化的最佳条件是温度55℃、pH 5.5、加酶量60 U/g(底物)、普鲁兰酶加酶量32 U/g(底物)、反应时间11 h,此时得到麦芽三糖转化率44.4%。该研究为工业制备麦芽三糖提供了理论依据。     

用麦芽四糖淀粉酶生产麦芽四糖

采用麦芽四糖淀粉酶，以可溶性淀粉为底物进行了包括温度、ｐＨ值、反应时间、加酶量等多种产糖条件的试验，得到了较理想的反应参数。所得产品麦芽四糖占总糖的比例达８０％以上，转化率为５５％左右。     

麦芽四糖生产工艺试验

麦芽四糖是一种新型麦芽低聚糖．试验中采用麦芽四糖淀粉酶和普鲁兰酶协同水解预处理过的淀粉,通过单因素试验和响应面曲线（ＲＳＡ）法确定了较好的酶解工艺条件．所得产品中麦芽四糖占总糖比例达８４％以上,转化率为７７％左右     

嗜糖假单胞菌麦芽四糖淀粉酶的枯草芽孢杆菌表达及酶学性质分析

麦芽四糖淀粉酶是淀粉酶中第3种外切型酶,可以顺序地从淀粉非还原性末端依次切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域。该研究采用含有P43启动子和SacB信号肽的pWB980枯草芽孢杆菌表达载体,连接嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖淀粉酶基因,获得了重组菌pWB980-G4/1A747,实现了麦芽四糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的外分泌表达,并具有生物学活性。对表达产物进行酶学性质分析,结果表明麦芽四糖淀粉酶可广泛作用于7种不同来源的淀粉,生成单一产物麦芽四糖。最适反应温度为50℃,最适pH为7.0。进一步对pWB980-G4/1A747菌株进行发酵条件优化,得到其最佳活化时间为5 h,接种量为5%(v/v),通气量为20 mL/150 mL,培养时间为24 h,培养温度为37℃。     

麦芽四糖生产工艺的研究

麦芽四糖是一种新型麦芽低聚糖,具有易消化吸收、低甜度、高黏度、保湿性好、吸湿性低、抗龋齿、增稠作用强、冰点作用小、低渗透压、防止食品中蛋白质变性等特点,广泛应用于食品行业、饲料行业、造纸行业及及生化试剂分析行业等。以本公司自制的淀粉液化液为原料,通过对液化液DE值、糖化温度、糖化p H、糖化时间、普鲁兰酶添加量及麦芽四糖酶添加量的研究发现,普鲁兰酶与麦芽四糖酶协同作用效果比较明显,它们的共同使用可以明显提高麦芽四糖含量。通过对DE值、糖化温度、糖化p H作正交试验表明,影响麦芽四糖含量各因素的主次关系依次是DE值、糖化温度、糖化p H;在底物浓度27%,普鲁兰酶添加量为0.5ml/L,麦芽四糖酶添加量为0.4ml/L,DE值为5,糖化温度为55℃,糖化p H 5.5时,麦芽四糖含量最高,为57.42%。     

嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达

为了考察重组地衣芽孢杆菌的异源表达特性,进一步提高麦芽四糖酶的发酵水平,以适用于工业化生产,研究构建了木糖诱导型的重组地衣芽孢表达系统,表达了来源于嗜糖假单胞菌的麦芽四糖酶基因,并进行了初步发酵优化。结果显示,构建的表达系统经过核酸电泳以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴定均正确,该系统在发酵过程中经过木糖诱导,重组酶能够成功地分泌至发酵液中,然后通过对诱导剂添加时间、诱导温度和发酵时间优化后,摇瓶水平的最大酶活力可达(168. 2±9. 41) U/m L。最佳的发酵条件为,在24 h添加诱导剂,诱导温度30℃,发酵至稳定期结束停止发酵。该研究为重组地衣芽孢杆菌的异源表达研究以及麦芽四糖酶的工业化应用提供了参考。     

麦芽搭配及淀粉酶系活力对麦汁糖组分的影响

分析了不同产地(加拿大、澳大利亚)、不同品种(Metcalfe、Copeland、Hind marsh、Bass、Baudin、Scope、Gairdner)麦芽淀粉酶系活力,发现加拿大麦芽淀粉酶活力普遍高于澳大利亚麦芽,且品种间存在显著差异;通过研究麦芽淀粉酶系活力与常规指标的关系,发现常规指标糖化力与β-淀粉酶与极限糊精酶活力存在显著相关性;其次,将酶系活力差异较大的麦芽按照不同比例进行搭配,分析搭配前后酶活力变化,发现搭配后3种酶活实际值均高于按比例计算的理论值,表明麦芽搭配具有协同作用;为进一步研究淀粉酶活力对麦汁糖组分的影响,模拟大生产含辅料的糖化工艺进行麦汁制备,分析配方麦芽淀粉酶活力与麦汁糖组成的关系,发现影响麦汁极限发酵度、可发酵性糖比例的关键酶为极限糊精酶。     

重组蔗糖异构酶的制备及应用条件优化

对重组菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-24a-pal I摇瓶发酵产酶进行研究,探讨了3 L发酵罐中不同乳糖诱导浓度对菌体高密度发酵产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵得到胞外上清酶活253.1 U/m L,3 L发酵罐高密度发酵时,在0.4 g/(L·h)乳糖诱导浓度下,发酵上清酶活可达到最大值654 U/m L。对重组蔗糖异构酶转化蔗糖生成异麦芽酮糖的酶转化条件进行了优化,结果表明,当底物浓度为400 g/L,反应初始p H 6.5,温度30℃,加酶量20 U/g蔗糖,转化时间8 h,异麦芽酮糖可以达到最大转化率87.9%。     

血红密孔菌Pycnoporus sanguineus SYBC-L10产纤维二糖脱氢酶的发酵优化

研究了血红密孔菌Pycnoporus sanguineus SYBC-L10产纤维二糖脱氢酶的发酵优化。该酶是诱导酶,微晶纤维素是其最好的诱导底物。通过对发酵培养基中培养成分的优化,添加大分子碳源微晶纤维素和小分子碳源葡萄糖作为复合碳源,发酵优化后提高到78±5.94 U/L,是未优化前的2倍(39±4.78 U/L)。通过对氮源的优化,即有机氮源黄豆粉和无机氮源磷酸氢二铵的添加,使酶活达到700±35.78 U/L,比优化前提高了近17倍。而通过四因素四水平的碳氮源正交实验之后酶活达到1245±35.78 U/L,比优化前提高了近32倍。由此,确定了当微晶纤维素为7 g/L,葡萄糖5 g/L,黄豆粉6 g/L,磷酸氢二铵2 g/L时,其他不变,此时的产酶最高,达到1 245±35.78U/L。     

枯草芽胞杆菌重组表达的Pantoea dispersa UQ68J蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的研究

异麦芽酮糖是蔗糖的同分异构体,具有多种优秀的生理功能,广泛应用于食品行业。蔗糖异构酶可以将蔗糖异构为异麦芽酮糖,与其他微生物来源的蔗糖异构酶相比,Pantoea dispersa UQ68J来源的蔗糖异构酶转化蔗糖时异麦芽酮糖产率高,副产物少。为了更好地将异麦芽酮糖应用于食品领域,该研究将P.dispersa来源的蔗糖异构酶在食品安全微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中重组表达,研究重组蔗糖异构酶的酶学性质并优化其制备异麦芽酮糖的反应条件。结果表明,重组酶的最适pH值为6.0,最适温度为30℃,在pH 5.0～8.0稳定性良好,在45℃下的半衰期为68 min。用该重组酶制备异麦芽酮糖,当蔗糖质量浓度为400 g/L,加酶量为20 U/g,在30℃、pH 6.0条件下转化10 h时,异麦芽酮糖产率可达90.61%,当蔗糖质量浓度提高到700 g/L,异麦芽酮糖产率仍可达89.20%。该研究提高了蔗糖异构酶的安全特性,实现了异麦芽酮糖的高产率,为工业生产异麦芽酮糖奠定了基础。