杜仲水提液对嗜酸乳杆菌生长及发酵产物的影响

制备5 种不同质量浓度的杜仲水提液添加到MRS培养基中对嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）CICC6005进行培养,旨在探究不同质量浓度的杜仲水提液对L. acidophilus CICC6005增殖情况及对发酵过程中胞外和胞内蛋白含量变化的影响,并对其蛋白组分进行分析。发酵所得胞外和胞内蛋白分别用三氯乙酸-丙酮沉淀法和试剂盒法获得,采用Sephadex G-100凝胶层析分离技术对胞外和胞内蛋白分离纯化,用二喹啉甲酸法和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分别测得各组分蛋白的含量及分子质量。结果显示：当培养基中添加的杜仲水提液质量浓度为0.125 0 g/mL时,对菌体增殖有明显的促进作用,菌体生物量最大（4.38×108 CFU/mL）,同时在此质量浓度时菌体胞外和胞内蛋白含量也达到最大值;胞外和胞内蛋白经过Sephadex G-100凝胶层析分离后均得到2 个明显的蛋白峰,胞外蛋白两组分分子质量分别为67、31 ku,胞内蛋白两组分分子质量分别为57、17 ku。综上,添加适宜质量浓度的杜仲水提液对L. acidophilus CICC6005的增殖起到了一定的促进作用,并对其发酵产物组成产生了一定的影响。     

嗜酸乳杆菌胞外蛋白调控MAPK和PI3K-AKT信号途径关键蛋白活化水平

探讨并揭示嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CICC6005分泌的相关蛋白质促进肠道健康及分子机制具有重要研究价值。本实验在确定了L.acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白抑制HT-29结肠癌细胞增殖的基础上,进一步探讨67 ku和37 ku的胞外蛋白通过何种途径发挥抑制结肠癌细胞增殖。研究以HT-29细胞作为靶细胞,用丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B,PI3K-AKT)信号通路为考察对象,以Western Blotting为手段,分析两个通路中关键的靶点蛋白p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、磷酸化p38(phosphorylated p38,p-p38)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)、磷酸化的细胞外信号调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated AKT,p-AKT)、PI3K的表达水平,以探讨并阐述源于L.acidophilus CICC6005胞外蛋白调控结肠癌细胞增殖状况的分子机制。结果表明,不同质量浓度的67 ku和37 ku胞外蛋白分别作用HT-29细胞一定时间后,两种胞外蛋白均具有下调两个信号通路途径中p-ERK1/2、p-p38、p-AKT、PI3K蛋白的表达,且存在浓度依赖关系;但对p-JNK、ERK1/2、p38、JNK蛋白的表达没有影响。因此,源于L.acidophilus CICC6005分泌的37 ku和67 ku胞外蛋白表现出显著的抑制HT-29细胞增殖的功能,其机制可能与调控MAPK和PI3K-AKT两个信号通路中几个关键的靶点蛋白的活化水平相关。该研究结果提示,食用嗜酸乳杆菌其分泌的胞外蛋白质将达到维护肠道健康的目标。     

嗜酸乳杆菌胞外蛋白的分离纯化及抑制HT-29细胞增殖作用的研究

为探讨嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)分泌的相关蛋白质及其促进肠道稳态的功能作用,本研究以L.acidophilus作为研究对象,固体培养获得胞外蛋白粗提液,采用Sephadex G-100凝胶层析纯化,收集胞外蛋白各组分,用考马斯亮蓝法和SDS-PAGE方法分别测定各蛋白组分的含量及分子量,然后采用四氮唑蓝比色分析法(MTT法)鉴定各蛋白组分抑制HT-29细胞增殖的能力。研究显示,分离L.acidophilus胞外蛋白获得两个蛋白峰,分子量分别为67 ku和37 ku,含量分别为0.066 mg/m L和0.021mg/m L,不同浓度(0.001μg/m L、0.01μg/m L、0.1μg/m L和1μg/m L)的67 ku和37 ku胞外蛋白分别对HT-29细胞作用12 h、24 h、48 h和72 h,均显示抑制细胞增殖的作用,且呈现明显的量效关系和时间依赖效应,其中1μg/m L的67 ku和37 ku胞外蛋白对HT-29细胞作用48 h的抑制率分别为(38.41±1.94)%和(45.06±1.58)%。综上所述,固体培养L.acidophilus可获得两种胞外蛋白(即37 ku和67 ku),其对HT-29细胞增殖具有不同程度的抑制作用,其中37 ku胞外蛋白的抑制作用较强。     

米曲霉发酵液中蛋白动态变化的研究

本文利用葡萄糖和吐温80作为额外碳源培养米曲霉,对其生物量积累,胞链接蛋白以及发酵液蛋白随培养时间的变化情况进行了研究。以葡萄糖作为额外碳源时,米曲霉生物量积累速度较快,在培养24 h已达最大值,为31.97 g/L;当米曲霉以吐温80作为额外碳源时菌体积累较慢,在96 h时达到最大值,为11.15 g/L。发酵液中蛋白总量在以葡萄糖作为额外碳源时比以吐温80时低。以吐温80作为额外碳源时,胞链结蛋白在72 h达到最大值的5.65 mg/g,当以葡萄糖作为额外碳源时,米曲霉胞链结蛋白含量在48 h达到最大值,为1.71 mg/g。利用SDS-PAGE检测192 h内胞连接蛋白质的表达与发酵液中的蛋白质的含量变化与利用lowry法测定的蛋白质含量具有一致的变化趋势:在米曲霉的快速生长期和稳定期时胞链结蛋白种类增加,在衰退期胞链结蛋白种类减少。     

大豆糖蜜高产单细胞蛋白菌株的筛选及其生长条件

以大豆糖蜜为底物,通过平板初筛和三角瓶摇瓶发酵复筛,从8株单细胞蛋白生产常用的酵母菌中筛选出在10%大豆糖蜜中生物量和总蛋白产量最高的热带假丝酵母CGMCC2.587,其细胞生物量为8.4125g/L,总蛋白产量为4.4696g/L。通过单因素实验确定了菌株生长的最佳培养基为5%麦芽汁培养基;培养条件为初始pH5.0、装液量50mL/250mL、转速160r/min、温度30℃。     

人对氧磷酶1在巴斯德毕赤酵母中的表达与纯化

人对氧磷酶1（Human Paraoxonase 1,hPON1）是人体血液中的一种非专一性酯酶,可以水解多种有机磷化合物,被认为是一种有机磷农药中毒的解毒剂。为了得到较纯的具有活性的hPON1,本文采用巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达系统,对hPON1进行胞内表达。hPON1基因经过密码子优化后克隆至pPICZA表达载体上,构建得到pPICZA-PON1重组表达质粒,经线性化后转化至巴斯德毕赤酵母X33菌株中,筛选得到阳性重组菌株。将重组菌株进行摇瓶发酵120 h,酶活达0.15 U/mL。收集发酵液并细胞裂解后,用Ni-NTA螯合亲和层析的方法进行纯化,得到纯化的hPON1,SDS-PAGE结果显示表达产物的大小约37 ku,与预期的蛋白分子量相符。表达的重组hPON1的最适反应温度为45 ℃,最适pH为9.0。以上结果表明,本研究成功地表达并得到较纯的有活性的hPON1蛋白。     

DCE-01菌株果胶酯酶基因克隆与表达

从麻类脱胶高效菌株DCE-01中克隆果胶酯酶基因并进行原核表达.根据全基因组测序注释结果设计引物,PCR扩增果胶酯酶基因连接到pEASY-E1载体上,导入大肠杆菌进行诱导表达,采用水解圈法进行选择和定量分析.结果表明:克隆出全长1107bp的果胶酯酶基因(GenBank登录号:KC422449),编码368个氨基酸;该基因表达蛋白质序列的前26个氨基酸为信号肽,前导蛋白的分子量约为39.6ku,成熟蛋白为36.9 ku,pI为9.1;基因工程菌株以高度酯化橘子果胶为底物的发酵液粗酶活为1.5IU/mL,是原始菌株DCE-01的22.4倍.本研究成功发掘出果胶酯酶基因,其表达产物果胶酯酶能降解高甲氧基果胶,在低甲氧基果胶制备方面具有重要应用前景.     

乳酸菌发酵液中胞外多糖的超滤浓缩技术研究

采用了内压式中空纤维膜超滤装置对乳酸乳球菌乳亚种发酵液中胞外多糖进行超滤浓缩分离。研究结果表明:在操作压力0.08MPa,操作温度25℃的条件下,用分子量为50ku的膜超滤经离心除菌的发酵液,发酵液的体积浓缩了5倍多,而胞外多糖的含量从949.54mg/L上升到4790mg/L。     

枯草芽孢杆菌CF-3抑菌蛋白的分离与鉴定

本研究采用硫酸铵分级盐析、交联葡聚糖凝胶分子层析(Sephadex G-75)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等方法对生防菌枯草芽孢杆菌CF-3无菌发酵液对复端孢霉F中的主要抑菌蛋白进行了分离与鉴定。结果表明:CF-3无菌发酵液中抑菌蛋白的硫酸铵最佳沉淀饱和度为60%~70%,蛋白质沉淀量为149.03μg/mL,极显著高于其他浓度(p≤0.01);利用60%~70%饱和度的硫酸铵提取的粗蛋白质经Sephadex G-75凝胶柱层析后获得2个吸收峰,8管收集液,其中第2管峰收集液抑菌活性显著高于其他管(p≤0.05);将流分2收集液进一步分离纯化后,将抑菌效果最好的2.3号流分的两条蛋白条带割胶回收,利用生物质谱技术鉴定为γ-谷氨酰转肽酶和胞内丝氨酸蛋白酶,分子量分别约为42.5 ku和33.9 ku。以上结果可为该菌株及其抑菌蛋白的开发应用奠定基础。     

液体发酵茯苓胞外多糖的研究

以本实验室组织分离纯化的茯苓菌株Po为出发菌株,采用不同碳源、氮源、金属离子对Po胞外多糖液体发酵的培养基进行优化,并采用正交设计优化培齐基组成.实验表明茯苓胞外多糖发酵的最佳培养基是葡萄糖25g/L、酵母膏5g/L和蛋白胨5g/L,KH2PO4 1 g/L,MgSO4 0.5 g/L在最佳条件下,该菌株能积累胞外多糖3.55 g/L.     

嗜酸乳杆菌S-层蛋白对肠道细胞黏附及巨噬细胞增殖的影响

比较去除S-层蛋白前后嗜酸乳杆菌对肠道细胞黏附及菌体自我凝集率的变化,并探究S-层蛋白对巨噬细胞增殖及溶酶体分泌的影响。采用4M氯化锂提取嗜酸乳杆菌ATCC 4356的表层蛋白,经透析及微孔过滤等步骤得到S-层蛋白,SDS-PAGE确定其分子量。利用酶标仪测定嗜酸乳杆菌在37℃孵育过程中(0 h~5.5 h)自我凝集率的变化情况,光学显微镜观察去除S-层蛋白前后嗜酸乳杆菌对结肠癌细胞HT-29的黏附情况变化。将S-层蛋白与巨噬细胞RAW264.7孵育2 h后,MTS法测定细胞增殖情况,并采用溶酶体荧光探针研究溶酶体分泌量的变化。结果表明:所提蛋白为嗜酸乳杆菌S-层蛋白(分子量M≈46ku)。嗜酸乳杆菌自我凝集率随孵育时间的延长而呈现出上升趋势,去除S-层蛋白后,菌体自我凝集率降低,嗜酸乳杆菌对HT-29细胞的黏附量也明显减少,且S-层蛋白能促进巨噬细胞增殖及其溶酶体分泌。     

益生菌发酵葡萄汁饮料工艺研究

以巨峰葡萄为原料,进行益生菌发酵葡萄汁工艺研究。以嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）L2-16为发酵菌种,活细胞数和感官品质为评价指标,通过单因素试验及正交试验优化发酵工艺条件。结果表明,初始pH值、接种量、发酵温度和发酵时间对嗜酸乳杆菌活菌数和感官品质影响显著,益生菌发酵葡萄汁的最佳工艺条件为初始pH值4.5,接种量2.5%,发酵温度32 ℃,发酵时间26 h。在此优化条件下,发酵葡萄汁饮料活菌数对数值为8.87,感官评分为88.3分,酸度为90.1 °T,可溶性固形物含量17.2%。     

5 种乳酸菌对库车小白杏发酵液理化性质及感官评价的影响

用戊糖片球菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌共5?种乳酸菌发酵库车小白杏，通过比较发酵液在发酵过程中的菌浓度、pH值、总可溶性固形物（total soluble solids，TSS）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性等理化特性及发酵结束后的感官评价，筛选出一种或几种适合发酵库车小白杏发酵液的菌株。结果表明，发酵结束后，戊糖片球菌发酵库车小白杏发酵液的SOD活性达到252.63?U/g，活菌数达到8.07（lg（CFU/mL）），TSS含量降至17.1?°Brix，感官总体评价值最佳达到97%。植物乳杆菌发酵的库车小白杏发酵液的SOD活性达到275.87?U/g，感官总体评价几何平均（geometrical mean，GM）值达到88%。嗜酸乳杆菌发酵的库车小白杏发酵液速度最快，活菌数最终达到9.95（lg（CFU/mL）），TSS含量降至16.6?°Brix，但感官总体评价GM值仅为79%。综上所述，戊糖片球菌是最适合发酵库车小白杏的菌种，而植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的适合度仅次于戊糖片球菌。通过比较5?种乳酸菌发酵的库车小白杏发酵液的理化性质和感官评价，可以得出结论，戊糖片球菌最适合发酵库车小白杏。     

蓝莓汁乳酸菌的发酵特性

蓝莓汁中分别接种干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行发酵,比较蓝莓汁发酵过程中乳酸菌活菌数、p H值、总滴定酸、总糖、还原糖、总花色苷、总酚、抗氧化能力和色泽等变化。结果表明,蓝莓汁营养丰富,上述各种乳酸菌均能在蓝莓汁中正常生长,发酵24 h,活菌数达8.10 lg cfu/mL以上;此外,植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌产酸能力均强于其它两种乳酸菌,可滴定酸含量均超过10.29 g/L,而植物乳杆菌对蓝莓汁中糖的消耗能力最强,总糖的残留量为40.26%;在花色苷和总酚的保留率以及抗氧化能力等方面,植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌也要优于其它两种乳酸菌。植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌单独发酵和混合发酵时蓝莓汁营养品质的差异分析表明,单独发酵组与混合发酵组在抗氧化能力和总酚的保留上无明显差异,但混合发酵组在花色苷和色泽的保留方面明显优于单独发酵组。综上所述,蓝莓汁应以植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌混合发酵为宜。     

樱桃酒酿造用产香酵母的筛选及其特征香气成分分析

为提升杏酒品质,该研究以西南地区特色凯特杏为原料,以感官品评作为评价指标,在单因素试验的基础上,采用响应面法优化杏酒的发酵条件。结果表明,杏酒最佳发酵条件为采用D254酵母,发酵温度25 ℃、杏浆与水体积比4.4∶1、酵母接种量1.2 g/L、初始糖度21 °Bx、发酵时间7 d。在此优化条件下,酿造的杏酒呈金黄色、澄清透明,杏果香和醇香协调,酒体柔和,典型性强,并测得其酒精度为12.27%vol,还原糖含量为5.12 g/L,总酸含量为8.87 g/L,感官评分为85.45分。通过气相色谱-质谱仪（GC-MS）共检测出29种风味物质,主要为醇类和酯类等。     

乳酸菌发酵前后铁皮石斛汁中功能活性物质与风味成分的比较

为研究乳酸菌发酵对石斛汁中功能活性物质及风味成分的影响。以铁皮石斛汁为原料，采用嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，La）与副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei，Lp）混合液态发酵，分析石斛汁中多糖、乙酸乙酯萃取成分、挥发性成分、游离氨基酸及有机酸的变化。结果表明，铁皮石斛汁发酵后，多糖平均分子量由184.40 ku减小至91.27 ku，多糖含量极显著降低21.91%（P<0.01）；试验鉴定发酵前后乙酸乙酯萃取成分分别为20种和16种，相同成分11种，差异成分14种；挥发性成分由发酵前的21种增至发酵后的26种，发酵后酚类与醇类物质相对含量增多，花香香气物质相对含量增多；发酵后检测出15种游离氨基酸，游离氨基酸种类较发酵前增加6种，赋予发酵汁甜味和鲜味，除天冬氨酸外，其他种类游离氨基酸含量均极显著升高（P<0.01）；发酵前后分别含有3种和4种有机酸，乳酸仅在发酵后检出，其含量占比有机酸总含量的76.11%，赋予发酵汁柔润的口感。由此可见，La与Lp混合发酵可使铁皮石斛汁中产生丰富的活性物质与风味成分。     

利用絮凝及双水相萃取分离纯化发酵液中的R,R-2,3-丁二醇

针对Paenibacillus polymyxa ZJ-9一步法发酵菊芋菊粉粗提液制备R,R-2,3-丁二醇的发酵液特点,利用壳聚糖对该发酵液进行絮凝研究。结果表明,壳聚糖分子量、壳聚糖用量、助凝剂海藻酸钠用量、pH和搅拌时间分别为:43.5 kDa、0.75 g/L、0.125 g/L、5.0和15 min时,絮凝效果最佳,在此工艺条件下,发酵液中菌体和蛋白质的絮凝率分别高达89.46%和78.93%,而R,R-2,3-丁二醇保留率约为98.54%。利用双水相萃取技术对絮凝后的发酵液中R,R-2,3-丁二醇进行了分离,结果表明,异丙醇/硫酸铵双水相体系萃取效果最好,当异丙醇和硫酸铵的用量分别约为33%和30%(w/w)时,R,R-2,3-丁二醇在上相的分配系数和萃取率最高,分别约为7.96和89.40%,且异丙醇/硫酸铵双水相体系能够有效萃取分离絮凝后的发酵液中不同含量的R,R-2,3-丁二醇。絮凝和双水相萃取技术分离发酵液中R,R-2,3-丁二醇具有针对性强、效率高、成本低等优点,适用于工业化生产。     

人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的多拷贝重组表达、鉴定及抗氧化活性分析

胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2和pPIC9K-COL3-4,转化毕赤酵母GS115实现了人源Ⅲ型胶原蛋白的整合表达,获得了胶原蛋白单串联、胶原蛋白二串联和胶原蛋白二串联四拷贝的毕赤酵母工程菌株。对pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2重组菌株进行了摇瓶模拟高密度发酵,甲醇诱导浓度为0.5%,经SDS-PAGE和Western Blot检测,重组菌株成功表达了重组胶原蛋白,其中单串联蛋白表观分子量约为26.7 ku,双串联蛋白表观分子量约为52.3 ku。四拷贝重组菌株在0.5%甲醇诱导下的高密度摇瓶发酵产量最高,在最佳诱导时间为72 h时,蛋白产量达到约0.45 g/L。通过镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白,抗氧化活性实验表明,重组胶原蛋白DPPH自由基清除率达到51.49%、ABTS自由基清除率达到41.24%,证明具有抗氧化活性,为其在食品,保健品和医疗领域的应用提供理论依据。