牡蛎过敏原Crag 1的结构与功能

Crag 1是牡蛎中主要过敏原,属于一种原肌球蛋白。原肌球蛋白是存在于肌肉和非肌肉细胞中高度保守的、分子量大约为34~38 kDa的一种结合蛋白。目前已经明确Crag 1的一级结构是由284个氨基酸构成,二级结构以α-螺旋为主,软体类主要过敏原原肌球蛋白均没有复杂的三、四级空间结构。Crag 1的过敏原性不是来自构象、非连续性表位而是来自于线性、连续性表位。Crag 1在92~105区段(IQLLEEDMERSEER)中具有IgE抗原结合表位,其他的IgE抗原结合表位有待进一步试验确认。Crag 1作为一种原肌球蛋白,对肌肉有一定的调节作用。不同物种原肌球蛋白的序列同源性较高并且存在一定的交叉反应。综述介绍了Crag 1的基本结构性质与功能,系统地描述了Crag 1,讨论了现阶段研究牡蛎过敏的意义及存在的问题,为以后治疗软体动物、甲壳类动物食品的过敏性疾病,尤其是治疗牡蛎引起的过敏疾病,提供一定的参考依据。     

牡蛎主要过敏原原肌球蛋白的重组表达及鉴定

牡蛎的主要过敏原是Crag 1蛋白(属于一种原肌球蛋白),克隆牡蛎原肌球蛋白Crag 1基因,导入大肠杆菌(BL21)中,然后筛选重组菌株。通过SDS-PAGE探究了重组菌株中Crag 1蛋白的最佳诱导表达条件,15℃下诱导16h。然后通过Western印迹、SDS-PAGE、质谱(MALDI-TOF-MS)、圆二色(CD)光谱等方法从His-tag、相对分子量、肽段比对以及二级结构上综合鉴定了重组Crag 1蛋白的准确性。本实验成功重组表达并鉴定了牡蛎主要过敏原Crag 1蛋白,为接下来的牡蛎脱敏实验以及牡蛎过敏的临床诊断和治疗奠定了良好的生物学基础。     

牡蛎精氨酸激酶稳定性及同源性分析

目的鉴定从牡蛎中提取的天然蛋白精氨酸激酶(arginine kinase,AK),并了解其基本性质及同源性。方法利用硫酸铵盐析、阴离子交换从牡蛎中分离纯化出蛋白,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和圆二色(CD)光谱确定相对分子质量和二级结构,并研究其稳定性;用生物信息学软件对牡蛎AK和其他11种甲壳类、软体类动物过敏原的AK氨基酸序列进行比对,分析它们之间的同源性。结果分离纯化得到的相对分子量为40 kDa的天然蛋白为牡蛎AK,AK既不耐热也不耐强酸。牡蛎AK与软体类动物过敏原AK氨基酸序列的同源性较高,与甲壳类动物氨基酸序列的同源性在55%～60%之间。结论从牡蛎中提取得到天然AK,基本了解牡蛎AK的稳定性和同源性,并为牡蛎AK致敏性和致敏机制的全面研究打下基础。     

pH调节法提取牡蛎蛋白及氨基酸、蛋白组成分析

以牡蛎全脏器为原料,采用pH调节法(pH-shifting)分离提取牡蛎分离蛋白并对其氨基酸组成及蛋白组成进行分析。试验结果表明,牡蛎分离蛋白提取最佳碱溶条件为pH 12~13,最佳酸沉条件为pH 4.5~5.1。在最佳提取条件下获得的牡蛎分离蛋白得率为66.7%,蛋白纯度达92.5%(干基计)。牡蛎分离蛋白各种必需氨基酸均高于FAO/WHO推荐值,约占总氨基酸的42.44%,风味氨基酸和支链氨基酸含量也较高。SDS-PAGE电泳图谱显示牡蛎分离蛋白在200,97,44 ku处均出现比较明显的蛋白条带。本研究结果将为进一步开发利用牡蛎蛋白资源提供理论依据。     

鸡卵类黏蛋白结构与性质研究进展

鸡卵类黏蛋白是鸡蛋中最主要也是过敏原性最强的过敏原蛋白。本文总结该蛋白的结构,包括氨基酸序列、糖基组成、二硫键位置、二级结构以及组成该蛋白的3 个结构域,并描述其理化性质,最后着重分析讨论其过敏原性,特别是其分子结构中二硫键、糖基和结构域等因素与过敏原性之间的内在联系。     

柑橘PGIP的B细胞抗原表位分析和原核表达

柑橘是重要的经济园艺植物,但是部分人群在食用柑橘后会造成过敏现象,其中多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是柑橘中重要的过敏原。本文利用Jameson-Wolf法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Karplus-Schulz法对柑橘过敏原蛋白PGIP的抗原指数、亲水性、蛋白表面可及性及柔韧性进行分析,通过构建PET-28 a-PGIP载体转移到大肠杆菌(Escherichia coli)中进行原核表达。结果表明:当PGIP二级结构是β-转角和无规则卷曲,同时氨基酸序列的抗原指数0、柔韧性0、亲水性0和蛋白表面可及性1时的氨基酸时,过敏原蛋白PGIP的B细胞表位结合氨基酸的序列区域是在19~22、37~41、49~52、68~69、117~120、163~164、173~177、221~226、236~240。通过分析氨基酸的区域及原核表达,为寻找柑橘过敏原蛋白PGIP的B细胞抗原表位的最佳优势区域提供支持,同时也为消除柑橘过敏原蛋白PGIP对人体的影响的进一步研究提供理论基础。     

牡蛎肽特性及抗过敏和低致敏活性研究

在制备牡蛎肽的基础上,探讨其抗过敏性和低致敏性。结果表明,牡蛎肽氨基酸组成丰富,含有较高的人体必需氨基酸和支链氨基酸;牡蛎肽相对分子质量小于1000 u的水解物占比高达90.4267%,易于人体直接吸收。透明质酸酶体外抑制试验和RBL-2H3体外细胞模型显示牡蛎肽能显著抑制透明质酸酶的活性,对RBL-2H3细胞组胺的释放也具有较好的抑制作用;ELISA和等温滴定量热试验表明,牡蛎肽与过敏血清IgE的反应性与牡蛎蛋白相比明显降低(P0.05),牡蛎肽与致敏血清IgE的结合常数也小于牡蛎蛋白,说明牡蛎肽具有良好的抗过敏性和低致敏活性,为其作为新型配料应用于功能性运动饮料、保健食品奠定了基础。     

牡蛎蛋白饮料中潜在过敏原蛋白的原核表达及线性表位鉴定

目的:牡蛎存在致敏性是影响其作为饮料原料发展的主要原因,牡蛎中的肌浆钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)在细胞和肌肉功能中起着至关重要的作用,已被确定为牡蛎中的过敏原。为研究该类过敏原的具体致敏性原理,对其线性表位进行鉴定。方法:以太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的SCP氨基酸序列为基础,制备并鉴定了分子量为21 kDa的重组SCP(rSCP),并作为后续实验材料,建立了动物致敏模型进行实验。结果:rSCP与大鼠血清具有较强的IgE结合活性,过敏反应能引起大鼠脏器发生病变。最重要的是,五个表位肽首次通过间接竞争酶联免疫吸附实验(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)鉴定为线性免疫显性表位。结论:线性表位研究对于理解人类对牡蛎的超敏反应具有重要意义,可为判断牡蛎蛋白饮料的致敏性奠定理论基础,并有助于提供有效的预防措施和治疗方案,促进该类饮料产品的发展。     

三文鱼小清蛋白定向酶解模型及致敏活性分析

选用氨基酸序列明确的三文鱼蛋白Sal s 1为蛋白源,通过蛋白模拟软件建立蛋白酶解模型。结合过敏原致敏表位和数据库信息,筛选合适的酶解组合,并进行致敏活性检测验证。结果显示;碱性蛋白酶酶切位点多,显著改变了小清蛋白的二级和三级结构,过敏原性消除效果最为显著。通过碱性蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解,最大效度地消除过敏原表位及毒性肽段,与模型预测结果相近,可以消除三文鱼小清蛋白90%以上的免疫活性,取得良好脱敏效果,为建立低致敏三文鱼小清蛋白定向酶解制备技术奠定了良好的基础。     

中国对虾过敏原基因特征的生物信息学分析

为了研究过敏原基因的基本性质、探讨过敏的机理,对中国对虾过敏原基因的部分序列进行克隆、测序,并分析该基因的有效密码子,碱基组成、密码子的偏好性,以及过敏原蛋白的氨基酸组成等性质。结果表明：中国对虾过敏原的部分基因序列长为1034,共编码264 个氨基酸,密码子的偏好性强,不同海产动物过敏原基因的有效密码子及碱基含量有很大的相似性。从基因序列和氨基酸序列的角度看,中国对虾的过敏原蛋白与其他种类海产甲壳动物的过敏原蛋白具有很强的相似性,这可能是导致海产品过敏原蛋白活性交叉反应的重要原因之一。     

菲律宾蛤仔过敏原原肌球蛋白的鉴定与分子克隆

目的了解菲律宾蛤仔中过敏原的情况,对其主要过敏原进行鉴定和分子克隆。方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹验证原肌球蛋白,双向电泳对蛋白等电点进一步确定。利用差示扫描量热法对蛋白的热性能测定以及蛋白克隆和测序来分析原肌球蛋白。结果菲律宾蛤仔原肌球蛋白的分子量在37 k Da左右,等电点为5.1,热稳定性较强。原肌球蛋白的基因序列全长为855 bp,编码284个氨基酸,对序列进行同源对比,相似性较高。结论本实验证实了原肌球蛋白为菲律宾蛤仔的过敏原,为认识菲律宾蛤仔过敏原提供基础数据。     

华南地区近江牡蛎营养成分分析及评价

本文分析和评价了华南沿海10个地区近江牡蛎的营养成分,并讨论了内脏团对近江牡蛎营养成分的影响。结果显示:调查地区近江牡蛎的水分、粗蛋白、脂肪和灰分质量分数分别为84.90%、7.64%、0.75%和1.71%;10个地区近江牡蛎均检测出16种氨基酸,其中7种为必需氨基酸,总氨基酸含量为3.97~7.60 g/100 g,必需氨基酸占总氨基酸(EAA/TAA)的比率在33.86%~38.06%之间,蛋氨酸为第一限制氨基酸,风味氨基酸占氨基酸总量38.42%~43.25%;钙、铁、锌、硒等微量元素丰富。近江牡蛎去除内脏团后蛋白质含量较牡蛎整体蛋白质含量略高,脂肪含量略低;总氨基酸平均含量为5.83 g/100 g,略有升高,必需氨基酸占总氨基酸的35.59%,风味氨基酸占总氨基酸的41.16%,钙、铁、锌、硒微量元素含量与近江牡蛎整体含量相近,其中锌含量较牡蛎整体略高。因此,近江牡蛎是一种有较高营养价值的水产品,除去内脏团后的近江牡蛎营养价值略有升高,建议消费者除去内脏后食用,对保障消费者安全具有重要的意义。     

褐虾过敏原Cra c 8 蛋白的结构分析和同源建模

为了进一步认识褐虾中的一种过敏原--磷酸丙糖异构酶过敏原(Cra c 8)的结构与功能关系,理解食物过敏原之间产生交叉反应的分子基础,采用生物信息学方法分析Cra c 8蛋白的理化性质和各级结构,探讨其与食物中该蛋白质在分子水平上的异同。结果表明：褐虾Cra c 8蛋白是由249个氨基酸组成的酸性蛋白质,与螯虾、对虾、三文鱼、小麦、蟑螂中的磷酸丙糖异构酶蛋白具有较高的同源性,亲疏水性区域相似;二级结构预测结果显示其以α-螺旋和不规则折叠为主,均没有β-折叠及β-转角区域;利用同源建模的方式成功的构建褐虾Cra c 8蛋白的空间结构。     

小麦主要过敏原CM16线性B细胞表位的预测及初步鉴定

目的：探究小麦主要过敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16的线性B细胞表位。方法：通过提取小麦蛋白粗提物,进行体外模拟胃肠道消化,发现小麦过敏原中具有消化抗性的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16的片段;进一步通过生物信息学方法分析CM16的一级氨基酸序列、二级结构,并通过同源建模确定CM16的三级结构。结果：利用生物信息学法预测出CM16的4 条线性B细胞表位后,结合质谱得到的抗消化肽段信息进行比对分析,发现其中2 条肽段存在部分重合,也证明了生物信息学分析鉴定过敏原线性B细胞表位方法的可行性和应用性。结论：通过生物信息学预测小麦过敏原CM16线性B细胞表位有助于进一步认识小麦过敏原,对小麦过敏原的识别和检测具有重要的参考和借鉴作用。     

超高压处理对牡蛎超微结构、组分及蛋白质变性的影响

研究了超高压处理对牡蛎超微结构、组分及蛋白质变性的影响。研究结果表明,由于蛋白质发生了显著的变性,牡蛎闭壳肌表面的肌纤维结构逐渐消失,表面致密;超高压处理对于牡蛎成分也有一定的影响,主要表现在牡蛎组织中的某些盐溶性蛋白质和灰分在高压的作用下溶出;超高压还可提高牡蛎中蛋白质水解酶的活性,使得牡蛎蛋白质水解程度增加,牡蛎流失液中游离氨基酸的含量随着压力的升高而大幅增加;经过较高超高压(600 MPa)处理后,牡蛎中蛋白质发生了明显的变性。     

牛奶过敏原制备方法的研究和免疫活性鉴别

目的探索牛奶主要过敏原的制备工艺。方法采用等电点沉淀、凝胶层析和分子筛等技术纯化牛奶中主要过敏原组分;采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,采用双抗原夹心-ELISA鉴定免疫活性。结果成功获得牛奶中的四种主要过敏原组分:酪蛋白、β乳球蛋白、α乳白蛋白和分子量较高的P1组分,并经过免疫实验证实这四种组分均能与过敏血清产生反应,而其中β乳球蛋白和P1组分反应性较高。结论本研究探索出一种简单、实用的牛奶主要过敏原制备工艺,并证实牛奶中的β乳球蛋白和高分子量蛋白质为主要过敏原。     

牡蛎蛋白分离及其基本组成分析

根据蛋白的溶解特性对牡蛎蛋白进行分离,分析各蛋白组分的一般成分、氨基酸组成,进一步采用SDS-PAGE测定其分子质量分布。实验结果表明,牡蛎各分离蛋白组分占总蛋白含量分别为:非蛋白氮0.83%,水溶性蛋白37.79%,盐溶性蛋白31.10%,不溶性蛋白26.44%;牡蛎各蛋白氨基酸种类齐全,必需氨基酸比例适宜,必需氨基酸和呈味氨基酸含量高。SDS-PAGE电泳显示,未经巯基乙醇处理样品蛋白条带少于经巯基乙醇处理样品。经过β-巯基乙醇处理的样品电泳图中,水溶性蛋白的分布范围较广,在200-14 kDa之间;盐溶性蛋白的分子质量集中在200¹0 kDa,在200 kDa和45 kDa附近处有明显的条带,在97 kDa附近出现明显的副肌球蛋白条带;不溶性蛋白的分子质量分布在20010 kDa,在200 kDa和45 kDa附近处有明显的条带,在97 kDa附近出现明显的副肌球蛋白条带;不溶性蛋白的分子质量分布在200²9 kDa。未经β-巯基乙醇处理的样品电泳图,水溶性蛋白在116 kDa处有一条带,盐溶性蛋白在200 kDa和116 kDa处和不溶性蛋白36 kDa、29 kDa处存在蛋白条带。研究结果为进一步开发利用牡蛎蛋白资源提供理论基础数据。     

超声处理对三文鱼小清蛋白构象及致敏活性的影响

小清蛋白是三文鱼中的主要过敏原蛋白组分,试验采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、圆二色谱(CD)、ANS荧光探针及紫外可见(UV-Vis)光谱等方法,系统研究超声处理加工对三文鱼小清蛋白抗原性和结构的影响。结果表明,经超声处理后,其抗原性出现一定程度降低,且随着时间的增加其抗原性不断降低。CD色谱分析表明,经热处理后其二级结构变化不大;ANS荧光探针光谱和紫外光谱结果显示,超声处理均导致蛋白表面疏水性增加,氨基酸残基团暴露,蛋白结构改变。由此推断,三文鱼过敏原蛋白的构象改变导致了其抗原性的降低。     

花生主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的预测及鉴定

花生过敏由于其高致敏率和致敏严重性而引起了人们的广泛关注。Ara h 1是花生中的主要过敏原,属于Cupin超家族,通过抗原表位识别结合免疫球蛋白E引发花生过敏。本研究采用生物信息学分析花生主要过敏原Cupin超家族Ara h 1线性B细胞表位氨基酸组成,及其与Ara h 1二级、三级结构之间关系,通过质谱分析Ara h 1氨基酸序列中的抗消化肽段,并分析抗消化肽段与预测线性B细胞表位的关系。结果表明,Ara h 1的线性B细胞表位富含亲水性氨基酸和带电氨基酸;其二级结构没有明显的分布规律,具有一定的回转折叠结构;分析Ara h 1三级结构发现,表位主要位于单体之间的疏水相互作用区域,部分表位埋入三聚体构象内部;Ara h 1抗消化序列与表位之间存在部分重叠。综上,质谱检测体外模拟胃肠道消化肽段并结合表位生物信息学分析可以作为鉴定Cupin超家族线性B细胞表位的新方法。     

腰果过敏原Ana o 3蛋白的分离纯化及热稳定性研究

Ana o 3蛋白是腰果主要的过敏原之一。以生腰果为原料,通过粉碎脱脂、低盐提取粗蛋白、冷冻干燥、阴离子交换层析及超滤浓缩等过程分离得到目的蛋白,利用小分子蛋白电泳、液相色谱-串联质谱和免疫印迹技术进行鉴定;此外,采用紫外光谱及圆二色光谱分析腰果过敏原Ana o 3蛋白在160℃持续加热10、15、20、25、30min的结构变化,以评估分离纯化后腰果过敏原Ana o 3蛋白的稳定性。结果表明,成功建立了一种快速高效纯化腰果过敏原Ana o 3蛋白的方法,该方法获得的蛋白纯度高于95%。通过圆二色光谱发现腰果过敏原Ana o 3蛋白在160℃加热过程中α-螺旋构象逐步转变为β-折叠构象,β-转角含量变化较小,无规则卷曲含量稍有增加,表明该蛋白二级结构较为稳定;经紫外光谱发现加热后腰果过敏原Ana o 3蛋白的紫外特征吸收峰的吸光度升高,表明加热会使腰果过敏原Ana o 3蛋白变性,结构展开,更多的色氨酸和酪氨酸残基暴露,使得空间结构变得松散;经蛋白电泳和免疫印迹分析发现,热处理后腰果过敏原Ana o 3蛋白会发生降解,表位被破坏。希望研究可为高纯度腰果过敏原Ana o 3蛋白的纯化提供方案,为腰果过敏的研究提供基础,为腰果过敏原在热加工过程中的稳定性研究提供理论依据。