用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元预发酵与水解条件优化

采用RP-HPLC法检测薯蓣皂苷元,对薯蓣皂苷元提取过程中影响产率的多种因素,分预发酵、水解2部分分别用单因素和正交设计的方法进行优化.结果表明:40℃预发酵16 h,加6%浓H2SO4,料液比为1∶6,温度为121～126℃,水解5 h,产率高达3.62%,说明预发酵与水解条件优化可以提高盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C. H. Wright)生产薯蓣皂苷元的产率.     

药源植物盾叶薯蓣甾体皂苷及皂苷元的研究进展

盾叶薯蓣是重要的甾体激素类药源植物,其根茎中薯蓣皂苷元含量居薯蓣属植物之冠,为我国的特有种。为了寻找高含量的资源、筛选新的生理活性成分,多年来我国学者做了大量的研究工作。主要概括了盾叶薯蓣的资源分布、薯蓣皂苷元的提取工艺、化学成分、药理、含量测定等方面的研究。     

盾叶薯蓣内生真菌及其对宿主培养物生长和皂苷元生产的影响

从盾叶薯蓣根状茎中分离并鉴定了9株内生真菌,经悬浮培养14d,分别制备灭活菌丝和菌液浓缩物。其中,内生尖孢镰刀菌Dzf17能有效地提高盾叶薯蓣无菌苗和培养细胞薯蓣皂苷元的含量和产率,且灭活菌丝的诱导效果要强于菌液浓缩物。Dzf17灭活菌丝处理无菌苗,薯蓣皂苷元的产率为78.697mg/L,是对照(27.471mg/L)的2.865倍;用Dzf17菌液浓缩物处理无菌苗,皂苷元产率为41.822mg/L,是对照的1.522倍。Dzf17灭活菌丝处理培养细胞,薯蓣皂苷元的产率为1.391mg/L,是对照(0.691mg/L)的2.013倍;用Dzf17菌液浓缩物处理培养细胞,皂苷元产率为1.214mg/L,是对照的1.757倍。结果表明,在盾叶薯蓣无菌苗或细胞培养中添加一定量的内生真菌灭活菌丝或菌液浓缩物对于提高薯蓣皂苷元含量和产量将是一种有效的方法。     

从盾叶薯蓣组培苗中高压酸解制备薯蓣皂苷元

采用正交试验法对盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)组培苗中薯蓣皂苷元的高压酸解制备工艺进行了研究。以薯蓣皂苷元的含量作为评价指标,选用正交表L16(45),以样品用量、硫酸浓度、提取时间为因素,设计了3因素4水平的正交试验。结果表明:高压酸解提取薯蓣皂苷元的最佳工艺条件为:样品用量25 mg、硫酸浓度0.5 mol/L、提取时间2 h,在此条件下提取物中薯蓣皂苷元的平均含量为9.12 mg/g。     

不同居群盾叶薯蓣生长、叶形态及皂苷元含量的研究

对引自湖北武当山、湖南南部和西北部的12个居群盾叶薯蓣的生长状况及叶形、叶色、叶长、叶宽、叶基、叶张角等12个形态指标进行了观测和比较分析,并测定了各居群的叶和块茎中的皂苷元含量。结果表明：1）在置信水平λ=8.0340时,11个居群可划分成2大类型：①长叶型：主要形态特征为叶片长度大于宽度,中裂片相对较长;②宽叶型：主要形态特征为叶片宽度大于长度,中裂片相对较短;2）不同居群盾叶薯蓣花序数、叶片总数、开花时间、花期长短、茎干重、叶干重等存在显著的差异;3）不同居群皂苷元含量差异也较显著,居群块茎中薯蓣皂苷元含量最高达3.98%（3号）、最低（7号）仅0.33%,而居群叶中约莫皂苷元含量最高达4.27%(4号）、最低（2号）为0.98%。     

盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长及薯蓣皂苷元合成

研究了盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长、薯蓣皂苷元合成、蔗糖和磷酸盐的吸收利用以及酸性磷酸酶活性与薯蓣皂苷元合成的关系。结果表明,对数生长期细胞最大比生长速率μm为0.19 d-1;倍增时间为3.68 d;薯蓣皂苷元的形成与细胞的生长相关,培养6 d时薯蓣皂苷元质量分数和产量分别为0.20%和25.93 mg/L;蔗糖利用率达到95.65%,磷酸盐吸收率达到最大,为90.36%。盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中酸性磷酸酶活性动态变化规律与薯蓣皂苷元的动态合成规律基本一致。此外,研究还发现在相同供磷水平下,酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力呈正相关;而在不同供磷水平下,酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力没有相关性。     

盾叶薯蓣中薯蓣皂甙元提取新工艺的研究

为研究新工艺提取盾叶薯蓣薯蓣中薯蓣皂甙元的最佳实验指标,以薯蓣皂甙元得率为评价参数,采用6因素5水平的正交实验,用分光光度法对25种提取方法所得到的薯蓣皂甙元进行比较分析。结果表明,硫酸浓度对薯蓣皂甙元提取的影响最大,在实验室条件下,可采用20g样品加甲醇回流提取4h,回流速度为10min／次,用2．5mol／L的硫酸水解6h,120号溶剂汽油回流提取2h,回流速度为15min／次,能清洁快速提取盾叶薯蓣中的薯蓣皂甙元。     

盾叶薯蓣叶片形态多样性研究

盾叶薯蓣不同单株、同株不同部位叶片形态变异较大。利用数量分类和统计的方法,以11个居群的82个盾叶薯蓣单株为材料,对各居群叶片的7个形态特征值进行了测量,并以此计算出5个导出值。统计表明,各个特征值变异很大,相对标准误差均超过了0.2;UPGMA法将82份单株聚为3个大类群,第一组为长叶型,第二组为宽叶型,第三组为普通型,大部分叶片属于第三组。同株不同部位叶片形态差异比较结果表明,基部和中部叶片差异较大,而中部和上部叶片形状接近。同一单株不同部位叶斑纹和叶尖类型相同。     

与盾叶薯蓣细胞共生培养的内生真菌分离及其生物学特性

从盾叶薯蓣根状茎中分离到一株与盾叶薯蓣细胞共生培养的内生真菌（RE0105）。测定了该菌ITS1-5．8S rDNA—ITS2序列并构建了系统发育树,发现RE0105与Libertella属形成一个类群,具有较近亲缘关系。该真菌能产生与宿主植物相同的代谢产物——薯蓣皂苷元。对RE0105培养特性研究表明：富含有机营养的培养基有利于其生长;盾叶薯蓣细胞提取物可明显刺激其生长;20μmol／L生长素NAA和2,4-D能够促进RE0105的生长。200μmol／L细胞分裂素KT和BA对RE0105生长具有一定的促进作用,但与生长素相比,细胞分裂素对RE0105生长的刺激作用较小。蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖和NH4NO3是RE0105生长的良好C源和无机N源,但NH4Cl和（NH4）2SO4对该菌生长具有明显抑制作用,并且显著影响其形态特征。     

盾叶薯蓣营养器官薯蓣皂甙元含量的动态变化

利用高效液相色谱(HPLC)法对盾叶薯蓣营养器官特别造根状茎中薯蓣皂甙元含量的动态变化、品种之间的差异以及雌雄株之间的差异进行了研究。结果表明:实生苗根状茎中薯蓣皂甙元的含量,2年生高于1年生;根茎营养繁殖的2年生根状茎中皂甙元的含量高于1年生的含量;花叶品种的含量高于绿叶品种的含量;雄株的含量比雌株的含量高。在地上的缠绕茎和叶中没有检测到薯蓣皂甙元。由根茎繁殖的1年生根状茎前期皂甙元含量增加缓慢,后期增加较快;2年生根状茎盛花期含量最高,开花后期含量最低,随后含量逐渐增加。为此应在花叶品种中选择产量高、抗性强的品种作为栽培品种。合适的采挖期仍以地上缠绕茎枯萎期为宜。     

激素对盾叶薯蓣愈伤组织细胞生长和薯蓣皂甙元合成的调控

不同生长素对盾叶薯蓣 (DioscoreazingiberensisC .H .Wright)愈伤组织细胞生长量的影响差异是NAA >IAA >2 ,4 D ,而对薯蓣皂甙元合成的影响是 2 ,4 D >IAA >NAA。在有生长素存在的条件下 ,光照 2 4h ,另加 0 5mg LKT促进愈伤组织细胞的生长 ,而附加 0 5mg LBA促进薯蓣皂甙元的合成 ;相反 ,光照 12h ,另加 0 5mg LBA促进生长 ,附加 0 5mg LKT促进合成。愈伤组织生长越旺 ,薯蓣皂甙元积累越少。低浓度的生长素促进薯蓣皂甙元的合成。     

盾叶薯蓣类原球茎的离体诱导及快繁体系的建立

为解决盾叶薯蓣离体培养中试管苗移栽困难的难题,以盾叶薯蓣带腋芽的茎段为外植体,借助正交试验设计方法,离体诱导出类原球茎并建立了类原球茎微繁殖技术体系。结果表明:以带腋芽茎段为外植体诱导致密愈伤组织的适宜培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L+KT0.6mg/L+蔗糖3%;类原球茎诱导和增殖培养基为:MS+6-BA4.0mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖6%;类原球茎生根培养基:1/2MS+NAA 0.3mg/L+IAA 0.8mg/L+活性炭0.3%+蔗糖1.5%。经该途径诱导得到的生根类原球茎植株经炼苗后移栽的成活率可达到90%以上。     

盾叶薯蓣类原球茎发育的形态解剖学观察

为探讨盾叶薯蓣类原球茎形态建成的发育机理及植株移栽成活率高的原因,对盾叶薯蓣离体培养条件下形成类原球茎的形态发生过程进行形态学和石蜡切片组织学观察,并与不定芽的发生进行比较。结果表明：类原球茎是由愈伤组织中致密的卵圆形胚性细胞团分化出芽原基和鳞片叶,随后出现初生增厚分生组织和原形成层（维管束原）,其类原球茎形态建成。不定根的发生为内起源,其维管组织与类原球茎的维管组织相连接,故移栽成活率高。而不定芽为愈伤组织表面的胚性细胞分裂产生的分生细胞团分化而来,其不定根通常发生在茎基部形成的愈伤组织表面,故不易成活。     

内生贝莱斯芽胞杆菌生物拮抗活性的研究

目的 研究内生菌的生物拮抗活性。方法 基于植物贴片法、形态学与分子生物学特征等分离、鉴定内生菌;利用纸片扩散法检测分离株拮抗病原性细菌、植物部分内生菌及耐药性细菌的生物活性。结果 分离株HBB5的菌落呈乳白色、黏液性、皱褶状凸起,镜下见革兰阳性、单个或成双或短链状排列杆菌;序列分析显示,HBB5菌的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）同源性为100％,鉴定为B. velezensis HBB5。拮抗试验显示,B.velezensis HBB5抑制Staphylococcus aureus、Enterococcus faecalis、Escherichia coli、Salmonella typhi、Salmonella paratyphi A、Shigella dysenteriae、内生Penicillium HBF3及Klebsiella ornithinolytica B1645-1等菌株生长,其与内生B. subtilis SWB8无明显抑制现象。结论 首次从盾叶薯蓣植物中分离出Bacillus velezensis,其显示了广谱的抗病原细菌活性及一定的拮抗耐药菌的能力,可能参与宿主植物疾病的防御。     

优化黄姜中甾体皂甙元测定的研究

对传统的黄姜中甾体皂甙元的测定方法进行了改进。提取甾体皂甙元时采用微量样品以氯仿浸提代替传统的回 流抽提法,以Liebemann-Barcharad试剂显色,用分光光度法测定。测定结果准确,高效低成本且步骤简单,应用广泛。