Sp1促进A549细胞增殖、EMT、侵袭和血管生成的研究

研究Sp1转录调控原癌基因c-Met促进肺癌A549细胞增殖、EMT转化、侵袭和血管生成,抑制A549细胞凋亡的分子机制.首先采用双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀(ChIP)法检测Sp1与c-Met基因启动子结合情况.之后,在A549细胞中过表达和沉默表达Sp1,Western-blotting法和免疫荧光法研究Sp1转录调控c-Met,促进A549细胞增殖、EMT转化、血管生成,侵袭并抑制A549细胞凋亡的分子机制.与癌旁组织和正常组织相比,在肺癌组织样本中,Sp1和c-Met均呈现高表达;Sp1能够与c-Met基因启动子结合;Sp1转录调控c-Met通过激活c-Met-ERK通路,促进A549细胞增殖、抑制A549细胞凋亡;Sp1转录调控c-Met亦能促进A549细胞EMT转化,侵袭和血管生成. Sp1转录调控c-Met能够促进A549细胞增殖、EMT转化,侵袭和血管形成,抑制A549细胞凋亡.在肺癌发生发展进程中,Sp1转录调控c-Met发挥重要作用.     

NOTCH1靶基因的筛选

NOTCH1信号通路是影响机体发育的重要通路,而研究NOTCH1的靶基因及其功能对阐明该通路的分子机制非常有意义。NOTCH1蛋白的入核片段ICN1,通过招募共转录因子CSL和MAML1形成转录复合物,启动靶基因的表达。通过生物信息学分析预测了21个潜在的NOTCH1靶基因。半定量PCR、定量PCR和蛋白表达分析的结果表明SEPT4是NOTCH1的一个新的靶基因。     

干扰MHR1对嗜热毁丝霉纤维素酶活性的影响

利用RNA-Seq技术,筛选到潜在的负调控因子MHR1(fungal_TF_MHR1).为研究MHR1与纤维素酶基因表达之间的关联,设计基因mhr1的RNA干扰序列,并使用丙酮酸脱羧酶强启动子pdc成功构建mhr1基因的RNA干扰表达载体,经原生质体转化,获得一株干扰效率较高的阳性转化子MtR5.通过RT-q PCR、酶活测定和胞外蛋白浓度测定等分析发现,在诱导和非诱导培养条件下,转化子MtR5的胞外蛋白浓度、纤维素酶活性以及主要纤维素酶基因的表达量均高于野生型的.干扰转录因子MHR1可增加纤维素酶基因的表达量,研究表明,MHR1是一种与纤维素酶基因表达调控相关的转录因子.     

小鼠sox2基因的克隆及其原核表达载体构建

TAT穿膜肽能携带大分子物质进入细胞。NLS核定位信号肽是能帮助亲核蛋白进入细胞核的短肽。SoxB1家族的SOX2是维持ES细胞全能性的重要转录因子。通过RT-PCR方法从小鼠胚胎干细胞中克隆得到小鼠sox2基因,将其与穿膜肽基因tat和核定位信号基因nls融合,利用原核表达载体进行融合蛋白表达,并将表达的蛋白纯化、复性得到复性蛋白,为今后对SOX2蛋白的功能及生物学活性展开研究奠定了基础。     

利用环介导等温扩增技术针对DeoR家族转录调控因子基因进行表皮葡萄球菌快速鉴定

表皮葡萄球菌是一种重要的机会致病性微生物,是院内交叉感染的一个重要原因.开发快速有效的检测技术对其防治具有重要意义.利用生物信息学方法进行分析,发现DeoR家族转录调控因子基因可用于表皮葡萄球菌鉴定.针对此基因设计引物,采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)进行检测,在65℃条件下反应进行60 min后,电泳检测可见明显的阶梯状条带.比较了3株表皮葡萄球菌临床分离株和8株其他细菌(金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、弗劳氏枸橼酸杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、屎肠球菌和化脓性链球菌),结果显示该方法具有良好的特异性.构建DeoR家族转录调控因子基因质粒载体后考察了检测的灵敏度,结果显示其最低检测限为105拷贝/反应.由此针对DeoR家族转录调控因子基因建立的LAMP检测方法可快速、简便、特异以及敏感的鉴定表皮葡萄球菌.     

乳腺癌中SRA1基因表达调控的生物信息学分析

分析类固醇受体RNA激活物(steroid receptor RNA activator,SRA1)以长链非编码RNA形式(lncRNA SRA1)和蛋白质形式(SRA1蛋白)在乳腺癌中的分子调控网络。运用RegRNA、Targetscan、MicroCosm Targets、PicTar软件和HMDD、DAVID在线数据库,预测lncRNA SRA1与microRNA及下游靶基因间的多种调控途径,对靶基因进行功能富集分析,绘制lncRNA SRA1的核心调控网络图。同时运用TCGA数据库、string软件预测分析与SRA1蛋白相互作用的蛋白质。发现lncRNA SRA1上存在hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7g、hsa-let-7i、has-miR-92、has-miR-103、has-miR-194、has-miR-874、has-miR-141、has-miR-146a、has-miR-661这11个与乳腺癌相关microRNA的可能结合位点,从而调节下游230个靶基因,构建了lncRNA SRA1-miRNAs-mRNAs调控网络,提示lncRNA SRA1可能参与基因转录调控、生物合成、MAPK、癌症相关通路、紧密连接等信号通路。并且发现SRA1蛋白和DDX17、ESR1、NCOA2、NCOA1、NRIP1等多种蛋白存在相互作用。对SRA1基因调控网络的生物信息学分析有助于理解其在乳腺癌发生发展过程中的分子机制。     

亲和沉降及质谱法分离和鉴定与EGFR 3'UTR结合的蛋白质

随着后基因组学研究的逐步深入,非编码RNA成为生物学研究的热点之一,其中对mRNA非翻译区的功能研究也逐渐广泛。mRNA非翻译区(UTR)的调控序列与一些蛋白质特异结合,对其自身mRNA命运进行调控。表皮生长因子受体(EGFR)是细胞信号转导的关键因子,其特异酪氨酸残基发生磷酸化,可招募诸如Shc、Grb2、磷脂酶Cγ和Src等信号蛋白,进而激活下游信号通路,研究证实EGFR与一些癌症的发生相关,因此探讨EGFR非翻译区对其mRNA的调控机制就显得尤为重要。运用亲和沉降及质谱,从HeLa细胞中分离到3种蛋白质与EGFR 3'UTR相结合:Ilf3、hnRNP A1和hnRNP A2/B1。这些蛋白质均为RNA结合蛋白并参与mRNA代谢。这为研究EGFR 3'UTR的调控机制提供了依据。     

携带oct4、klf4s、ox2、nanog4种转录因子的腺病毒载体的构建

构建并鉴定携带人oct4、klf4、sox2、nanog4个基因的腺病毒载体,重组出能同时表达这4种转录因子的腺病毒,为进一步诱导多能干细胞的研究提供新方法。使用口蹄疫病毒2A序列将人的oct4、klf4、sox2、nanog4个基因顺序连接,定向克隆至腺病毒载体pDC328上,并在nanog下游插入红色荧光蛋白dsRed2作为报告基因。利用酶切及PCR方法鉴定病毒载体的正确性;荧光显微镜下观察病毒感染HEK 293细胞24 h后红色荧光的表达,检测病毒功能;实时定量PCR检测细胞内4种基因的表达情况。结果表明,酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组后病毒PCR显示病毒携带oct4、klf4、sox2、nanog基因;荧光显微镜下观测到红色荧光的表达,实时定量PCR检测到细胞内4种基因的表达。本研究成功构建的腺病毒载体,能够介导以上4种转录因子在细胞内的同时表达,为进一步诱导多能干细胞的提供新方法。     

携带ocf 4、klf4、sox 2、,nanog 4种转录因子的腺病毒载体的构建

构建并鉴定携带人oct4、klf4、sox2、nanog 4个基因的腺病毒栽体,重组出能同时表达这4种转录因子的腺病毒.为进一步诱导多能干细胞的研究提供新方法.使用口蹄疫病毒2A序列将人的oct4、、sox2、nanog 4个基因顺序连接,定向克隆至腺病毒载体pDC328上,并在nanog下游插入红色荧光蛋白dsRed2作为报告基因.利用酶切及PCR方法鉴定病毒载体的正确性;荧光显微镜下观察病毒感染HEK 293细胞24 h后红色荧光的表达,检测病毒功能;实时定量PCR检测细胞内4种基因的表达情况.结果表明,酶切后DNA电泳鉴定证实栽体构建成功,重组后病毒PCR显示病毒携带oct4、klf4、sox2、nanog 基因;荧光显微镜下观测到红色荧光的表达,实时定量PCR检测到细胞内4种基因的表达.本研究成功构建的腺病毒载体,能够介导以上4种转录因子在细胞内的同时表达,为进一步诱导多能干细胞的提供新方法.     

H5N1禽流感病毒蛋白对1F1TM基因家族转录的影响

干扰素诱导的跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane protein,简称IFITM)通过抑制病毒进入细胞来保护细胞,使其免受多种病毒的感染。为了鉴定H5N1病毒本身和结构蛋白是否作为IFITM基因的新调节因子,通过试验探讨了H5N1病毒和结构蛋白对IFITM基因家族转录的影响。结果显示,H5N1病毒的NS1、M1、NP和PB2蛋白在A549细胞中增加了IFITM1、IFITM2和IFITM3表达,对HEK293T细胞没有影响,在HEK293T细胞和A549细胞上,没有发现H5N1病毒的HA和NA蛋白影响IFITM基因家族表达。即在H5N1禽流感病毒感染期间,NS1、M1、NP和PB2蛋白的过表达可以直接刺激IFITM1、IFITM2和IFITM3的上调,而呼吸系统的上皮细胞可能首先被影响,特别地,NP和NS1显示对IFITM基因家族的表达显示更显著的作用。