多重荧光PCR快速检测食源性致病菌的研究进展

食源性疾病多由食源性致病菌引发,威胁个人健康及全球食品安全,因此寻找有效、可靠的食源性致病菌高通量检测方法对于确保食品安全具有重要意义。鉴于传统检测技术耗时长、效率低等问题,PCR等分子生物学技术应用于食用致病菌检测领域越来越广泛,本文在普及食用性致病菌知识的基础上,着重对多重荧光PCR技术原理及在食用性致病菌检测的应用进展进行综述,以期为控制由食用性致病菌引发的食品安全隐患提供理论参考。     

食源性致病菌多重PCR快速检测研究进展

食品安全问题现在备受关注,食品中致病菌的污染造成的食物中毒事件时常发生,传统的食源性致病菌检测方法操作繁琐,耗时长,未能及时检验出食品中的致病菌,这些缺点限制了此方法的广泛应用。聚合酶链式反应(PCR)满足了快速检测致病菌的要求。主要介绍多重PCR快速检测食源性致病菌的原理、特点、检测体系的组成及其应用。多重PCR具有特异性强、灵敏度高、操作简便、可同时检测多种致病菌的优点,同时多重PCR技术可结合荧光定量PCR、基因芯片技术等建立一个更加完善的体系。     

食源性致病菌多重PCR快速检测研究进展

食品安全问题现在备受关注,食品中致病菌的污染造成的食物中毒事件时常发生,传统的食源性致病菌检测方法操作繁琐,耗时长,未能及时检验出食品中的致病菌,这些缺点限制了此方法的广泛应用。聚合酶链式反应（PCR）满足了快速检测致病菌的要求。本文主要介绍了多重PCR快速检测食源性致病菌的原理、特点、检测体系的组成及其应用。多重PCR具有特异性强、灵敏度高、操作简便、可同时检测多种致病菌的优点,同时多重PCR技术可结合荧光定量PCR、基因芯片技术等建立一个更加完善的体系。     

多重PCR检测4种常见食源性致病菌

目的 建立一种多重聚合酶链式反应法(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)快速检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌的分析方法。方法 选取金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌SipB基因、志贺氏菌ipaH基因、单增李斯特菌inlA基因作为目标基因, 设计4对PCR引物, 建立并优化多重PCR反应体系, 评价该体系的特异性和灵敏度, 并对人工污染的熟肉样品进行检测。结果 构建的多重PCR方法特异性强、灵敏度高, 人工污染熟肉匀浆中4种致病菌的检出限为103 CFU/mL。结论 构建的多重PCR检测方法能够快速、准确、高效地检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌, 为食源性疾病菌的快速检测提供参考依据。     

多重PCR技术在食源性致病菌检测中应用的研究进展

食源性致病菌的多重PCR检测技术是指能够同时扩增得到同种或多种致病菌的不同基因片段的技术。因该技术特异、灵敏且分析效率高,现已被广泛应用于食源性致病菌的检测工作中。本文介绍了多重PCR在食源性致病菌检测中应用的研究近况,并对影响因素及存在的问题进行了阐述。      

食源性致病菌多重PCR检测技术建立及其应用

针对6种食源性致病菌特异性基因(金黄色葡萄球菌nuc基因、副溶血性弧菌tdh基因、单核细胞增生李斯特菌hly基因、阪崎克罗诺杆菌ompA基因、鼠伤寒沙门氏菌invA基因和大肠杆菌O157:H7 rfbE基因)建立了多重PCR检测技术,分析了其特异性和敏感性,并评估了其在人工染菌牛奶中的应用可行性.结果表明:该检测技术可...     

十种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法

为建立能够同时检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌属、克罗诺杆菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌等10种食源性致病菌的多重PCR方法,通过特异性引物的设计、引物特异性验证、引物灵敏度验证和多重PCR检测体系主要反应条件优化,建立多重PCR检测体系,并对其特异性、灵敏度以及人工感染样品应用进行评价。结果表明,建立的多重PCR检测体系可以扩增出10种食源性致病菌的特异目标条带,无非特异扩增。测序结果与目的基因序列进行比对,其序列同源性高达98%,体系灵敏度可达10^-1 ng/μL。人工污染样品应用结果表明,采用多重PCR方法简单快速,仅需简单增菌,检出限可达10 CFU/mL,整个检测时间在48 h以内。建立的多重PCR检测体系特异性强、灵敏度较高,与检验机构实际检测工作联系紧密,具有推广应用价值。     

多重PCR法检测鲜切哈密瓜中3种食源性致病菌

建立可同时检测鲜切哈密瓜中的单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。根据单增李斯特菌inl A基因、鼠伤寒沙门氏菌inv A基因、大肠杆菌O157:H7的wzy基因设计3对特异性引物。对多重PCR反应体系中的引物浓度、退火温度、Mg2+浓度、d NTP浓度进行了优化,并确定适宜的多重PCR反应体系及反应条件。结果表明:25μL反应体系,10×PCR buffer为2.5μL,Mg Cl2(25 mmol/L)为3.5μL,d NTPs(2.5 mmol/L)为2μL,inl A基因上下游引物(5μmol/L)为1μL,inv A基因上下游引物(5μmol/L)为1μL,wzy基因上下游引物(5μmol/L)为2μL,单增李斯特菌DNA模板为1μL,鼠伤寒沙门氏菌DNA模板为1μL,大肠杆菌O157:H7 DNA模板为1μL,ex Taq DNA聚合酶(5 U/L)为0.3μL,加dd H2O补足25μL。反应条件为95℃预变性3 min;94℃变性30 s,53.9℃退火30 s,72℃延伸30 s,32个循环;72℃延伸10 min。鲜切哈密瓜中人工接种的目标菌的灵敏度为单增李斯特菌2.7×104 CFU/g,大肠杆菌O157:H7 3.3×104 CFU/g以及鼠伤寒沙门氏菌3.8×104 CFU/g。该技术可为快速检测鲜切哈密瓜中病原菌污染度及其控制提供参考依据。     

食源性致病菌通用型多重荧光PCR快速检测体系的建立

以两种食源性致病菌(沙门氏菌、单增李斯特菌)为模板,对通用型多重荧光PCR快速检测体系进行了研究。建立的通用型多重荧光PCR反应体系为:25μL反应液中,Tris-HCl为50mmol/L、pH值为8.8、KCl15mmol/L、(NH4)2SO4为8mmol/L、Mg2+为3mmol/L、dNTP为1.0mmol/L、引物和探针的终浓度分别为1μmol/L和0.5μmol/L、加入0.5μLDMSO,2.5U/份的Taq酶与等量的Taq酶抗体。     

多重PCR检测食源性致病菌的研究

建立多重PCR方法来同时检测和鉴定食品中单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和肠出血性大肠杆菌三种致病菌。试验以单增李斯特菌蛋白转录调控基因(hlyA)、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)和肠出血性大肠杆菌O157︰H7的O157抗原特异基因(rfbE)为靶基因设计引物,并对其反应体系进行优化,确定其灵敏度及检出限。多重PCR反应的灵敏度为102cfu/mL,检出限为103cfu/mL。该研究建立的多重PCR检测方法简单、快速、灵敏度高具有很好的应用前景。     

应用DPO技术检测食源性致病菌的多重PCR的研究

DPO是经特殊设计的特异性引物,本研究根据单增李斯特菌的prfA gene、O157的rfb Egene和副溶血弧菌的tlgene和志贺氏菌的ipaH gene设计四对DPO引物,采用多重PCR的方法,建立了检测单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7、副溶血弧菌和志贺氏菌的快速检测体系。实验结果表明:该体系特异性强,操作简单,为食源性致病菌的检测提供了新型的有效手段。      

应用DPO技术检测食源性致病菌的多重PCR的研究

DPO是经特殊设计的特异性引物,本研究根据单增李斯特菌的prfA gene、O157的rfb Egene和副溶血弧菌的tlgene和志贺氏菌的ipaH gene设计四对DPO引物,采用多重PCR的方法,建立了检测单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7、副溶血弧菌和志贺氏菌的快速检测体系。实验结果表明:该体系特异性强,操作简单,为食源性致病菌的检测提供了新型的有效手段。     

多重实时荧光定量PCR同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌

目的 建立一种基于TaqMan探针的多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR, multiplex qPCR)同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌的方法。方法 针对金黄色葡萄球菌nuc基因、痢疾志贺菌rfc基因、沙门氏菌invA基因、单增李斯特氏菌hly基因, 设计4对引物和探针, 优化反应体系, 建立稳定的多重qPCR反应体系。通过阳性菌株污染的方法验证体系的特异性, 并确定了冷冻蔬菜样品在细菌水平的检出限。结果 各对引物和探针对目标菌有较强的特异性, 对其他非目标菌进行检测均未检出, 人工污染冷冻蔬菜中志贺菌的检出限为102 CFU/g, 沙门氏菌和单增李斯特氏菌的检出限均为103 CFU/g, 金黄色葡萄球菌的检出限为104 CFU/g。结论 本研究可以实现冷冻蔬菜样品中4种致病菌qPCR高效检测。     

食源性致病菌多重实时荧光PCR检测扩增内标的构建及评价

多重实时荧光PCR在食源性致病菌检测中具有重要的作用,扩增内标(IAC)可用来指示其检测过程中可能出现的假阴性检测结果。采用来源于人类腺病毒基因的一段序列设计IAC,并对其检测特异性、扩增效率以及与目的致病菌基因组DNA的抗干扰扩增能力进行了评估。结果表明,本IAC引物在供试菌株中均没有非特异性扩增结果,扩增效率达99.44%,而且对供试沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌O157:H7(Escherichiacoli O157:H7)以及单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多重实时荧光PCR扩增没有任何干扰,在食源性致病菌多重检测技术的建立中具有广泛的应用前景。     

多重聚合酶链式反应技术检测罗非鱼5种常见食源性致病菌

目的 建立一种可同时检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门菌(Salmonella) 5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法 根据5种致病菌特异性基因片段设计并合成引物,优化多重PCR体系条件,并对多重PCR体系的特异性、灵敏度以及人工模拟样品进行检测。结果 建立的多重PCR方法可同时扩增5种目的菌株的特异性条带,且不与非靶标细菌发生交叉反应。敏感性实验结果显示,该方法对无乳链球菌、嗜水气单胞菌、沙门菌、霍乱弧菌、大肠杆菌纯培养物基因组DNA的检出限均为0.4 ng/μL。人工模拟样品检测结果显示,该方法可以快速且准确地检测上述5种食源性致病菌,且检出限可达到2×10¹ CFU/g。结论 本研究建立了一种可同时检测无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重PCR检测...     

多重实时荧光串联PCR技术高通量检测生蚝中9种致病菌

大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、单增李斯特菌和创伤弧菌是贝类食品中常见的食源性致病菌。该文通过设计特异性引物,优化反应参数以建立多重实时荧光串联PCR(multiplexed tandem PCR,MT-PCR)方法,进一步评估方法的特异性和灵敏度,并用于检测生蚝样品。优化后的MT-PCR方法与常规qPCR具有相同定量能力,可同时检测上述9种致病菌。在对混合菌液的检测中,MT-PCR方法的检测灵敏度最低可达10² CFU/mL,且此法对其中6种致病菌的检测灵敏度高于qPCR。应用该技术检测人工染菌的生蚝样品,检测灵敏度为10²～10³CFU/g。该研究建立的MT-PCR方法可实现高通量、快速准确地检测生蚝中这9种常见的食源性致病菌,对保障食品安全和评估食源性致病菌污染风险具有重要意义。     

3种致病菌多重PCR检测体系的建立及应用

金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogen,LM)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus,BC)是食品中重要的致病菌,建立其多重PCR的快速检测体系,对开发食源性致病微生物快速检测试剂盒具有重要意义。根据SA的nuc基因、LM的hly基因和BC的hemolysin基因,设计合成3对特异性引物,然后进行单基因PCR反应特异性验证。在此基础上建立了3种致病菌的多重PCR检测体系,并应用于食品检测中,同时以国标法进行对比验证。结果表明,建立的多重PCR检测方法简单、快速、灵敏度高,检测灵敏度可达到1 cfu/mL,整个检测时间在16 h以内,具有较大的应用价值,可广泛应用于食品卫生检测以及临床检验等领域。     

低温肉制品中3种食源性致病菌多重聚合酶链式反应快速检测方法的建立

针对低温肉制品中较易污染的沙门氏菌(Salmonella spp.)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等有害微生物,利用多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,m-PCR)的方法,对3种菌同时快速检测,从而达到节省时间,提高效率的目的。使用沙门氏菌的inv A基因、金黄色葡萄球菌的Prf A基因和单增李斯特菌nuc基因设计3对特异性引物,在确定特异性引物的基础上,将3种菌进行培养增菌后接种于低温肉制品中,过夜富集后收集并进行灵敏度检测,优化多重PCR反应体系并应用于实际样品的检测。结果表明:多重PCR方法在同时检测这3种有害微生物时,m-PCR最佳反应条件如下:25 μL反应体系、10×PCR缓冲液2.5 μL、2.5 mmol/L d NTPs 2.0 μL、2.5 U/μL的DNA聚合酶0.5 μL及上、下游引物各0.5 μL、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的模板1.0 μL、沙门氏菌的模板2.0 μL,加dd H_2O补足至25 μL,最佳退火温度为64℃。多重PCR快速检测方法适用于低温肉制品中沙门氏菌等3种食源性致病菌的检测,具有快速、灵敏、特异、简便等特点。     

FTA滤膜与多重PCR结合检测肉中3种食源性致病菌

采用FTA滤膜从肉中直接提取模板DNA,根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、福氏志贺氏菌的ipaH基因设计3对特异性引物,进行多重PCR检测.结果表明,3对引物能特异性扩增出210、280、393bp大小的目的条带;在不增菌的情况下,多重PCR同时检测肉中3种致病菌的灵敏度均为102 cfu/g,检测时间6 h.该检测方法准确、快速、高效,为同时检测肉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、福氏志贺氏菌奠定了基础.     

干燥型荧光PCR试剂盒检测食源性致病菌研究

目的研究干燥型荧光PCR试剂盒检测副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌3种食源性致病菌的灵敏度、特异性和检测人工污染样品情况。方法目标菌和非目标菌接种至血平板, 36℃培养过夜,目标菌比浊至0.5 McF(麦氏单位), 10倍连续稀释后提取DNA,进行灵敏度研究;非目标菌直接提取DNA后检测,进行特异性研究;用高、中、低3个浓度目标菌液人工污染食品样品,按国标方法培养后用干燥型荧光PCR试剂盒检测。结果副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的最低检测浓度分别为140、380和7900 CFU/mL。3种目标菌人工污染食品样品的最低检测浓度分别为1.2 CFU/25 g、5.1CFU/25 g、10 CFU/25 g。每种试剂盒仅对目标菌株的检测结果呈阳性,非目标菌株均呈阴性。结论新型干燥型荧光PCR检测试剂盒具有较好的灵敏度和良好的特异性,适用于食品中副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的检测。