鹅源新城疫病毒F基因的克隆及其序列分析

鹅新城疫是近年来我国新发现的能感染多种禽类的传染病，国内许多学者在该病的发生、发展规律以及分子病毒学等领域有了较多的研究，现已确定该病毒是禽副粘病毒Ⅰ型即新城疫病毒的一个变种。本实验选择最近分离的2株鹅源新城疫病毒，采用已经发表的鸡新城疫病毒序列设计引物，应用RT—PCR技术扩增鹅源新城疫病毒的F基因，并将其克隆至载体上，然后进行了核苷酸序列测定、进行了系统的分析，并根据遗传距离的远近确定了鹅源新城疫病毒在NDV系统发育进化树中的地位。     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因和HN基因序列分析

从山东潍坊某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒(暂命名:ShD-5-04),其生物学特性表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。通过RT-PCR特异性地扩增出F和HN基因序列,并对其进行核苷酸序列测定和分析,结果表明ShD-5-04株的F和HN基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在88.6%～90.9%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株(ShD-5-04)为新城疫强毒株。     

新城疫病毒Lasota株F基因的克隆和序列分析

本试验采用RT-PCR方法对NDV Lasota株的全长F基因进行了扩增与克隆，并对其进行测序。扩出的F基因核苷酸长度为1664bp，单一的开放阅读框编码553个氨基酸的长肽，序列中有6个糖基化位点，13个半胱氨酸残基，包括完整的F1片段和完整的F2片段。裂解位点区(112-117aa)氨基酸序列为Gly-Arg-Gin-Gly-Arg-Leu，与所有弱毒株在这一区域的序列(Gy-Arg／Lys-Gin-Gly／Ser-Arg-Leu)相符。同源性分析表明，Lasota株F基因与已发表的其它NDVF基因相比，核苷酸序列同源性在88％-99％之间，推导的氨基酸序列同源性在90％～99％之间。     

番鸭源新城疫病毒F蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对番鸭源新城疫病毒FP1/02株的F蛋白基因进行分段扩增、定向克隆到pMD 18-T Simple Vector质粒载体，然后制定其核苷酸序列，拼接出F基因全序列．并推导出其相应的氨基酸序列。FP1／02株的F蛋白基因全长1690bp．编码553个氨基酸，其裂解位点的氨基酸序列为^112R-R-Q-K-R-F^112．具有强毒蛛特有的氨基酸序列结构特征。核苷酸序列分析结果表明，FP1／02株与其他不同源新城疫病毒毒株之间的核苷酸序列同源性为87.2%～93.3%.     

新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析

本试验首先以ＮＤＶＦ４８Ｅ９株的基因组ＲＮＡ为模板,逆转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第一链,再通过ＰＣＲ技术扩增Ｆ基因的ｃＤＮＡ,然后将其克隆到质粒ｐＵＣ１９中,经分子量比较、酶切分析、ＰＣＲ等方法证明,我们已经获得了ＮＤＶＦ４８Ｅ９株Ｆ基因的阳性克隆。经初步序列分析,ＦＡ段核苷酸序列与参考株（Ｄ２６／７６）序列同源性为８９％,ＦＢ段同源性为９１％。二者的氨基酸序列表明,Ｆ４８Ｅ９株Ｆ蛋白裂解位点与其它强毒株裂解位点氨基酸组成相同,即１１２ＲＲＱＲＲ１１６Ｆ１１７。这两段序列中包含的三个Ｃｙｓ残基和三个潜在的糖基化位点都相当保守。     

2018〜2019年我国部分地区新城疫病毒的F基因序列分析

本研究自2018-2019年从疑似感染新城疫的家禽病料分离鉴定出13株新城疫病毒(Newcastle disease viruses,NDV),采用RT-PCR方法对这13株NDV分离株的F基因进行扩增,产物经TA克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株进行遗传进化分析。结果显示,其中的7株属于基因Ⅱ型,5株属于基因VI型,1株属于ClassⅠ亚型。F基因相似性分析结果显示,7株基因Ⅱ型毒株与疫苗株La Sota.Bl sClone 30的核昔酸相似性在9&1%-100%之间,氨基酸的相似性在97.6%~100%之间。5株基因VI型分离株与Ⅱ、Ⅶ型疫苗株及VIb亚型代表株之间的核昔酸相似性在79.7%-98.4%之间,氨基酸的相似性在76.6%-97.6%之间。1株基因Ⅰ型的分离株与Ⅱ,Ⅶ型疫苗株及Class Ⅰ代表毒株的核昔酸相似性在52.1%-97.3%之间,氨基酸的相似性在68.5%-96.8%之间,表明当前部分地区的NDV分离株与传统疫苗株之间存在较明显的遗传特征差异。     

新城疫病毒长春株F基因和HN基因的序列分析

从长春地区分离到一株新城疫病毒,经过对其进行生物学研究表明该毒株具有新城疫病毒弱毒株的一些特性,本试验通过ＲＴ－ＰＣＲ方法测定出该毒株Ｆ基因的核苷酸序列为１７５８ｂｐ,编码有５３３个氨基酸残基;ＨＮ基因核苷酸序列为１７３１ｂｐ,编码５７７个氨基酸残基,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较。Ｆ基因核苷酸序列的同源性在８８．２％～９６．７％之间,氨基酸序列同源性在９０．１％～９     

一株野鸭源新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

根据GenBank中新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的F基因序列设计了1对特异性引物,成功地对其中一株野鸭源NDV的F基因进行了克隆、测序,并推导其氨基酸序列,选择F基因部分片段绘制了遗传进化树。F基因全长1 662 bp,单一的阅读框架编码553个氨基酸,构成的F蛋白上有13个Cys残基位点和6个潜在的糖基化位点,其裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-116R-117F。遗传进化分析表明,该NDV分离株为基因Ⅶ型NDV,与近年来我国家禽中所报道的NDV的基因型相一致。     

一株基因Ⅵ型鸭新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以一株鸭新城疫病毒NDV-SS分离株基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增其F基因,并进行克隆和序列测定。通过序列分析软件将该毒株F基因氨基酸推导序列与GenBank上已发表的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因相关代表序列进行同源性及遗传进化关系分析。测序结果表明,NDV-SS株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸,其蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特有的序列结构特征。同源性及遗传进化关系分析结果表明,NDV-SS株为基因Ⅵ型毒株,与鸽源新城疫IT-227、Italy-2736分离株具有较高同源性和较近的亲缘关系,推测其可能是由鸽源新城疫病毒变异所产生的。     

一株新城疫病毒的分离鉴定及其F基因的克隆与序列分析

本试验对山东某鸡场发生疑似新城疫感染的肉鸡分离得到的一株病毒,经鸡红细胞血凝、血抑试验和动物回归试验,结果表明,该分离株为新城疫病毒。对其毒力学指标进行测定,结果MDT为55.6h,ICPI为1.95,IVPI为2.85,表明该毒株为新城疫强毒株。PCR特异性扩增NDV-SD-02的F基因,大小为1662bp,编码553个氨基酸,F基因裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株氨基酸序列的特点,与生物学特性测定的结果完全相符。对分离株F基因的序列分析表明,与近年来国内外分离得到的Ⅶ型NDV同源性较高,为84.7%~98.9%,该毒株属基因Ⅶ型。     

朱鹮新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析

新城疫病毒(NDV)的F蛋白与病毒的致病性和免疫应答密切相关。为了了解朱鹮源NDV陕西分离株的变异情况及进化地位,采用RT-PCR方法对NDV陕西分离株F基因的主要功能区片段进行了扩增,并进行了序列测定及遗传进化树构建。序列分析表明,该分离株扩增片段的长度为535 bp,与预期扩增片段长度大小一致。其F基因裂解位点的氨基酸组成与NDV强毒株的特征性结构(112R-R-Q-K-R-F117)一致。系统进化树分析表明,该NDV分离毒株为基因Ⅶ型,与近年来报道的我国家禽流行的NDV基因型一致。     

新城疫病毒HeB02分离株F基因的序列分析

根据国外已发表的新城疫病毒F基因序列，设计了1对引物，并以RT-PCR特异性扩增出新城疫病毒HeB02分离株的F基因，基因产物大小为1．63kb，与设计相符。对其进行序列测定后，与其他标准毒株F48E9、LaSota和Clone30的F基因进行了同源性比较，结果表明，HeB02株与国内标准强毒株F48E9及目前广泛应用的弱毒疫苗株LaSota和Clone30的F基因核苷酸序列的同源性分别为88.1％、84.9％和83.8％。由此可以看出，HeB02分离株与标准毒株和疫苗株相比，在F基因上发生了变导。     

新城疫病毒分离株F基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR分别扩增出新城疫病毒(NDV)青海株(QH3)、黑龙江株(HLJ)和甘肃株(A4)的融合蛋白(F)基因的全长核苷酸,再克隆到pMD18-T载体中.经酶切和质粒PCR鉴定,获得阳性重组质粒后,进行序列测定并推导出其氨基酸序列,同时进行分析和比较.序列分析结果表明,所获得的3个分离株F基因完整的开放阅读框长度为1 662 bp,共编码F蛋白的553个氨基酸;3个毒株之间的核苷酸序列同源性为88.0%～90.6%;与常用疫苗株之间核苷酸序列同源性只有85.3%～91.6%.三者F基因的裂解位点均为112R-R-Q-K/R-R-F117,符合强毒株裂解区氨基酸组成的特征.以1 bp～374 bp的核苷酸序列绘制系统发育树分析表明,QH3株NDV为基因Ⅷ型,A4株NDV为基因Ⅵ型,HLJ株NDV为基因Ⅸ型.     

NDV 江苏分离株F基因的克隆与序列分析

为比较NDV江苏分离株的遗传变异特征,应用RT-PCR扩增出新城疫病毒（NDV）江苏徐州株（JSXZ）、江苏宿州株（JSSZ）、江苏连云港株（JSLYG）和江苏淮安株（JSHA）的融合蛋白F基因的全长核苷酸,将其分别克隆至pMD18-T载体中。将获得的阳性重组质粒进行序列测定后,推导出其氨基酸序列,进行分析和比较。结果表明,所获得的4个分离株F基因完整的开放阅读框长度为1662bp,共编码F蛋白的553个氨基酸;4个毒株与常用疫苗株之间核苷酸序列同源性只有69．3％～80．8％。JSXZ株和JSSZ株F基因的裂解位点为112-RRQK／RRF-117,符合强毒株裂解区氨基酸组成的特征。以lbp～374bp的核苷酸序列绘制系统发育树分析表明,JSXZ和JSSZ株NDV为基因Ⅷ型,JSLYG和JSHA株NDV为基因Ⅸ型。     

新城疫病毒贵州分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒（NDV）F基因序列设计了一对引物,用RT-PCR方法扩增了8个NDV贵州分离株的F基因片段,并将其分别克隆到pMD-18T载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1662bp,编码553个氨基酸,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.0%～99.7%和87.5%～99.3%,但与LaSota、B1及F48E9等常见毒株的氨基酸同源性为87.2%～97.7%。F蛋白裂解位点的氨基酸序列分别为112R-R-Q-R/K-R-F^117（其中P1、H2、N98、DQ、FW、BY、GZ7株为强毒）和112G-R-Q-G-R-L^117（TN1株为弱毒）。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树,结果表明,4个分离株（P1、H2、、N98、DQ）为基因Ⅶ型,2株（GZ、TN）为基因Ⅱ型,2株（FW、BY）为基因Ⅸ型。     

新城疫病毒广东分离株F基因的克隆与序列分析

为研究新城疫病毒(NDV)基因变异情况,用RT-PCR扩增了9个广东分离株的F基因cDNA片段,并将其分别克隆到pGEM-Teasy载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1 662 bp,编码553个氨基酸,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.1%~99.2%和96.0%~99.8%;但与LaSota、Roakin、F48E9及B1等常见疫苗株的氨基酸同源性仅为87.6%~92.2%。9个NDV分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q/R-K-R-F-I-G119,与平均致死鸡胚时间(MDT)、脑内接种指数(ICPI)等病毒致病力测定结果相符,均属于基因Ⅶ型NDV。     

新城疫病毒山东分离株ShD-5-06 F和HN基因序列分析

从山东济南某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒株（ShD-5—06）,研究其生物学特性表明,该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。从该分离株扩增出其F和HN基因,并与标准株进行同源性比较,为探讨NDV是否发生变异提供理论依据。本试验通过RT—PCR法特异性地扩增出F和HN基因全基因序列,并对其与已经发表的序列进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,ShD-5—06株的F和HN基因开放性阅读框架（ORF）为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸。与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84．1％～88．7％之间,氨基酸同源性在88．1％～93．3％之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82．19,5～87．4％之间,氨基酸同源性在88．6％～90．9%之间;F蛋白裂解位点区（112～117）氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株（ShD-5—06）为新城疫强毒株。     

新城疫病毒(长春株)F蛋白基因的克隆和序列分析

新城疫病毒（ＮＤＶ）长春株在鸡胚增殖后纯化,提取ＲＮＡ,然后利用特异性引物,经ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出了ＮＤＶ长春株的全长Ｆ基因。将该Ｆ基因插入ｐＫＳ（－）后,进行了序列测定。序列分析表明,该Ｆ基因核苷酸长度为１７５８ｂｐ,编码５５３个氨基酸,序列中有６个糖基化位点,１３个半胱氨酸残基,裂解位点区（１１２～１１７）氨基酸序列为Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ,与所有弱毒株在这一区域的序列（Ｇｌｙ－Ａｒｇ／Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ／Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ）相符,证明长春株为弱毒株。同源性分析表明,长春株Ｆ基因与目前国外发表的其他ＮＤＶＦ基因相比,核苷酸序列同源性在８８％～９９％之间,推导的氨基酸序列同源性在９０％～９８％之间     

新城疫病毒（青岛株）F蛋白基因的克隆和序列分析

参考新城疫病毒（NDV）长春株的F基因序列设计了1以特异性引物，应用RT－PCR对NDV青岛株（野毒）的F基因进行了扩增，扩增产物克隆后测序，扩出的F基因核苷酸长度为792bp，编码261个氨基酸，包括完整的F2片段和部分F1片段，裂解位点区（112－117aa）氨基酸序列为Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe，与国外发表的强毒株序列相符，正明青岛株为强毒株，根据该基因推导的所基酸序列，与国内外发表的NDVF蛋白氨基酸序列相比，同源性为88．1％－94．3％。