不同来源潜伏膜蛋白1基因转染对鼻咽癌CNE1细胞生长的影响

目的:探讨不同来源的EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)基因转染对人高分化鼻咽癌(NPC)细胞系CNE1生长的影响。方法:采用脂质体介导法分别将含有来源于B95-8淋巴细胞标准株的LMP1基因(B95-8-LMP1)和来源于NPC组织的LMP1基因(CAO-LMP1)的质粒转染CNE1;RT-PCR和蛋白印迹法分别鉴定LMP1mRNA和蛋白表达;结晶紫法、流式细胞术和平板克隆形成法测定不同来源的LMP1对CNE1生长特性的影响。结果:成功建立稳定表达不同来源LMP1的CNE1细胞系。两种不同来源的LMP1均可促进CNE1细胞的生长(P<0.01);CAO-LMP1比B95-8-LMP1具有更强促进CNE1生长的作用(P<0.01)。结论:不同来源LMP1对CNE1的体外生长均有促进作用,CAO-LMP1比B95-8-LMP1具有更强的促增殖能力。     

糖基化修饰的树突状细胞疫苗激发的骨髓瘤特异性T细胞免疫反应

探讨经糖基化修饰的肿瘤相关糖抗原冲击树突状细胞(DC)后,所得DC疫苗对骨髓瘤患者自身T细胞的刺激作用。采用化学方法及细胞生物工程法,使骨髓瘤细胞表达新肿瘤相关抗原N-丙酰多聚唾液酸(NPrPSA);在无血清培养条件下用GM-CSF/IFN-α及TNF-α诱导培养多发性骨髓瘤(MM)患者外周血单核细胞DC,继用表达新抗原的肿瘤细胞冲击制备DC疫苗,并与MM患者自身T细胞共同温育,流式细胞仪分析CD4+CD29+、CD8+CD28+及CD69+T细胞。结果显示糖基化修饰的骨髓瘤DC疫苗与正常细胞相比,可明显诱导CD4+及CD8+T细胞的活化。糖基化修饰的DC疫苗可激发骨髓瘤特异性T细胞免疫反应,将为靶向性杀伤骨髓瘤细胞奠定基础。     

三株人鼻咽癌Scid小鼠移植瘤的建立及特性研究

目的 建立鼻咽癌鼠移植瘤,为鼻咽癌的特异性免疫治疗研究提供实验模型。方法 从26例未治的鼻咽癌病人鼻咽部铰取肿瘤组织,分别皮下接种BALB／c裸小鼠（14只）和Scid小鼠（12只）;成功建立移植瘤株后观察其生长特性、形态、染色体和LMP的表达情况。结果 成功建立鼻咽癌Scid小鼠移植瘤株CSNET－1、CSNET－2和CSNET－3,已分别传至第11代（23个月）、第14代（17个月）和第9代（16个),其光镜和电镜下形态符合低分化磷癌的特征,电镜下在CSNET－1中可观察到Epstein-Barr病毒样颗粒,CSNET－1的染色体全部为人体细胞来源的染色体,免疫组化检测结果,3个瘤株均可见EB病毒晚期膜蛋白LMP－1和LMP－2阳性细胞。结论 CSNET－1、CSNET－2和CSNET－3是人类来源的鼠移植瘤株,是鼻咽癌免疫治疗研究的理想动物模型。     

Ad5F35-LMP2重组腺病毒修饰DC体外诱导特异性T细胞免疫的研究

目的 了解含有EB病毒潜伏膜蛋白2的非复制型重组腺病毒(AdSF35-LMP2)修饰的DC能否在体外诱导LMP2特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫.方法 人外周血单个核细胞在细胞因子诱导下生成树突状细胞,Ad5F35-LMP2感染树突状细胞后激发同源的T细胞,MTT法检测其对T细胞的增殖作用,及激活的特异性CTL对表达LMP2的人CNE-2细胞的特异性杀伤效应.结果Ad5F35-LMP2能有效感染树突状细胞.其激活的特异性CTL对CNE-2细胞有特异性杀伤活性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 重组腺病毒Ad5F35-LMP2感染的DC可以有效的诱导产生EBV-LMP2特异性细胞毒效应.     

联合检测血清唾液酸和EBVCA-IgA对鼻咽癌诊断及疗效监测的意义

目的 探讨联合检测血清唾液酸（SA）和EB病毒壳抗原IgA抗体（EBVCA-IgA）在鼻咽癌（NPC）患者诊断及疗效监测中的意义.方法 对65例NPC患者治疗前、治疗结束后1个月、和21例治疗后1年出现局部复发或远处转移者,50例头颈部良性病变患者及50例正常人血清SA与EBVCA-IgA进行联合检测.结果 NPC患者治疗前血清SA和EBVCA-IgA阳性率均明显高于正常人和头颈部良性病变患者,差异有统计学意义（均P＜0.01）;联合检测敏感性达到96.9%,明显高于SA、EBVCA-IgA的单项检测（P＜0.05）,同时特异性仍有91.0%.与NPC治疗前组比较,NPC治疗后组和未复发组的血清SA水平明显下降（P＜0.01）,NPC治疗后复发组较未复发组患者的血清SA水平明显上升（P＜0.01）,而EBVCA-IgA的阳性率的变化却不明显.结论 血清SA水平可作为判断NPC疗效及监测病情的一种有效手段,联合检测血清SA水平和EBVCA-IgA阳性率,可明显提高NPC患者的阳性检出率.     

鼻咽癌中EB病毒LMP1基因的序列变异

目的 检测广州地区鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N-和C-末端区序列变异的热点,并探讨其产生的机制。方法 收集中山大学肿瘤医院未经治疗的鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本63例。采用巢式聚合酶链反应（PCR）扩增EB病毒LMP1基因N-和C-末端区,用XhoⅠ对N-末端区扩增产物进行酶切分析,并检测C-末端区扩增产物30bp缺失的情况。采用四色荧光末端终止法对4例患者N-和C-末端区的8份扩增产物进行序列分析。结果 63例鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N-和C-末端区有4种序列变异类型：wt-XhoⅠ／wt-LMP1（4例,6．3％）、wt-XhoⅠ＆XhoⅠ-loss／del-LMP1（4例,6．3％）、wt-XhoⅠ／del-LMP1（5例,7．9％）和XhoⅠ-loss／del-LMP1（50例,79．5％）。序列分析显示：与B95-8细胞相比较,所有检测的鼻咽癌组织中EB病毒LMP1基因均发生了错义点突变和无义点突变。错义点突变数与无义点突变数之间的比值为2．25（9／4）。结论 广州地区鼻咽癌中EB病毒LMP1基因的序列变异类型以XhoⅠ-loss／del-LMP1占主导。LMP1基因N-末端区XhoⅠ酶切位点的丢失很可能是在C-末端区30bp缺失的基础上发生的。LMP1基因的4种序列变异类型可能代表了鼻咽癌变过程中EB病毒在宿主内演变的4个时相。     

腺病毒载体介导EB病毒潜伏期膜蛋白2A基因转染树突状细胞对其功能的影响

目的 探讨腺病毒载体介导EB病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因转染树突状细胞（DC）对其功能的影响。方法 通过同源重组法构建带有EBV－LMP2A基因的重组腺病毒Ad5-LMP2A，用不同感染滴度（MOI）的Ad5-LMP2A转染成熟的DC，用流式细胞术（FACS）检测DC的LPM 2A蛋白表达细胞百分率及用台盼蓝染色计数DC死亡百分率，选择最佳MOI；用最佳MOI的Ad5-LMP2A转染成熟的DC，FACS检测转染前后DC表面分子CD1a、CD83、CD40、CD80及HLA－DR的变化；并用^3H-TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种淋巴细胞增殖能力及荧光定量PCR检测表达IL－12 P40 mRNA等功能的改变。结果 MOI 200为Ad5-LMP2A转染DC的最佳滴度，此时约80％的DC表达LMP2S蛋白及92％以上细胞为活细胞。Ad5-LMP2A转染成熟DC前后对细胞表面共刺激分子及特征性表面标志无影响；转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和表达IL－12 P40 mRNA的功能。结论 腺病毒载体能高效介导EBV LMP2A基因在DC中表达，Ad5-LMP2A转染成熟DC对其功能无明显影响，便于进一步用于EBV相关肿瘤的免疫治疗。     

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响

目的:研究EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响。方法:将LMP1基因真核表达质粒转染至鼻咽癌CNE1细胞,脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞,MTT法检测细胞增殖能力,免疫组化法检测LMP1和P53蛋白表达,原位杂交技术检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达。 结果:对照组,转染并表达LMP1基因的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERT mRNA表达水平均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞。端粒酶反义核酸作用组,LMP1基因转染细胞的LMP1蛋白表达水平显著低于对照组(P＜0.01);LMP1基因转染细胞与未转染细胞和转染空载质粒的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERT mRNA表达水平均显著低于对照组(P＜0.01),但LMP1基因转染细胞的增殖能力和P53蛋白表达水平仍显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞(P＜0.01)。 结论:EB病毒LMP1可促进鼻咽癌细胞P53蛋白的表达。     

树突状细胞与T细胞免疫反应结果研究进展

树突状细胞(dendritic cell，DC)是美国学者Steinman于1973年发现的，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC起源于骨髓和脐血的CD34^ 造血祖细胞(hematopoietic progenitor cell，HPC)，分布于除脑组织以外的全身各处。DC是体内功能最强的专职抗原递呈细胞(antigcn presenting cells，APCs)，捕获外来抗原，迁移至引流淋巴结，发育成熟并递呈抗原，启动和诱导初始型T细胞，     

鼻咽癌EB病毒Rta/IgG抗体检测的诊断价值

目的 通过检测血清中的EB病毒Rta/IgG抗体,评价其在鼻咽癌诊断上的价值.方法 收集211例未经治疗的鼻咽癌患者,413例对照组(包括203例相似症状的非鼻咽癌病例和210例健康体检者)的血清,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测Rta/IgG抗体.应用受试者工作特征(ROC)曲线对结果进行分析评价.结果 鼻咽癌组的Rta/IgG抗体rA值中位数明显高于对照组(P<0.001).Rta/IgG抗体检测诊断鼻咽癌的ROC曲线下面积为0.933,最佳截断点时敏感度为90.5%,特异度为90.1%.结论 采用ELISA方法检测血清中Rta/IgG抗体可以作为检测EB病毒的一个新指标,并可作为鼻咽癌诊断的重要标志物之一.     

肝细胞癌患者树突状细胞免疫功能的研究

 目的：研究肝细胞癌患者树突状细胞(DCs)的免疫功能变化。方法：从人外周血中分离单个核细胞（PBMC），用GM-CSF和IL-4体外诱导、培养和扩增DCs，流式细胞仪测定DCs表面分子的表达，分别用ELISA、ELISPOT、MTT法测定HCC患者和健康人的DCs分泌IL-12；T淋巴细胞分泌IFN-γ和T淋巴细胞的增殖反应。结果：GM-CSF和IL-4能成功地体外诱导、培养和扩增DCs。HCC患者DCs的CD86表达明显低于健康对照者（91.7％ vs83.5%, P<0.05）。HCC患者DCs分泌IL-12与健康者差异不显著［（324.6±171.0）ng/L vs（436.5±142.7）ng/L, P>0.05］，接受内毒素LPS刺激后，差异更明显［（478.6±142.7）ng/L vs（630.0±151.9）ng/L, P<0.05］。DCs刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ 的量在HCC患者明显低于健康者［（133.4±51.2）103U/L vs (183.0± 60.2)103U/L, P<0.05］，DCs刺激T淋巴细胞的增殖能力在HCC患者明显低于健康者（2.3±0.7 vs3.5±0.8, P<0.01）。CTL杀伤实验表明，当效靶比为 10∶〖KG-*2〗1 和 20∶〖KG-*2〗1 时，HCC组的CTL对肝癌细胞Hep G2的杀伤活性明显低于健康组。结论： HCC患者DCs功能和T淋巴细胞功能低于健康者，HCC患者DCs诱导的CTL杀伤活性亦明显低于健康者。     

Induction of cytotoxic T lymphocyte respones in vivo after immunotherapy with dendritic cells in patients with nasopharyngeal carcinoma

The aim of the present study was to determine the efficacy of immunotherapy with dendritic cells to elicit EBV-specific CTL-immunity in advanced cases of EBV-positive patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC) and to determine the safety and toxicity of this preparation. Nine cases of histologically confirmed patients with NPC undergoing treatment with radiological therapy were enrolled in this study. Dendritic cells, generated in vitro from blood monocytes of patients were cultured and matured with cytokines and then infected with recombinant adenovirus vaccine containing EBV-latent membrane protein-2 (Ad-LMP2). On 9 days' cultivation of cells, the matured DCs were harvested, irradiated with Co and then injected intradermally to patients with NPC. The injections were performed 3 times totally. After immunization, the CTL responses were assayed by means of cytotoxicity and epitope-specific IFN-γproduction. The results of this trial showed that all patients could tolerate this kind of treatment without any side effect, during which marked increase of LMP2-specific CTL-responses could be demonstrated in 5 patients of this group. And the level of IgA/VCA antibody decreased in 8 of 9 patients, thus accounting for a better prognosis for these patients. All patients will be followed up for another one year. At least, the present work shows that intradermal vaccination with autologous DCs infected with recombinant Ad-LMP2 adenovirus is a safe procedure in NPC patients, in which this procedure can enhance the LMP2-specific CTL responses in patients. These data are encouraging to develop more effective vaccine strategies for the treatment of nasopharyngeal carcinoma.     

乳腺癌患者外周血树突状细胞亚群及其HLA-DR表达的变化

目的：探讨乳腺癌患者外周血树突状细胞(DC)亚群和其HLA-DR表达变化及血浆中DC相关细胞因子水平的变化。方法:4色荧光流式细胞术分析57例乳腺癌术前、术后1周、术后6个月的患者及正常对照的外周血DC前体细胞pDC₁/pDC₂（CD11c+CD123-/CD11c-CD123+）比值及其HLA-DR的表达；酶联免疫吸附法检测血浆细胞因子白细胞介素-12p40（IL-12p40）、白细胞介素-10（IL-10）、γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）水平。结果:57例乳腺癌患者中, 2例Ⅲ期、4例Ⅳ期外周血pDC缺乏，其余患者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期外周血pDC₁/pDC₂比值分别为1.62±0.59、1.41±0.63、0.91±0.32、0.81±0.29，均显著低于对照组（1.94±0.44,P<0.05）；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者术后1周pDC₁/pDC₂比值为1.71±0.47、1.52±0.54、1.04±0.36，与术前比较均无显著差异（P>0.05），但显著低于对照组（P<0.05）; 术后6个月pDC₁/pDC₂比值分别为1.92±0.72、1.63±0.65、1.28±0.34，与术前比较，均有显著提高（P<0.05），但与对照组比较，仅Ⅰ期患者恢复正常（P>0.05）,Ⅱ、Ⅲ期患者仍然显著降低（P<0.05）。乳腺癌患者pDC亚群HLA-DR表达以及血浆中IL-12p40、 IL-10、IFN-γ、IL-4水平及IL-12p40/IL-10、IFN-γ/IL-4比值与对照组比较均无显著差异（P>0.05）。结论:Ⅰ-Ⅳ期乳腺癌患者外周血pDC₁/pDC₂比值降低，部分Ⅲ、Ⅳ期患者外周血pDC缺乏。pDC的HLA-DR表达及DC分泌相关细胞因子的能力没有同步变异。术后患者pDC亚群Ⅱ、Ⅲ期明显改善，Ⅰ期恢复正常。     

致敏树突状细胞活化细胞毒性T细胞抗肿瘤作用的研究

目的：研究树突状细胞（DCs）激活的细胞毒性T细胞的抗肿瘤及预防肿瘤发生的作用。 方法： 细胞因子诱生人PBMC未成熟DCs，加入肿瘤细胞抗原提取物致敏DCs产生成熟DCs；通过细胞形态、表面标记鉴定成熟DCs，MTT法测成熟DCs活化的细胞毒性T细胞(CTL)的体外杀伤活性；裸鼠体内注射活化CTL观察其抑制移植瘤生长及发生的作用。 结果： 经过7 d培养，获得大量形态典型、具有强烈刺激增殖能力、高表达CD80(63.5%)、CD83（67.6%）和CD3/ HLA-DR(83.2%)的DCs。其活化的CTL在20∶1效靶比时对抗原来源细胞株自身的杀伤率达75%以上，对同系细胞株的杀伤活性为35%-45%，对其它种系肿瘤细胞仅有微弱杀伤力（P<0.01）。CTL对裸鼠结肠癌HT-29移植瘤有特异性的生长抑制和预防生成作用（P<0.05）。CTL治疗组肿瘤组织中PCNA表达水平显著低于对照组（P<0.05）。 结论： 肿瘤细胞抗原活化的DC诱导CTL对肿瘤有特异性的杀伤作用，体内应用可特异性抑制移植结肠癌的生长或预防小鼠结肠癌移植瘤的发生。     

Herpes simplex virus type I infection of mature dendritic cells leads to reduced LMP7-mRNA-expression levels

Mature dendritic cells (mDCs) are the most potent antigen presenting cells within the human immune system known today. However, several viruses, including herpes simplex virus type 1 (HSV-1) have developed numerous immune escape mechanisms, such as the avoidance of peptide presentation through the major histocompatibility complex (MHC) class I to CD8⁺ cytotoxic T-cells. Within the MHC class I pathway, the majority of antigenic peptides are generated by the proteasome, a multicatalytic protease complex. Upon exposure to IFN-γ, the constitutive proteasome is partially replaced by the immunoproteasome, which contains the IFN-γ-inducible subunits LMP2, MECL1 and LMP7.In this study, we report the downregulation of LMP7 on mRNA level in HSV-1 infected mDCs. Interestingly, this reduction was not vhs-mediated since using a virus strain lacking the vhs gene we obtained similar results. However, on protein level, LMP7-expression was not affected, which is probably due the high stability of the LMP7 protein. Also the incorporation of LMP7 into the immunoproteasome was not affected by HSV-1. However, for the in vivo situation, in which DC reside for a prolonged time period in peripheral tissues, the reduced LMP7-mRNA level could be of biological importance, since the virus could escape/hide from immune system of the host and establish latency processes.     

Identification of peptides presented through the MHC-II of dendritic cells stimulated with Mycobacterium avium

Mycobacterium avium (M. avium) represents a species of concern, because of its ability to modulate the host’s innate immune response, and therefore influence trajectory of adaptative immunity. Since eradicative response against mycobacteria, and M. tuberculosis/M. avium, relies on peptides actively presented on a Major Histocompatibility complex-II (MHC-II) context, we assessed paradoxical stimulation of Dendritic Cell resulting on immature immunophenotype characterized by membrane minor increase of MHC-II and CD40 despite of high expression of the pro-inflammatory tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in supernatants. Identification of M. avium leucine rich peptides forming short α-helices shutting down Type 1T helper (Th1), contribute to the understanding of immune evasion of an increasingly prevalent pathogen, and may provide a basis for future immunotherapy to infectious and non-infectious disease.     

MUC1 mRNA体外负载树突状细胞诱导细胞毒性T细胞对非小细胞肺癌的杀伤作用

 目的：将体外扩增的黏蛋白1 （MUC1） mRNA转染入成熟的树突状细胞（DCs）,观察其体外诱导的特异性抗肿瘤效应。方法：将分离提纯的单核细胞培养诱导为DC并用流式细胞术鉴定。构建pcDNA3.1（+）-MUC1质粒,体外转录为mRNA,电穿孔法转染DCs。定量 PCR检测转染的DCs中MUC1的表达;MTT法检测T细胞增殖情况;流式细胞术检测CD8+ 在T细胞的表达;LDH释放法测定细胞毒性,ELISA检测IFN-γ分泌水平。结果：流式细胞术结果表明成熟DCs标志表型的表达明显高于对照组。定量PCR结果说明转染后的DCs MUC1 mRNA相对表达量增高。转染组DCs与T细胞按1∶10共培养时,刺激增殖能力明显高于未转染组,且CD8+  T细胞表达率高于未转染组,诱导产生特异性的细胞毒性T细胞杀伤表达MUC1蛋白的靶细胞,而未转染组的杀伤作用较弱。转染组DCs与T细胞共培养的上清中IFN-γ的分泌水平高于未转染组。结论：电穿孔法可以将MUC1 mRNA成功转染至DCs,产生特异性杀伤效应,为以MUC1为靶点的非小细胞肺癌的免疫治疗提供实验和理论依据。     

胚胎干细胞诱导发育为树突状细胞的研究

目的：探讨胚胎干细胞（ESC）诱导分化为树突状细胞（DC）的实验方法，实现体外大规模扩增高纯度DC用于临床免疫治疗。方法：E14小鼠胚胎干细胞系在GM-CSF与IL-3联合作用下经胚胎体（EB）诱导分化为DC。不成熟DC （im-DC）流式细胞仪检测CD11c、CD80、CD86、MHC II-DR表达。用磷酸脂多糖（LPS）促进DC的成熟，收获细胞后观察细胞形态及摄片并做扫描电镜检查，分析细胞表型并与不成熟DC细胞表型做对比，异体淋巴细胞增殖实验行功能检测。结果：ES细胞来源DC呈典型DC形态学表现。im-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II表达低,m-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II的表达均较前明显升高。功能检测发现，ES细胞来源的DC具有强烈的激发同种异体淋巴细胞增殖的作用，证实ES细胞来源的DC具备正常的免疫学功能。结论：使用GM-CSF联合IL-3能成功诱导E14胚胎干细胞发育为DC。故ES细胞可作为DC来源的一条新途径，对于体外大规模制备DC用于免疫过继治疗提供了一个较好的方法。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突细胞CD40、CD80表达和免疫活性的体外研究

目的 :探讨慢性乙型肝炎患者DC表面协同刺激分子CD4 0和CD80表达与其抗原呈递功能的关系 ,为进一步研究慢性乙型肝炎的发病机制及治疗提供新的思路。方法 :分离培养慢性乙型肝炎患者和健康人外周血DC ,流式细胞仪测定DC表面CD4 0和CD80的表达 ,混合淋巴细胞反应测定两组DC的功能。结果 :慢性乙型肝炎患者DC表面CD4 0和CD80的表达较健康人低 ,刺激同种异种T细胞增殖反应也较健康人低。结论 :乙肝病毒感染可通过抑制患者DC表面CD4 0、CD80等协同刺激分子的表达 ,从而使其抗原呈递功能降低