低氧培养对RL95-2细胞线粒体损伤及凋亡的影响

目的 探讨低氧培养对于人子宫内膜上皮腺癌细胞株（RL95-2）线粒体损伤及细胞凋亡的影响.方法 用含有不同浓度（0、10、30、62.5、125 μmol/L）氯化钴的培养液培养RL95-2细胞株.采用CCK-8法测定细胞增殖活性;JC-1荧光染色,流式细胞仪分析细胞线粒体膜电位变化;Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 随着氯化钴浓度升高或作用时间延长（62.5 μmol/L作用下）, RL95-2细胞增殖活性逐渐下降,线粒体膜电位去极化增加,细胞凋亡率升高.结论 缺氧造成子宫内膜上皮细胞增殖活性下降,线粒体损伤,凋亡率升高.     

低氧培养对RL95-2细胞线粒体损伤及凋亡的影响

目的 探讨低氧培养对于人子宫内膜上皮腺癌细胞株（RL95-2）线粒体损伤及细胞凋亡的影响。方法 用含有不同浓度（0、10、30、62.5、125 μmol/L）氯化钴的培养液培养RL95-2细胞株。采用CCK-8法测定细胞增殖活性;JC-1荧光染色,流式细胞仪分析细胞线粒体膜电位变化;Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 随着氯化钴浓度升高或作用时间延长(62.5 μmol/L作用下), RL95-2细胞增殖活性逐渐下降,线粒体膜电位去极化增加,细胞凋亡率升高。结论 缺氧造成子宫内膜上皮细胞增殖活性下降,线粒体损伤,凋亡率升高。     

人子宫内膜细胞的分离培养及鉴定方法的探索

目的　体外分离并培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。方法　用酶解、二次滤网过滤、沉降等方法进行分离、纯化及培养 10例正常子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞并传代 ,通过光镜进行形态学观察 ,用免疫细胞化学法进行细胞鉴定。结果　 9例标本获得成功 ,基质细胞纯度可达 95 %以上 ,腺上皮细胞的纯度约为 90 % ,分离出的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞可以在体外进行增殖。结论　采用二次滤网过滤法可以分离得到纯度较高的内膜腺上皮细胞和基质细胞 ,这两种细胞均能在体外成活并传代。     

异位和正常子宫内膜间质细胞对上皮细胞间隙连接细胞间通讯的影响

目的 研究体外异位和正常子宫内膜间质细胞对内膜上皮细胞间隙连接细胞间通讯(gap junctional intercellular communication, GJIC)功能的不同影响.方法 取24例卵巢处子宫内膜异位灶以及10例正常子宫内膜,分离、纯化上皮细胞和间质细胞,建立体外上皮细胞单独培养、上皮细胞与间质细胞共培养模型.在激光共聚焦显微镜下采用荧光漂白后恢复技术分别检测各组上皮细胞的GJIC功能.结果 ①异位内膜上皮、间质细胞纯度分别为92%、95%,对照组内膜上皮、间质细胞纯度分别为95%、98%;②单独培养的异位内膜上皮细胞与单独培养的正常内膜上皮细胞的GJIC功能无显著性差异(P＞0.05);③与正常间质细胞共培养后,上皮细胞中GJIC功能明显上调,而与异位内膜间质细胞共培养的上皮细胞中GJIC功能未见明显变化.结论 异位间质细胞丧失了调节上皮细胞GJIC的能力,这种调节能力的异常可能与子宫内膜异位症发生有关.     

IL-1对离体培养人子宫内膜间质细胞催乳素分泌的影响

目的 观察白细胞介素-1(IL-1)对体外培养的人子宫内膜间质细胞催乳素(PRL)分泌的影响,以探讨IL-1对女性生殖生理的调节作用。方法 采用免疫组化染色方法对腺上皮细胞和间质细胞进行鉴定。结果 腺上皮细胞角蛋白(Keratin)染色呈阳性反应,间质细胞波形蛋白(Vimentin)染色呈阳性。结论 IL-1可以抑制离体培养人子宫内膜间质细胞PRL的产生,并随浓度增加抑制作用增强。     

肉桂醛促进子宫内膜癌RL95-2细胞凋亡的机制

【目的】探讨肉桂醛对子宫内膜癌RL95-2细胞凋亡的影响及其作用机制。【方法】选取肉桂醛作用子宫内膜癌RL95-2细胞,噻唑蓝（MTT）比色法检测子宫内膜癌RL95-2细胞的增殖活性和肉桂醛的IC50,Hoechst33258染色荧光显微镜观察细胞凋亡形态学改变,流式细胞术检测RL95-2细胞的凋亡百分率,Western blot检测肉桂醛对RL95-2细胞Cleavedcaspase-3、Caspase-3、NF-κB、IL-6和IGF-R蛋白表达的影响。【结果】肉桂醛可降低子宫内膜癌RL95-2细胞的增殖率,与药物浓度和作用时间有关;与溶剂对照组比较,肉桂醛组（0.29、0.59和1.20mg/mL）作用48h后RL95-2细胞的凋亡百分率明显增高（P<0.01）,出现典型的凋亡小体,Cleavedcaspase-3蛋白的表达明显增加（P<0.01）,Caspase-3蛋白的表达无明显变化（P>0.05）,而NF-κBp65、IL-6和IGF-R蛋白的表达均明显降低（P<0.05）。【结论】肉桂醛可降低RL95-2细胞NF-κB·p65、IL-6和IGF-R蛋白的表达,促进RL95-2细胞的凋亡,从而起到抗子宫内膜癌作用。     

高纯度子宫内膜细胞分离和体外培养技术及其应用

目的：分离、纯化子宫内膜间质细胞（ESC）和腺上皮细胞，建立体外ESC蜕膜化模型。方法：选择正常育龄妇女的新鲜子宫内膜组织，经多酶消化制成细胞悬液，分离、纯化间质细胞和腺上皮细胞；分别培养至细胞聚合成片，随机分组，用等渗浓度的甾体激素诱导ESC体外蜕膜化改变。结果：分离的间质细胞其纯度达95%以上，其细胞活力达92%——95%。在此体外培养系统中，ESC对生理剂量激素的应答出现与活体相仿的蜕膜化改变。结论：利用此技术可在细胞和分子水平上研究子宫内膜的各种功能及其调节。     

全反式维甲酸对人子宫内膜腺癌细胞增殖抑制作用的研究

目的:探讨全反式维甲酸(All trans retinoic acid,ATRA)对人子宫内膜腺癌细胞株(RL95-2)的增殖抑制作用.方法:用不同浓度ATRA处理体外培养的RL95-2,分别在处理后不同的时间点,以MTT法检测ATRA对RL95-2增殖活性的影响;用流式细胞术检测经ATRA处理后的RL95-2细胞周期的变化;免疫组化方法检测细胞周期素A(Cyclin A)的改变;扫描电镜和透射电镜观察ATRA处理后的细胞形态变化.结果:ATRA可抑制RL95-2的增殖,且这种作用呈时间及浓度依赖性.FCM分析发现RL95-2细胞增殖被ATRA阻滞于G0/G1期.电镜观察到用药后细胞恶性表型消失.免疫组化发现AT-RA处理后48h,Cyclin A蛋白表达降低.结论:ATRA对子宫内膜癌细胞系RL95-2的生长有抑制作用,且这种抑制作用与Cyclin A蛋白表达水平降低有关.     

Effects of insulin, insulin-like growth factor-I and -II on proliferation and intracellular signaling in endometrial carcinoma cells with different expression levels of insulin receptor isoform A

Background  Hyperinsulinemia, insulin-like growth factor (IGF)-I and -II (IGF-II) are associated with increased risk of endometrial carcinoma. Insulin receptor isoform A (IR-A) is more frequently expressed in endometrial carcinoma than in normal endometrial tissues. To better understand their roles in endometrial carcinoma, we investigated the effects of insulin, IGF-I, and IGF-II in endometrial carcinomas cells with different IR-A expression levels.

Methods  To explore the role of IR-A in mediating the activity of IGF-I, IGF-II, and insulin, we investigate the cellular proliferation of endometrial carcinoma cell lines RL95-2 and RL95-2-IR-A by MTS assays. Then we examined the protein kinase Akt phosphorylation and extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2 phosphorylation in both cell lines by Western blotting. The effect of IGF-II and AG1024 on cell cycle progression and apoptosis was assessed by flowcytometry. To examine whether the effects of IGFs were mediated by IR-A, we blocked IGF-I receptor (IGF-IR) in both cell lines using AG1024, an IGF-IR-specific inhibitor.

Results  IGF-I and IGF-II significantly enhanced proliferation of both cell lines (P <0.05). By contrast, insulin significantly increased proliferation of RL95-2-IR-A cells only (P <0.05). IGF-I and IGF-II significantly increased pAkt levels in RL95-2 cells and pERK1/2 levels in RL95-2-IR-A cells (all, P <0.05). Insulin increased pERK1/2 levels in RL95-2–IR-A cells only (P <0.05). LY294002 and PD98059 inhibited the specific signaling activities and cellular proliferation. After AG1024 pretreatment, neither IGF-I nor IGF-II affected pAkt levels in RL95-2 cells. IGF-II, but not IGF-I, increased pERK1/2 levels in RL95-2-IR-A cells. After AG1024 pretreatment, the proliferation rate and DNA content corresponding to the S phase increased and apoptosis decreased significantly in IGF-II-treated RL95-2-IR-A cells only (P <0.05).

Conclusions  The proliferation effect of insulin is mediated by IR-A. When IR-A dominates in a cell line, IGF-II activated cell proliferation mainly through the ERK1/2 pathway. On the other hand, IGF-II activated cell proliferation mainly through the Akt pathway. IR-A can at least partly mediate the proliferative and anti-apoptotic effects of IGF-II through the ERK1/2 pathway.

     

人子宫内膜异位症异位及在位内膜间质细胞分离与培养

目的：建立子宫内膜异位症（EMs）异位、在位内膜间质细胞的体外细胞模型,实时观察间质细胞形态变化。方法胶原酶消化异位、在位内膜组织,二次筛网过滤结合低速离心法分离纯化间质细胞,应用免疫细胞化学染色进行细胞鉴定,并进行传代培养,观察细胞生长状况及细胞形态差异。结果培养成功率91．3％,间质细胞纯度达95％;异位间质细胞9代内、在位及对照组间质细胞11代内,细胞形态及活性并无明显改变。结论子宫内膜间质细胞可为子宫内膜异位症研究提供较好的细胞模型。     

携带野生型PTEN基因的重组腺病毒治疗子宫内膜癌的体外研究

目的:观察携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)体外转染子宫内膜癌细胞后的表达,并探讨其对肿瘤细胞产生抑制增殖、诱导凋亡的作用及机制.方法:细菌内同源重组方法构建Ad-PTEN,体外转染PTEN基因突变的子宫内膜腺癌RL95-2细胞中,X-gal染色检测转染效率.应用RT-PCR、Western印迹、细胞免疫组化检测Ad-PTEN在RL95-2细胞中的转录及表达; 应用细胞计数、MTT实验, 观察Ad-PTEN对RL95-2细胞生长的影响;应用光镜、透射电镜观察外源性PTEN基因表达对RL95-2细胞形态学及超微结构的影响;应用流式细胞分析仪(FCM)检测Ad-PTEN对RL95-2细胞周期分布的影响、凋亡诱导作用及半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶casapase-3的激活.结果:外源性野生型PTEN基因经腺病毒介导成功转入RL95-2细胞,3种方法均检测出有PTEN mRNA及PTEN蛋白的表达,当感染复数(MOI)为50时,体外转染效率达到100%.Ad-PTEN显著抑制RL95-2细胞生长并诱导其凋亡.此外, Ad-PTEN还能诱导RL95-2细胞周期G0/G1期阻滞以及caspase-3的激活.结论:重组腺病毒Ad-PTEN是高效的基因转移系统,能将PTEN目的基因转移到丧失该基因功能的子宫内膜癌RL95-2细胞中,对RL95-2细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用,其机制可能包括细胞周期G0/G1阻滞及caspase-3 蛋白酶的激活.     

人子宫内膜细胞的纯化和培养

目的：本研究旨在建立一套子宫内膜细胞体外培养和贮存传代的方法，为进一步对其进行抗原组分研究奠定基础。方法：用胶原酶消化和铜网过筛法分离子宫内膜基质细胞和上皮细胞，进行单层培养。结果：子宫内膜上皮细胞和基质细胞分别经角蛋白单抗和波形蛋白单抗组化染色为阳性，腺细胞可持续培养4～6周，传代2～3次。结论：子宫内膜腺体细胞培养方法的建立为减少外科来源的子宫内膜抗原建立了基础。     

原代人子宫内膜细胞分离及培养鉴定

目的：探究原代人子宫内膜细胞分离及培养的简易方法,并对其纯度及生物活性进行鉴定。方法采用胶原酶消化人子宫内膜组织,经2次筛网过滤、离心及贴壁纯化技术,分离、纯化培养人子宫内膜间质细胞（ESC ）和腺上皮细胞（EEC ）,用细胞角蛋白（cytokeratin）和波形蛋白（vimentin）免疫细胞化学染色法和免疫荧光方法对所分离的细胞进行鉴定。结果 ESC呈平行生长,细胞呈梭形或多角形,波形蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度达95％以上。EEC呈漩涡状生长,细胞呈多角形或蝌蚪形,细胞角蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度可达90％。结论应用胶原酶消化法及二次筛网过滤法成功分离并培养数量、活力和纯度高的子宫内膜细胞,可操作性强,可供具备基本细胞培养条件的实验室进行推广。     

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）促进Ⅰ型子宫内膜癌细胞增殖和侵袭

 目的  研究肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)对Ⅰ型子宫内膜癌增殖转移的影响及其分子生物学机制。方法 免疫组化方法分析正常及各类型子宫内膜增生性病变(增殖期、分泌期、单纯增生、复杂增生、不典型和I型子宫内膜癌)组织中巨噬细胞浸润情况。CCK-8法和Transwell法分别检测单核巨噬细胞系THP-1(构建为M2型TAMs后)对Ⅰ型子宫内膜癌细胞系RL95-2增殖和侵袭能力的影响,Transwell法检测RL95-2对THP-1的招募作用。Western blot技术检测THP-1对RL95-2的CyclinD1和MMP-2表达影响。 结果  免疫组化结果显示,TAMs浸润数目与子宫内膜增生性病变进展程度呈正相关。RL95-2可招募THP 1,招募的THP 1促进RL95 2的增殖和侵袭,MMP-2和CyclinD1表达随THP-1作用而呈时间依赖性上调(P<0.05)。结论  巨噬细胞浸润增加造成的肿瘤周围炎症微环境可能是Ⅰ型子宫内膜癌发展的机制之一。     

miR-34c抑制人子宫内膜癌的机制分析

目的 MicroRNAs (miRNAs)是内源性表达长度约为22个核苷酸的小RNA分子,通过结合到靶mRNA上而抑制基因的表达。近年的研究表明某些miRNAs可以调节肿瘤细胞的增殖与迁移,然而miRNA在子宫内膜癌中的作用有待于进一步探索。本研究旨在探讨miR-34c在人子宫内膜癌中的表达规律、功能和分子机制。 方法 通过荧光定量PCR技术检测20例人子宫内膜癌组织标本中miR-34c的表达。通过阳离子脂质体介导的方法将miR-34c转染入人子宫内膜癌细胞RL95-2中,应用MTS法检测子宫内膜癌细胞的增殖,克隆形成实验检测子宫内膜癌细胞的生长,流式细胞术检测细胞周期,Transwell实验检测子宫内膜癌细胞的迁移。生物信息学和荧光素酶报告基因实验确认miR-34c作用的靶基因。RNAi技术下调c-Met的表达。通过蛋白印迹检测miR-34c对c-Met蛋白以及细胞内重要信号通路与细胞周期相关蛋白的影响。 结果 miR-34c在子宫内膜癌中表达明显降低。miR-34c能使子宫内膜癌细胞RL95-2细胞周期滞留在G₁期,显著抑制细胞的增殖。细胞移形实验发现miR-34c能够显著抑制RL95-2细胞迁移。生物信息分析表明c-Met是miR-34c作用的靶基因,进一步通过荧光素酶报告基因实验得以证实。蛋白印迹分析发现miR-34c能下调RL95-2细胞中的c-Met蛋白、p-Akt蛋白以及p-ERK1/2蛋白表达情况,同时还能够下调CDK4、CDK6蛋白以及p-Rb蛋白的表达水平。RNAi技术下调c-Met的表达能够明显抑制子宫内膜癌细胞的增殖与迁移。 结论 本研究结果证明miR-34c通过作用于靶基因c-Met而抑制子宫内膜癌细胞的增殖与迁移,说明miR-34c是子宫内膜癌中的重要抑癌基因。      

兔子宫内膜干细胞的鉴定

目的:研究兔子宫内膜是否存在干细胞?方法:流式细胞术检测兔子宫内膜中上皮细胞及间质细胞的特异性标记分子,干细胞培养基培养出富含干细胞的集落,运用RT-PCR方法检测分化前后相关分子的表达,MTT法检测集落细胞分化前后增殖能力变化,流式细胞术检测分化前后的相关分子表达变化及细胞的凋亡情况?结果:兔子宫内膜存在上皮细胞及间质细胞两种细胞,干细胞培养基可培养出富含干细胞的集落,且分化前的细胞具有更高的增殖潜能,表现出更多的干细胞源性,具有更低的细胞凋亡比例?结论:兔子宫内膜存在富含干细胞的集落,提示存在子宫内膜干细胞?     

人离体子宫内膜细胞培养方法的建立

目的：建立分离培养人在位及异位子宫内膜间质及腺上皮细胞的方法，为进一步探讨子宫内膜异位症发生，发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：对36例在位子宫内膜及19例异位内膜随机分为离心分离组及筛网分离组进行体外培养。通过光镜观察及S－P免疫组化染色法，对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：离心分离法培养的在位和异位内膜细胞中，成功率分别为61．1％和30％；筛网分离法培养的在位和异位内膜细胞中，成功率分别为83．3％和77．8％。结论：采用筛网分离法及离心分离法均能获得纯度较高的间质与上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于揭示子宫内膜异位症的发病机制，为临床治疗提供重要的理论依据。     

改良式筛网法人子宫内膜细胞的分离与纯化

目的探讨改良式筛网法在分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞中的应用价值。方法通过高浓度胶原酶结合不同浓度、时间消化、过滤及贴壁纯化等技术,应用筛网分离法培养各15例子宫内膜腺上皮和间质细胞,并传代。结果改良式筛网分离法培养中的15例标本中,腺上皮细胞和间质细胞成功率分别为93.3%和93.3%;分离出的腺上皮细胞及间质细胞可体外培养,经分离纯化后腺上皮细胞纯度>90%,间质细胞纯度>98%;两种细胞经传代后间质细胞成功率92.9%;腺上皮细胞传代培养后活力下降,成功率14.3%。结论通过改良式筛网分离法能获得纯度较高的腺上皮细胞与间质细胞;间质细胞可行传代培养;腺上皮细胞传代培养后活力下降,不宜传代。     

人子宫内膜细胞原代体外培养方法

目的改良人子宫内膜细胞原代体外培养方法的建立,并对其进行特征鉴定。方法将选择的子宫内膜组织机械法分离,复合酶消化,传代自然增殖法纯化细胞,进行单层培养。通过倒置显微镜观察其大体形态,HE染色观察其胞核情况,免疫细胞化学染色法对间质细胞(endometrial stromal cell,ESC)及上皮细胞(endometrial glandular epithelial cell,EEC)进行鉴定。结果培养的子宫内膜细胞均有ESC和EEC两种形态细胞。EEC和ESC经角蛋白单抗体和波形蛋白单抗体染色,凡是胞质被染成棕黄色的细胞为阳性细胞。结论成功培养了原代人子宫内膜细胞,方法经济、简单,获得细胞成活率高,生长稳定。成功建立子宫内膜细胞原代体外培养体系,为从细胞和分子水平方面研究子宫内膜的各种功能及干预调节奠定基础。     

PTENcDNA抑制子宫内膜癌细胞增殖作用的研究

【目的】研究外源性PTENcDNA对子宫内膜癌细胞生长增殖的影响,探讨子宫内膜癌治疗的新途径。【方法】经携带野生型VIENcDNA的重组腺病毒（Ad—PTEN）介导将PTENcDNA转入人子宫内膜癌细胞RL95—2,用反向聚合酶链反应（RT—PCR）检测出PTENeDNA在R195—2细胞中持续表达,X-gal染色方法测定腺病毒转染效率,台盼蓝染色活细胞计数绘制生长曲线,流式细胞分析仪（FCM）测定细胞周期。受试细胞随机分成（1）Ad—PTEN组：转染复制缺陷型腺病毒Ad—PTEN。（2）Ad—CMV组：转染空载体腺病毒Ad—CMV。（3）对照组：仅用培养基而不加腺病毒。【结果】Ad—PTEN感染RL95—2细胞后,RT—PCR方法检测PTENcDNA在RL95—2细胞中持续表达;X—gal染色方法测得Ad—PTEN最佳感染复数为100。经台盼蓝染色活细胞计数后绘制细胞生长曲线,见经Ad—PTEN感染的细胞生长速度明显低于空载体病毒Ad—CMV感染及未经病毒感染的RL95—2细胞（P〈0．01）,而空载体Ad—CMV感染后的细胞与未经感染的RL95—2细胞比较,生长速度无差异（P〉0．05）;细胞周期分析表明,感染Ad—tWEN后的R195—2细胞G1期细胞比例明显增多,而S期G2-M期的细胞减少（P〈0．05）。【结论】Ad—PTEN介导的PTENcDNA在子宫内膜癌细胞RL95—2中有表达。PTENcDNA在RL95—2的中表达能够抑制细胞的增殖,将细胞周期阻断在G1期。