迁移侵袭抑制蛋白 MIIP 基因 K167E 位点突变体的构建和表达

目的构建人迁移侵袭抑制蛋白（MIIP）蛋白K167E突变体的原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP（K167E）并进行表达和纯化,为MIIP的后续功能研究提供有效工具。方法以pGEX-4T-1-MIIP重组质粒为模板,PCR扩增得到人MIIP基因（K167E）突变体的eDNA全长,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌B121细胞中诱导表达,纯化获得GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结果酶切鉴定和测序结果显示,pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体构建成功。经诱导表达及纯化后,成功获得的GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结论成功构建了pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体,并获得了GST—MIIP（K167E）融合蛋白。     

人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:构建人热休克蛋白70(HSP70)的原核表达载体,诱导其表达并纯化.方法:应用PCR技术从人胆管癌组织中扩增出HSP 70基因片段,经T-A克隆连接到末端经平滑处理后的pMD18-T Simple质粒并测序.利用双酶切技术构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-HSP 70,并转化大肠杆菌JM 109,经IPTG诱导后表达得到HSP70融合蛋白.应用Glutathione-Sepharose4B亲和层析柱提纯融合蛋白,用生物素化凝血酶分离并纯化目的蛋白,最后行Wsetern blot鉴定.结果:PCR扩增结果与预计目的基因大小一致;序列分析与GeneBank中收录完全一致;重组表达载体pGEX-4T-1-HSP 70构建成功;Western blot结果显示目的蛋白可以与兔抗人的HSP70单克隆抗体特异性结合.结论:HSP 70编码序列已经成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并在大肠杆菌JM 109中获得表达.     

MIIP真核表达载体的构建及其稳定过表达MDA-MB-231细胞系的建立

目的构建pCDNA3.0-MIIP真核表达载体并建立其稳定转染的MDA-MB-231细胞系。方法pGEX-4T-1-MIIP重组质粒及pCDNA3.0真核表达载体分别经Xho I和EcoR I双酶切后,回收目的基因,T4 DNA连接酶连接后,转化得到pCDNA3.0-MIIP重组真核表达载体,对其进行双酶切和测序鉴定。脂质体法将鉴定后的pCDNA3.0-MIIP质粒转染至人乳腺癌MDA-MB-231细胞中,分别于转染后48和72h提取细胞总RNA,QRT-PCR法确定其转染。G418筛选转染细胞,Western blot检测目的蛋白表达。结果酶切及测序结果证实pc DNA3.0-MIIP真核表达载体构建成功。pcDNA3.0-MIIP转染至MDA-MB-231细胞后,QRT-PCR检测证实MIIP表达显著增强。G418筛选后得到单克隆细胞群,Western blot检测证实MIIP表达显著增强。结论成功构建出了可在真核细胞中高效表达MIIP基因的pc DNA3.0-MIIP重组质粒;建立了稳定过表达MIIP的MDA-MB-231细胞系。     

多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定

目的 构建人CTCF cDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定.方法 以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-West-ern blot鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功.GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白.各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质.结论 成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化.获得了高效表达的GST融合蛋白.     

小鼠可溶性PD-1的克隆、原核表达及活性分析

目的：小鼠可溶性PD-1（sPD-1）原核表达载体的构建、表达、纯化及其生物学效应初步研究。方法：应用小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆sPD-1基因,将其重组到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-sPD-1,转化至E.coliDH5α,筛选阳性菌落,进行酶切及测序鉴定。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-sPD-1转化至E.coliBL21（DE3）中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测,同时通过蛋白质纯化仪纯化GST-sPD-1融合蛋白。利用流式细胞术和Alamar Blue法,检测纯化的sPD-1融合蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性。结果：成功构建重组质粒pGEX-4T-1-sPD-1,并在E.coli BL21（DE3）中获得了成功表达,利用蛋白质纯化仪得到纯化的GST-sPD-1融合蛋白。流式细胞术和Alamar Blue法结果均显示,不同浓度的融合蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖。结论：成功地克隆、表达和纯化了小鼠sPD-1蛋白,纯化的重组蛋白可有效促进淋巴细胞增殖,为进一步研究其功能和临床应用提供了条件。     

人重组蛋白P311的原核表达纯化与鉴定

目的 原核表达人增生性瘢痕新候选相关蛋白P311,并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 通过PCR方法扩增人P311基因,利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点将其克隆至谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase,GST)融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting等方法鉴定表达产物,并用谷胱甘肽-琼脂糖小珠亲和纯化表达的GST-P311蛋白.结果 重组载体pGEX-4T-P311经酶切与测序鉴定证实构建成功.导入大肠杆菌进行表达,表达产物相对分子量为34KD左右,与预期值相符.该条带经免疫印迹检测鉴定为GST抗体阳性,获得了纯化的GST-P311蛋白.结论 构建了pGEX-4T-P311原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究P311的生物学功能奠定了基础.     

GST-CTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的构建人CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)与谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)重组蛋白的原核表达载体,并进行诱导表达。方法以pEASY-T1-SIMPLE-CTCF为模板,设计引入限制性酶切位点的CTCF引物,PCR方法扩增目的片段,产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体pGEX-4T-1连接,构建成pGEX-4T-1-CTCF原核表达载体,转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,Western blot检测GST-CTCF融合蛋白的表达情况。结果经菌液PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒pGEX-4T-1-CTCF构建成功,GST-CTCF融合蛋白产物经Western blot鉴定为特异性表达。结论成功构建了pGEX-4T-1-CTCF原核表达质粒,获得特异性的GST-CTCF融合蛋白,为进一步研究转录因子CTCF的功能奠定了基础。更多还原     

结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

IgE低亲和力受体基因的克隆、表达及初步鉴定

目的 利用基因重组的方法建立IgE低亲和力受体(FceR Ⅱ)基因的原核表达系统.方法 用RTPCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞扩增FceR Ⅱ cDNA基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达载体 FceR Ⅱ-pGEX-4T-1,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta,诱导表达FceR Ⅱ蛋白,通过割胶回收纯化,并用Western blot检测FceR Ⅱ的表达.结果 测序表明所扩增FceR Ⅱ cDNA基因,与已报道的序列一致.获得的重组蛋白经Western blot鉴定可以和人IgE特异性结合.结论 成功构建了FceR Ⅱ-pGEX-4T-1表达载体,获得了能和人lgE特异性结合的重组蛋白,为下一步FceR Ⅱ单克隆抗体的制备及应用研究打下了基础.     

pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。     

GST-HDAC4融合蛋白载体的构建及其蛋白表达

 目的构建人HDAC4蛋白与谷胱甘肽转移酶（GST）重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达和纯化。方法用Eco RI单酶切pcDNA3.1-HDAC4质粒,得到hHDAC4全长编码序列,并将其克隆至原核表达载体pGEX-5X-1构建成新载体GST-HDAC4,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌BL21,通过异丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并纯化获得目的蛋白。Western blot检测重组质粒的表达。结果酶切鉴定和测序结果显示, GST-HDAC4融合蛋白原核表达载体构建成功。考马斯亮蓝染色和Western blot结果显示,成功获得有生物活性的GST-HDAC4融合蛋白。结论成功构建了HDAC4原核表达载体,获得有生物活性的GST-HDAC4蛋白。     

巢蛋白样结构域蛋白的表达?纯化与鉴定

目的:重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域(nidogen domains,NIDO)蛋白,并进一步纯化与鉴定?方法:PCR法拼接NIDO基因,经T-A连接亚克隆至pMD19-T载体,测序鉴定?采用质粒抽提?纯化?酶切?连接?感受态细胞制备和转化等技术,构建并鉴定原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO?药物诱导方式诱导NIDO-GST融合蛋白的表达?对表达产物进行分离,用SDS-PAGE检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量?对包涵体进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化?采用SDS-PAGE和质谱分析,鉴定纯化的目的蛋白?结果:测序证实了NIDO基因的正确合成和pMD19-T-NIDO克隆载体的构建?原核表达系统pGEX-4T-1-NIDO构建成功,在大肠杆菌BL21中被诱导,获得高表达量的N-末端带有GST标签序列的重组融合表达蛋白(30%)?超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多?将包涵体变性?复性后用GST亲和层析纯化,纯化蛋白> 80%并经质谱鉴定证实?结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO,能正确表达NIDO-GST融合蛋白,GST亲和层析对于NIDO-GST融合蛋白有较好的纯化效果?     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的 构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析.方法 用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1.将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白.用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性.结果 所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确.IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性.结论 成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E. coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白.     

TTV病毒ORF1抗原的基因克隆及原核表达

目的 扩增和克隆TTV-ORF1 DNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达.方法 从TTV病毒感染者外周血中提取DNA,用PCR从中扩增出TTV-ORF1 DNA,插入载体pGEM-T Easy中;测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达载体pGEX-4T-1-ORF1,转化大肠杆菌BL21株进行表达.结果 成功获得TTV-ORF1编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致.诱导表达得到51kD的TTV-ORF1融合蛋白,占细菌总蛋白量的27.2%.Western blot证实为目的蛋白.结论 成功获得TTV-ORF1 DNA,构建得原核表达载体并获得高效表达.为TTV的ELISA检测和疫苗提供抗原.     

GST-HPV16E7融合蛋白的原核表达与纯化

目的 构建HPV16地方株E7基因原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化.方法 将成都本地某宫颈癌患者所感染的HPV16 E7全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-HPV16E7,转化宿主菌E.coli BL-21.经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western blot分析证实蛋白表达的特异性.并用GST亲和层析法对融合蛋白进行纯化.结果 该患者所感染的HPV16为东亚株,成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-HPV16E7并表达出GST-HPV16E7融合蛋白,证实了蛋白表达的特异性,并获得了GST-HPV16E7融合蛋白的纯品.结论 成功表达、纯化了本地流行株GST-HPV16E7融合蛋白,为进一步研究HPV16E7蛋白的功能奠定了实验基础.     

人肿瘤蛋白D52重组融合蛋白的原核表达及特性鉴定

目的:表达人肿瘤蛋白D52(human tumor protein D52,hTPD52)的重组融合蛋白,并对该蛋白的生物学特性进行鉴定?方法:RT-PCR扩增乳腺癌MCF-7细胞中的hTPD52基因并克隆于pMD18-T载体中,测序鉴定序列正确后,分别插入pET-32a?pGEX-4T-2和pET-28a 3种表达载体中?重组质粒经酶切鉴定?序列分析正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),选择最佳表达载体和表达条件进行大量表达,表达产物经His柱亲和纯化和超滤浓缩后,应用Dot blot?Western blot鉴定纯化蛋白的特性?结果:正确扩增出了hTPD52基因,鉴定其为isoform 3型?用pET-32a-hTPD52重组表达载体能够大量表达可溶性的hTPD52-Trx融合蛋白,Dot blot显示表达的融合蛋白能和抗hTPD52的抗体结合,SDS-PAGE和Western blot显示表达的融合蛋白分子质量约为44 ku,去除Trx后仍能够与特异性抗体结合?结论:成功制备hTPD52重组融合蛋白,并证明原核表达的hTPD52保留了原有的抗原结合活性?     

EB病毒潜伏膜蛋白2A1-119重组质粒的表达及鉴定

目的：构建含EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）潜伏膜蛋白（LMP）2A N端1-119基因的重组质粒,探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法：采用RT-PCR方法从B95-8细胞中获得LMP2A1-119外显子基因片段,并克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果：pGEX/LMP2A1-119重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达。SDS-PAGE结果表明表达产物相对分子质量约为50 kD,West-ern blot结果证实其为目的蛋白。结论：EBV LMP2A1-119蛋白可在pGEX-4T-1原核表达系统中表达,为进一步研究其免疫学特性打下了基础。     

大鼠BTCe蛋白原核表达及功能鉴定

目的原核表达获得大量具有生物活性的大鼠BTCe蛋白。方法RT-PCR法从大鼠肾脏中扩增出150bp BTCe片段,插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建质粒pGEX-BTCe。转化BL-21菌,IPTG低温诱导表达融合蛋白,亲和层析法纯化获得融合蛋白,凝血酶酶切后获得目的蛋白,经SDS-PAGE、Western blot及质谱鉴定。以0.5nmol/L BTCe作用于3T3-L1细胞连续培养4d,MTT法检测其促增殖能力。结果融合蛋白以水溶性形式分泌于大肠杆菌BL-21胞浆中。酶切后的目的蛋白经质谱证实其与BTCe蛋白氨基酸序列相符;作用于3T3-L1细胞可明显促进其增殖。结论大鼠BTCe蛋白在pGEX-4T-2原核表达载体可获得高效表达,所纯化蛋白具有促进3T3-L1细胞体外增殖的作用。     

大鼠BTCe蛋白原核表达及功能鉴定

目的 原核表达获得大量具有生物活性的大鼠BTCe蛋白.方法 RT-PCR法从大鼠肾脏中扩增出150 bp BTCe片段,插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建质粒pGEX-BTCe.转化BL-21菌,IPTG低温诱导表达融合蛋白,亲和层析法纯化获得融合蛋白,凝血酶酶切后获得目的蛋白,经SDS-PAGE、Western blot及质谱鉴定.以0.5 nmol/L BTCe作用于3T3-L1细胞连续培养4 d,MTT法检测其促增殖能力.结果 融合蛋白以水溶性形式分泌于大肠杆菌BL-21胞浆中.酶切后的目的蛋白经质谱证实其与BTCe蛋白氨基酸序列相符;作用于3T3-L1细胞可明显促进其增殖.结论 大鼠BTCe蛋白在pGEX-4T-2原核表达载体可获得高效表达,所纯化蛋白具有促进3T3-L1细胞体外增殖的作用.